具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明提供一种甘蔗茎尖培养的改良方法，包括以下步骤：

选取甘蔗尾梢的茎尖为外植体，在40-45℃热激处理之后，接种改良MS培养基中，培养至长出新的侧芽；

其中，培养期间，自接种第5天开始每天进行冷刺激1-3次，持续10-18天；所述改良MS培养基包括以下组分：MS+0.05-0.15mg/L噻苯隆+0.1-0.25mg/L 6-BA+蔗糖20-30g/L。

上述方案中，选用生长期为4-6个月，生长健康、健壮无病虫害的甘蔗尾梢的茎尖作为外植体，相比传统的使用腋芽作为外植体，需要将甘蔗蔗茎砍成单芽，并在沙床上培养15天，才能采下作为外植体，本发明可以更方便获取外植体材料，并且可节省大量时间。

将所选的茎尖在40-45℃热激处理，可以刺激茎尖保证其内代谢物质的活性，并且提高离体后的耐逆境能力，有助于茎尖维持较高细胞分裂能力。基于离体的甘蔗茎尖，细胞分化和代谢能力由于环境的变化都受到影响，因此，通过对MS培养基的优化，在MS培养基中添加噻苯隆和6-BA，提供可促进细胞分裂的外源植物激素，协助离体茎尖对离体环境的快速适应，经过大量的试验发现，在开始培养的前4天，细胞分裂相对离体前有降低的趋势，而在第5天开始快速分裂，而不同时期细胞分裂对于外源激素和环境温度的要求是有所差异的，所以为了避免外源生长激素以及环境温度(一直是在25℃温室中进行培养)对于细胞分裂的影响，通过采用冷刺激的方式，间歇性的对甘蔗茎尖瞬时冷刺激，可以有效的防止茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长，久而久之茎尖也成愈伤组织而未分化成芽，从而不利于快速发育成苗，另外，冷热交替、温差变化更利于茎尖适应自然环境，利于成活率的提高。

一个优选方案，热激处理之前，先剥去尾梢外层叶鞘，露出生长点，并切取生长点下2-3mm的叶原基，然后用75％酒精浸泡25-30s，再用清水冲洗3-5次。

上述方案中，热处理之前，取出叶原基(茎尖生长锥的侧面)用酒精浸泡可以消毒杀菌，再用清水冲洗，去除表面的残留酒精，以及对由于切割产生酚类初步去除。

一个优选方案，所述甘蔗茎尖再40-45℃热激2-3min。

在上述方案中，温水热激短时间处理，利于细胞中代谢物质的活性维持，以及耐逆境能力的提高；同时由于长期的无性繁殖还会导致植物体内积累大量的病毒，热激处理还有利于脱毒。

一个优选方案，培养期间冷刺激的方式具体为：自接种第5天开始每天冷刺激3次，之后每间隔5天每天冷刺激次数减少1次，直至减少到每天冷刺激1次，并持续5天。

上述方案中，通过组培方式培养茎尖，在起初由于环境变化，细胞分裂能力相对于茎尖离体前有下降趋势，但是随着对培养环境的适应，很快恢复细胞分裂能力，并且分裂速度极快，而随着培养进行细胞分裂速度逐渐变低，直至形成新的侧芽，为了避免细胞分裂期尤其是高速分裂期间，在茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长，久而久之茎尖也成愈伤组织而未分化成芽，从而不利于快速发育成苗，采用冷刺激方式，对其进行控制，以使茎尖快速分化成芽。

一个优选方案，每天冷刺激的时间为：每天的5点和/或9点和/或21点；

冷刺激温度为0-4℃，每次冷刺激持续20-30s。

上述方案中，经过大量的试验验证，发现一天中不同时间细胞分裂的速度是不同的，而在每天的5点、9点和21点是细胞分裂的高速期，并且由高到低依次为：9点、5点、21点，所以为了有效控制细胞分裂促使茎尖分化形成侧芽，每天优选在上述的时间进行冷刺激；并且每次冷刺激的时间不能超过30s，由于茎尖本身较小，时间多长可能导致休眠，过短又起不到刺激效果。

