木薯再生体系的建立方法

文档序号:197834 发布日期:2021-11-05 浏览:32次 >En<

阅读说明:本技术 木薯再生体系的建立方法 (Method for establishing cassava regeneration system ) 是由 牛俊乐 黄斌政 黄斌 麦馨允 杨郑州 朱正杰 于 2021-09-01 设计创作,主要内容包括:本发明公开了木薯再生体系的建立方法,包括:步骤一、获取木薯带腋芽茎段,利用第一培养基和第二培养基进行初代培养和继代增殖培养,至长出无菌叶片,所述第一培养基包括MS培养基和6-BA,所述第二培养基包括6-BA和NAA;步骤二、取步骤一得到的无菌叶片,利用第三培养基进行愈伤组织培养,所述第三培养基包括MS培养基、Picloram和CuSO-(4);步骤三、取步骤二得到的愈伤组织,利用第四培养基诱导分化出芽,所述第四培养基包括MS培养基、6-BA和AgNO-(3)。本发明能够为木薯品种改良过程中目的基因的导入奠定理论及技术基础。(The invention discloses a method for establishing a cassava regeneration system, which comprises the following steps: the method comprises the following steps of firstly, obtaining a cassava stem section with axillary buds, and carrying out primary culture and secondary multiplication culture by utilizing a first culture medium and a second culture medium until sterile leaves grow out, wherein the first culture medium comprises an MS culture medium and 6-BA, and the second culture medium comprises 6-BA and NAA; step two, taking the sterile leaves obtained in the step one, and performing callus culture by using a third culture medium, wherein the third culture medium comprises an MS culture medium, Picloram and CuSO 4 (ii) a Step three, taking the callus obtained in the step two, and inducing differentiation and sprouting by utilizing a fourth culture medium, wherein the fourth culture medium comprises an MS culture medium, 6-BA and AgNO 3 . The invention can lay a theorem and technical foundation for the introduction of the target gene in the cassava variety improvement process.)

木薯再生体系的建立方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术。更具体地说,本发明涉及一种木薯再生体系的建立方法。

背景技术

木薯以其耐性强、产量高等优点在世界范围内广泛种植,特别是在许多热带地区,木薯是当地居民主要的粮食来源。木薯对土壤和肥料的要求都不高,限制木薯生产的主要是逆境和病虫危害。选育出一些抗性好的新型木薯品种是解决这些问题的理想方法,但是由于木薯种质资源的贫乏性、遗传背景的复杂性、花粉育性低、花期不易调控及目标组合不易配对等原因使得传统育种方法在木薯品种选育过程难以实施。因此,建立木薯再生体系,实现相关基因的导入的基础,才有可能达到育种目标。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种木薯再生体系的建立方法,能够为木薯品种改良过程中目的基因的导入奠定理论及技术基础。

为了实现本发明的这些目的和其它优点,根据本发明的一个方面,本发明提供了木薯再生体系的建立方法,包括:步骤一、获取木薯带腋芽茎段,利用第一培养基和第二培养基进行初代培养和继代增殖培养,至长出无菌叶片,所述第一培养基包括MS培养基和6-BA,所述第二培养基包括6-BA和NAA;步骤二、取步骤一得到的无菌叶片,利用第三培养基进行愈伤组织培养,所述第三培养基包括MS培养基、Picloram和CuSO4;步骤三、取步骤二得到的愈伤组织,利用第四培养基诱导分化出芽,所述第四培养基包括MS培养基、6-BA和AgNO3

进一步地,还包括:在进行初代培养之前,对带腋芽茎段进行灭菌步骤,所述灭菌步骤包括依次利用浓度为75%的酒精和浓度为0.1%的HgCl2处理。

进一步地,所述第一培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L,所述第二培养基中6-BA和NAA的浓度分别为0.5mg/L和0.05mg/L。

进一步地,所述步骤二中,暗培养7天后,进行光照培养40天,所述第三培养基中Picloram和CuSO4的浓度分别为11.0mg/L和0.2mg/L。

进一步地,所述步骤三中,暗培养5天后,进行光照培养40天,所述第四培养基中6-BA和AgNO3的浓度分别为0.1mg/L和5.0mg/L。

进一步地,所述第四培养基还包括活性炭和椰子汁;所述活性炭的制备方法包括:取椰子壳,切碎,用氢氧化钠溶液浸泡,过滤,用水清洗,置入马弗炉中进行碳化,冷却后用乙醇浸泡,加入氧化锌,用超声波辐照,过滤,干燥,即得所述活性炭。

