具体实施方式

本发明提供了一种限进介质-分子印迹聚合物的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)TiO₂纳米线的表面苄基化

将TiO₂纳米线分散于甲苯中搅拌，待搅拌结束后加入4-(氯甲基)苯基三氯硅烷继续搅拌，搅拌结束后加入三乙胺，在氮气保护下搅拌反应，待反应结束后抽滤，即得表面苄基化的TiO₂纳米线；

(2)TiO₂纳米线合成RAFT链转移试剂

在四氢呋喃中加入苯基溴化镁，搅拌均匀后加热，待加热结束后加入二硫化碳反应；反应结束后加入表面苄基化的TiO₂纳米线，搅拌反应，将反应后的产物洗涤、烘干，即得RAFT链转移试剂；

(3)限进介质-分子印迹聚合物的制备

将雌二醇和甲基丙烯酸溶于乙腈/甲苯中静置，静置结束后加入三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯和步骤(2)制备的RAFT 链转移试剂，在氮气保护下反应，反应结束后抽滤，洗涤并干燥，得到聚合产物，将聚合产物进行索氏提取，再洗涤干燥后研磨得到分子印迹聚合物；在分子印迹聚合物中加入高氯酸/水溶液后密封搅拌，待搅拌结束后，洗涤干燥得到基于RAFT法制备的限进介质-分子印迹聚合物。

优选的，步骤(1)中TiO₂纳米线、甲苯、4-(氯甲基)苯基三氯硅烷、三乙胺的重量体积比为1(g):15～20(ml):0.8～1.2(ml):0.4～0.6(ml)，进一步优选的，TiO₂纳米线、甲苯、4-(氯甲基)苯基三氯硅烷、三乙胺的重量体积比为1(g):17～18(ml):0.9～1.1(ml):0.45～0.55(ml)。

优选的，步骤(1)TiO₂纳米线分散于甲苯中搅拌的时间为25～35min；加入4-(氯甲基)苯基三氯硅烷后的搅拌时间为28～32min；加入三乙胺后，在氮气保护下的搅拌反应时间为18～30h。

优选的，步骤(2)中四氢呋喃、苯基溴化镁、二硫化碳、表面苄基化的TiO₂纳米线的体积重量比为6～10(ml):2～4(ml):4～6(ml):1(g)，进一步优选的，四氢呋喃、苯基溴化镁、二硫化碳、表面苄基化的TiO₂纳米线的体积重量比为7～9(ml):2.5～3(ml):5～5.5(ml):1(g)。

优选的，步骤(2)的加热温度为45～55℃，进一步优选的，加热温度为 47～52℃；加入二硫化碳后的反应时间为0.5～1.5h，进一步优选的，加入二硫化碳后的反应时间为0.8～1.2h；加入表面苄基化的TiO₂纳米线后的搅拌反应时间为5～7h，进一步优选的，加入表面苄基化的TiO₂纳米线后的搅拌反应时间为5.5～6.5h。

优选的，步骤(2)中的洗涤依次使用四氢呋喃洗涤2～3次，再用乙醇洗涤5～7次；所述干燥的温度为60～80℃。

优选的，步骤(3)中雌二醇、甲基丙烯酸、乙腈/甲苯、三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、RAFT链转移试剂的体积重量比为0.25～0.3(g):0.4～0.6(g):140～160(ml):6～7.5(g):0.1～0.2(g):0.1～0.3 (ml)：1.0～2.0(g)，进一步优选的，雌二醇、甲基丙烯酸、乙腈/甲苯、三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、RAFT链转移试剂的体积重量比为0.26～0.28(g):0.4.5～0.55(g):144～151(ml):6.5～7.1 (g):0.1.2～0.17(g):0.15～0.23(ml)：1.3～1.7(g)。

优选的，步骤(3)静置的温度为3～5℃，时间为30～42h；在氮气保护下的反应温度为65～75℃，反应时间为12～36h；索氏提取的时间为36～60h。

优选的，步骤(3)中乙腈/甲苯溶液中乙腈和甲苯的体积比为3:1。

优选的，步骤(3)中的第一次洗涤为：依次用甲醇/乙酸、水、甲醇各洗涤2～4次，洗涤结束后在65～75℃的条件下干燥；其中甲醇/乙酸溶液中甲醇和乙酸的体积比为9:1。