一个优选方案，还包括培养所述甘蔗茎尖的专用培养装置；

其中，所述专用培养装置包括：培养瓶1和悬置于所述培养瓶1的茎尖承载装置2；

所述培养瓶1为具有开口的柱形瓶体；

所述茎尖承载装置2包括第一承载部4、第二承载部5以及钩体6，所述第一承载部4和所述第二承载部5均为一端开口的网状筒体结构，所述第一承载部4的开口外侧设置外螺纹，所述第二承载部5的开口内侧设置内螺纹，所述第一承载部4和所述第二承载部5通过所述内螺纹和所述外螺纹可拆卸连接；所述第一承接部未开口端与所述钩体6的一端固定连接，所述钩体6的另一端悬挂在所述培养瓶的开口3处。

在上述方案中，茎尖承载装置悬置于培养瓶中，便于置入和取出。第一承载部和第二承载部设置成网状筒体结构(为了不影响高温灭菌效果，茎尖承载装置的材料必须耐高温，如树脂、金属材料)，可以在培养茎尖的过程中，使得培养瓶中的改良MS培养基进入其内部，为放置在第一承载部上的茎尖提供营养，而将两者通过螺纹连接是为方便拆卸清洗，而在第一承载部未开口端固定设置钩体，优选将钩体的一端固定在第一承载部未开口端(即顶面)的一侧，方便通过钩体将茎尖承载装置悬挂在培养瓶中，并且通过钩体置入或者取出茎尖承载装置。

一个优选方案，利用所述专用培养装置培养所述甘蔗茎尖的方法包括以下步骤：

将改良MS培养基装入所述培养瓶1中，同时在所述第二承载部5内装入柑橘果肉9，且所述柑橘果肉9底部和顶部分别铺设滤纸8，再将所述第一承载部4与所述第二承载部5通过螺纹旋拧固定，然后将经过热激处理的茎尖放置于所述第一承载部顶面7外壁，并通过所述钩体6将放置有茎尖的茎尖承载装置2悬挂于所述培养瓶1中，密封培养直至长出新的侧芽；当所述钩体6悬挂于所述培养瓶1时，所述改良MS培养基的添加量以不淹没所述第一承载部4上的茎尖为准。

上述方案中，在第二承载部装入柑橘果肉(优选切割成块状的柑橘果肉)，并在柑橘果肉的上下铺设滤纸，一方面滤纸可以吸附切割茎尖产生的酚类，另一方面柑橘果肉中含有丰富的营养物质，可为茎尖培养提供营养元素，同时柑橘果肉中还含有大量的酯类物质如乙酸癸酯，可以吸附多种酚类物质，可以通过物理和化学结合方式吸附酚类物质，有效避免对茎尖的损害。而将经过热激处理的茎尖放置在第一承载部顶面外壁上，由于整个茎尖承载装置是浸泡在改良MS培养基中，这种放置方式可以防止直接将滤纸放置在培养基中游动不稳，还可能影响不同茎尖的生长以及实验过程中的观察。另外，这种旋拧的方式，还利于培养结束后，直接通过钩体取出第一承载部和第二承载部，将里面的滤纸以及柑橘果肉取出后进行清洗，进行重复利用。第一承载部和第二承载部的设置还利于将茎尖放置其上通过钩体将茎尖放置于培养瓶中进行培养，方便操作。当所述钩体悬挂于所述培养瓶时，所述改良MS培养基的添加量以不淹没所述第一承载部上的茎尖为准，可以为第一承载部上的茎尖提供营养环境的同时，还避免由于培养基过多茎尖直接漂浮在培养基中，不利于控制茎尖在液体培养基中的位置，游动可能导致不同茎尖之间的生长受到影响。此外，第一承载部和第二承载部内装有可吸附酚类的柑橘果肉和滤纸，由于茎尖是放置在第一承载部上，并且培养基是没过第一承载部顶面但不淹没茎尖，所以通过柑橘果肉中游离出的乙酸癸酯吸附茎尖切口处产生的酚类物质，而滤纸也能吸附部分酚类物质，通过双重吸附可以减少酚类物质对茎尖生长的毒害作用。