进一步地,在步骤一、步骤二、步骤三、步骤四中,温度保持在25~28℃,光照培养的条件包括光照时间12~14h/d以及光照强度为1500~2000lx。

进一步地,所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基、所述第四培养基的pH为5.3~6.3。

本发明至少包括以下有益效果:

本发明将带腋芽茎段利用第一培养基和第二培养基培养得到无菌叶片,然后利用第三培养基和第四培养基进行愈伤组织培养,愈伤组织的诱导率能够达到100%,愈伤组织的芽分化率能够达到35%以上。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1:

木薯再生体系的建立方法,包括:步骤一、获取木薯带腋芽茎段,利用第一培养基和第二培养基进行初代培养和继代增殖培养,至长出无菌叶片,所述第一培养基包括MS培养基和6-BA,所述第二培养基包括6-BA和NAA;步骤二、取步骤一得到的无菌叶片,切成边长为3~5毫米的小块,利用第三培养基进行愈伤组织培养,所述第三培养基包括MS培养基、Picloram和CuSO4;步骤三、取步骤二得到的愈伤组织,利用第四培养基诱导分化出芽,所述第四培养基包括MS培养基、6-BA和AgNO3

在进行初代培养之前,对带腋芽茎段进行灭菌步骤,所述灭菌步骤包括依次利用浓度为75%的酒精和浓度为0.1%的HgCl2处理30秒和5min。所述第一培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L,所述第二培养基中6-BA和NAA的浓度分别为0.5mg/L和0.05mg/L。所述步骤二中,暗培养7天后,进行光照培养40天,所述第三培养基中Picloram和CuSO4的浓度分别为11.0mg/L和0.2mg/L。所述步骤三中,暗培养5天后,进行光照培养40天,所述第四培养基中6-BA和AgNO3的浓度分别为0.1mg/L和5.0mg/L。所述第四培养基还包括活性炭和椰子汁,活性炭的用量为第四培养基质量的0.3%,椰子汁与第四培养基的体积比1:120;所述活性炭的制备方法包括:取椰子壳,切碎,用氢氧化钠溶液浸泡,过滤,用水清洗,置入马弗炉中进行碳化,碳化温度为250~300℃,冷却后用乙醇浸泡,加入氧化锌,用超声波辐照,过滤,干燥,即得所述活性炭,氧化锌占活性炭总质量的10%。在步骤一、步骤二、步骤三、步骤四中,温度保持在26℃,光照培养的条件包括光照时间12h/d以及光照强度为1800lx。所述第一培养基、所述第二培养基、所述第三培养基、所述第四培养基的pH为5.8。

对比例1:

将Picloram替换为CTK和NAA,其余参数与实施例1中的完全相同,工艺过程也完全相同。

对比例2:

将活性炭替换为市售活性炭,其余参数与实施例1中的完全相同,工艺过程也完全相同。

试验:

分别利用实施例1、对比例1和对比例2的方法对木薯带腋芽茎段进行处理,每个实施例或对比例至少试验30组。统计愈伤组织诱导率和愈伤组织分化率,统计结果分别见表1和表2。愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的小块/小块总数量×100%,愈伤组织分化率=分化的愈伤组织/愈伤组织总数量×100%。

表1愈伤组织诱导结果

表2愈伤组织分化结果

愈伤组织数量 分化的愈伤组织数量 愈伤组织分化率
实施例1 35块 13块 37%
对比例1 32块 0块 0%
对比例2 31块 6块 19%

由表1和表2可以看出,本申请的愈伤组织诱导率可以达到100%,愈伤组织分化率可达到37%,可能为木薯品种改良过程奠定基础,例如在目的基因转入木薯细胞中,再进行后续组织培养。将Picloram替换为CTK和NAA不会对愈伤组织诱导率产生较大影响,但是其产生的愈伤组织几乎不会分化,用市售活性炭替换本申请的活性炭后,愈伤组织分化率降幅较大,可能本申请的活性炭能够为愈伤组织提供更佳的分化条件。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明木薯再生体系的建立方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

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