优选的，步骤(3)中索氏提取结束后，先用去离子水洗涤至中性，再用甲醇洗涤2～4次；再在65～75℃的条件下干燥。

优选的，步骤(3)中分子印迹聚合物和高氯酸/水溶液的重量体积比为 5(g)：90～110(ml)，搅拌时间为12～36h，然后依次用水、甲醇、正己烷各洗涤2～3次，再在65～75℃的条件下干燥。

本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的限进介质-分子印迹聚合物。

本发明还提供了该限进介质-分子印迹聚合物在检测奶粉中雌二醇残留量的应用。

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1

一种限进介质-分子印迹聚合物的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)TiO₂纳米线的表面苄基化

将TiO₂纳米线分散于甲苯中搅拌25min，待搅拌结束后加入4-(氯甲基) 苯基三氯硅烷继续搅拌28min，搅拌结束后加入三乙胺，在氮气保护下搅拌反应18h，待反应结束后抽滤，即得表面苄基化的TiO₂纳米线；

(2)TiO₂纳米线合成RAFT链转移试剂

在四氢呋喃中加入苯基溴化镁，搅拌均匀后加热至45℃，待加热结束后加入二硫化碳反应0.5h；反应结束后加入表面苄基化的TiO₂纳米线，搅拌反应5h，将反应后的产物使用四氢呋喃洗涤2次，再用乙醇洗涤7次，在 60℃条件下烘干，即得RAFT链转移试剂；

(3)限进介质-分子印迹聚合物的制备

将雌二醇和甲基丙烯酸溶于乙腈/甲苯中在温度为3℃条件下静置30h，静置结束后加入三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯和步骤(2)制备的RAFT链转移试剂，在65℃下氮气保护反应36h，反应结束后抽滤，依次用甲醇/乙酸、水、甲醇各洗涤2次并在65℃下干燥，得到聚合产物，将聚合产物进行索氏提取36h，再先用去离子水洗涤至中性，再用甲醇洗涤2次；再在65℃的条件下干燥后研磨得到分子印迹聚合物；

在分子印迹聚合物中按照分子印迹聚合物和高氯酸/水溶液的重量体积比为5(g)：90(ml)的比值加入高氯酸/水溶液后密封搅拌12h，待搅拌结束后，依次用水、甲醇、正己烷各洗涤2次，再在65℃的条件下干燥得到基于RAFT法制备的限进介质-分子印迹聚合物。

在本实施例步骤(1)中TiO₂纳米线、甲苯、4-(氯甲基)苯基三氯硅烷、三乙胺的重量体积比为1(g):15(ml):0.8(ml):0.4(ml)。

在本实施例步骤(2)中四氢呋喃、苯基溴化镁、二硫化碳、表面苄基化的TiO₂纳米线的体积重量比为6(ml):2(ml):4(ml):1(g)。

在本实施例步骤(3)中雌二醇、甲基丙烯酸、乙腈/甲苯、三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、RAFT链转移试剂的体积重量比为0.25(g):0.4(g):140(ml):6(g):0.1(g):0.1(ml)：1(g)。

实施例2

一种限进介质-分子印迹聚合物的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)TiO₂纳米线的表面苄基化

将TiO₂纳米线分散于甲苯中搅拌30min，待搅拌结束后加入4-(氯甲基) 苯基三氯硅烷继续搅拌30min，搅拌结束后加入三乙胺，在氮气保护下搅拌反应24h，待反应结束后抽滤，即得表面苄基化的TiO₂纳米线；

(2)TiO₂纳米线合成RAFT链转移试剂

在四氢呋喃中加入苯基溴化镁，搅拌均匀后加热至50℃，待加热结束后加入二硫化碳反应1h；反应结束后加入表面苄基化的TiO₂纳米线，搅拌反应6h，将反应后的产物使用四氢呋喃洗涤2次，再用乙醇洗涤6次，在70℃条件下烘干，即得RAFT链转移试剂；

(3)限进介质-分子印迹聚合物的制备

将雌二醇和甲基丙烯酸溶于乙腈/甲苯中在温度为4℃条件下静置36h，静置结束后加入三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯和步骤(2)制备的RAFT链转移试剂，在70℃下氮气保护反应24h，反应结束后抽滤，依次用甲醇/乙酸、水、甲醇各洗涤3次并在70℃下干燥，得到聚合产物，将聚合产物进行索氏提取48h，再先用去离子水洗涤至中性，再用甲醇洗涤3次；再在70℃的条件下干燥后研磨得到分子印迹聚合物；