具体试验时：先将培养基放入培养瓶中，将装有柑橘果肉和滤纸的茎尖承载装置的悬挂在培养瓶，以培养基刚浸没第一承载部的顶面为准，密封培养瓶(可以选用实验室常规的封口膜密封；也可以设置一个和培养瓶瓶口相适配的盖体，盖体开口通过设置的内螺纹和培养瓶开口外侧设置的外螺纹相匹配，以使盖体和培养瓶可拆卸的螺接)，在121℃下高温灭菌20-30min，灭菌完成后，待培养基冷却至室温，打开封口膜，将准备好的外植体茎尖在无菌环境下放置在第一承载装置上，可以采用无菌操作取出钩体直接在第一承载部放置茎尖，也可以采用无菌的镊子等可以夹取茎尖的装置将直接放置到培养瓶中的第一承载部上，放置好茎尖后，用封口膜再次密封培养瓶，将培养瓶在适宜条件下进行培养。

一个优选方案，所述第一承载部4与所述第二承载部5通过螺纹旋拧固定时，所述滤纸8贴附于所述第一承载部顶面7内壁。

上述方案中，在最开始将茎尖承载部放置于培养瓶时，要将第一承载部和第二承载部旋拧固定，一方面通过旋拧操作，可以对切成块状的柑橘果肉进行挤压，利于其内部活性成分的溢出，另一方面旋拧后滤纸贴附于第一承载部顶面内壁，利于茎尖直接接触滤纸对酚类进行吸附。

一个优选方案，还包括：培养期间进行冷刺激，将所述专用培养装置置于0-4℃无菌环境中进行短暂的间断性的冷刺激。

上述方案中，在进行冷刺激时，将专用培养装置直接放置在低温环境中，有利于茎尖细胞接受冷刺激。并且由于细胞分裂不是每个时间段都是处于高速分裂的阶段，经过相关研究一天当5点、9点、21点是分裂的高速时段，所以在上述的三个时间点进行间断性的冷刺激，可以使得茎尖接受不同环境的驯化，更利于茎尖的分化和后期成苗后对于环境变化的适应性。

一个优选方案，所述钩体6为L型钩子或S型钩子。

上述方案中，钩体设置成L型钩子或S型钩子，主要是便于直接悬挂在培养瓶瓶口，方便携带茎尖的承载装置的放入和取出。

实施例1一种甘蔗茎尖培养的改良方法

(1)生长期为4个月，生长健康、健壮无病虫害的甘蔗尾梢的茎尖(具体选择切取生长点下2mm的叶原基)作为外植体，用75％酒精浸泡25s，再用清水冲洗3次。处理后的茎尖，在40℃温水中热激处理2min。

(2)将改良的MS培养基装入培养瓶中，并在第二承载部内装入块状柑橘果肉，且柑橘果肉底部和顶部分别铺设滤纸，再将第一承载部与第二承载部通过螺纹旋拧固定，然后将上述热激处理的茎尖放置于第一承载部顶面外壁，并通过钩体将茎尖承载装置悬挂于培养瓶中，密封，25℃光照培养至长出新的侧芽；

其中，茎尖承载装置悬挂于培养瓶时，以改良MS培养基液面高于第一承载部顶面但不淹没茎尖为准；

培养期间，自接种第5天开始每天冷刺激3次(分别在每天的5点、9点和21点，于0℃，每次冷刺激持续20s)，之后每间隔5天每天冷刺激次数减少1次(分别在每天的5点、9点，于0℃，每次冷刺激持续20s)，直至减少到每天冷刺激1次(每天5点，于0℃，每次冷刺激持续20s)，并持续5天。

改良MS培养基包括以下组分：MS+0.05mg/L噻苯隆+0.1mg/L 6-BA+蔗糖20g/L。

实施例2一种甘蔗茎尖培养的改良方法

(1)生长期为5个月，生长健康、健壮无病虫害的甘蔗尾梢的茎尖(具体选择切取生长点下2.5mm的叶原基)作为外植体，用75％酒精浸泡28s，再用清水冲洗4次。处理后的茎尖，在42℃热激处理2.5min。

(2)将改良的MS培养基装入培养瓶中，并在第二承载部内装入块状柑橘果肉，且柑橘果肉底部和顶部分别铺设滤纸，再将第一承载部与第二承载部通过螺纹旋拧固定，然后将上述热激处理的茎尖放置于第一承载部顶面外壁，并通过钩体将茎尖承载装置悬挂于培养瓶中，密封，25℃光照培养至长出新的侧芽；

其中，茎尖承载装置悬挂于培养瓶时，以改良MS培养基液面高于第一承载部顶面但不淹没茎尖为准；

培养期间，自接种第5天开始每天冷刺激3次(分别在每天的5点、9点和21点，于2℃，每次冷刺激持续25s)，之后每间隔5天每天冷刺激次数减少1次(分别在每天的9点、21点，于2℃，每次冷刺激持续25s)，直至减少到每天冷刺激1次(每天9点，于2℃，每次冷刺激持续25s)，并持续5天。

改良MS培养基包括以下组分：MS+0.1mg/L噻苯隆+0.18mg/L 6-BA+蔗糖25g/L。

实施例3一种甘蔗茎尖培养的改良方法

(1)生长期为6个月，生长健康、健壮无病虫害的甘蔗尾梢的茎尖(具体选择切取生长点下3mm的叶原基)作为外植体，用75％酒精浸泡30s，再用清水冲洗5次。处理后的茎尖，在45℃热激处理3min。

(2)将改良的MS培养基装入培养瓶中，并在第二承载部内装入块状柑橘果肉，且柑橘果肉底部和顶部分别铺设滤纸，再将第一承载部与第二承载部通过螺纹旋拧固定，然后将上述热激处理的茎尖放置于第一承载部顶面外壁，并通过钩体将茎尖承载装置悬挂于培养瓶中，密封，25℃光照培养至长出新的侧芽；

其中，茎尖承载装置悬挂于培养瓶时，以改良MS培养基液面高于第一承载部顶面但不淹没茎尖为准；

培养期间，自接种第5天开始每天冷刺激3次(分别在每天的5点、9点和21点，于4℃，每次冷刺激持续30s)，之后每间隔5天每天冷刺激次数减少1次(分别在每天的5点、21点，于4℃，每次冷刺激持续30s)，直至减少到每天冷刺激1次(每天21点，于4℃，每次冷刺激持续30s)，并持续5天。

改良MS培养基包括以下组分：MS+0.15mg/L噻苯隆+0.25mg/L 6-BA+蔗糖30g/L。

对比例1

与实施例2不同之处在于：选择蔗茎的腋芽为外植体，其他步骤均相同。

对比例2

与实施例2不同之处在于：茎尖不经过热激处理，其他步骤均相同。

对比例3

与实施例2不同之处在于：不进行冷刺激，其他步骤均相同。

对比例4

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天5点冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例5

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天9点冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例6

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天21点冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例7

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天5点和9点分别冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例8

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天5点和21点分别冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例9

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天9点和21点分别冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例10

与实施例2不同之处在于：从第5天开始冷刺激，每天5点、9点和21点分别冷刺激一次，持续18天，其他步骤均相同。

对比例11

与实施例2不同之处在于：培养基采用常规的MS培养基，其他步骤均相同。

对比例12

与实施例2不同之处在于：用常规的培养瓶培养，并且将滤纸(滤纸中间不加柑橘果肉)直接放置在培养基中，茎尖直接放置在滤纸上。其他步骤均相同。

对比例13

与实施例2不同之处在于：用常规的培养瓶培养，并且将滤纸(滤纸中间加柑橘果肉)放置在培养基中，茎尖直接放置在滤纸上。其他步骤均相同。

统计实施例1-3，以及对比例1-12的茎尖成活率和培养时间，结果如表1所示。

表1不同培养方式茎尖成活率和培养时间统计结果

从上述结果可见，热激处理、冷刺激(包括冷刺激的次数和时间)、培养基的选择以及培养装置的选择对茎尖的成活率产生了不同程度的影响，但是仅有上述培养条件和培养基同时优化，才可能实现大大提高甘蔗茎尖成活率，并缩短培养时间。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。