在分子印迹聚合物中按照分子印迹聚合物和高氯酸/水溶液的重量体积比为5(g)：100(ml)的比值加入高氯酸/水溶液后密封搅拌24h，待搅拌结束后，依次用水、甲醇、正己烷各洗涤2次，再在70℃的条件下干燥得到基于RAFT法制备的限进介质-分子印迹聚合物。

在本实施例步骤(1)中TiO₂纳米线、甲苯、4-(氯甲基)苯基三氯硅烷、三乙胺的重量体积比为1(g):17(ml):1(ml):0.5(ml)。

在本实施例步骤(2)中四氢呋喃、苯基溴化镁、二硫化碳、表面苄基化的TiO₂纳米线的体积重量比为8(ml):3(ml):5(ml):1(g)。

在本实施例步骤(3)中雌二醇、甲基丙烯酸、乙腈/甲苯、三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、RAFT链转移试剂的体积重量比为0.27(g):0.5(g):150(ml):6.76(g):0.15(g):0.2(ml)：1.5 (g)。

实施例3

一种限进介质-分子印迹聚合物的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)TiO₂纳米线的表面苄基化

将TiO₂纳米线分散于甲苯中搅拌35min，待搅拌结束后加入4-(氯甲基) 苯基三氯硅烷继续搅拌32min，搅拌结束后加入三乙胺，在氮气保护下搅拌反应30h，待反应结束后抽滤，即得表面苄基化的TiO₂纳米线；

(2)TiO₂纳米线合成RAFT链转移试剂

在四氢呋喃中加入苯基溴化镁，搅拌均匀后加热至55℃，待加热结束后加入二硫化碳反应1.5h；反应结束后加入表面苄基化的TiO₂纳米线，搅拌反应7h，将反应后的产物使用四氢呋喃洗涤3次，再用乙醇洗涤7次，在 80℃条件下烘干，即得RAFT链转移试剂；

(3)限进介质-分子印迹聚合物的制备

将雌二醇和甲基丙烯酸溶于乙腈/甲苯中在温度为5℃条件下静置42h，静置结束后加入三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯和步骤(2)制备的RAFT链转移试剂，在75℃下氮气保护反应36h，反应结束后抽滤，依次用甲醇/乙酸、水、甲醇各洗涤4次并在75℃下干燥，得到聚合产物，将聚合产物进行索氏提取60h，再先用去离子水洗涤至中性，再用甲醇洗涤4次；再在75℃的条件下干燥后研磨得到分子印迹聚合物；

在分子印迹聚合物中按照分子印迹聚合物和高氯酸/水溶液的重量体积比为5(g)：110(ml)的比值加入高氯酸/水溶液后密封搅拌36h，待搅拌结束后，依次用水、甲醇、正己烷各洗涤3次，再在75℃的条件下干燥得到基于RAFT法制备的限进介质-分子印迹聚合物。

在本实施例步骤(1)中TiO₂纳米线、甲苯、4-(氯甲基)苯基三氯硅烷、三乙胺的重量体积比为1(g):20(ml):1.2(ml):0.6(ml)。

在本实施例步骤(2)中四氢呋喃、苯基溴化镁、二硫化碳、表面苄基化的TiO₂纳米线的体积重量比为10(ml):4(ml):6(ml):1(g)。

在本实施例步骤(3)中雌二醇、甲基丙烯酸、乙腈/甲苯、三羟甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸缩水甘油酯、RAFT链转移试剂的体积重量比为0.3(g):0.6(g):160(ml):7.5(g):0.2(g):0.3(ml)：2(g)。

经检测，本发明实施例1～3制备的限进介质-分子印迹聚合物均具有较窄的分子量分布，且结构均匀，现对实施例2制备的限进介质-分子印迹聚合物进行详细表征：

图3为本发明实施例2制备的限进介质-分子印迹聚合物红外光谱图，由图3可以看出，3478cm^-1为-OH的伸缩振动强吸收峰，2963cm^-1特征峰为-CH₃的反对称振动吸收峰，1733cm^-1为Ti-O的特征吸收峰，1149cm^-1为 C-O的伸缩振动吸收峰，符合基于纳米二氧化钛的限进介质分子印迹材料特征红外光谱。

图4为本发明实施例2制备的限进介质-分子印迹聚合物孔径分布图，由图4可以看出，材料主要孔径为40nm左右，该限进介质分子印迹材料属于介孔材料。

应用例

本发明选择添加回收的方法对方法学评估，在不含分析物本底的样品中奶粉分别添加不同浓度水平雌二醇标准溶液，根据雌二醇残留限量要求，分别添加不同浓度水平(1、5、10μg/kg)雌二醇，每个添加水平做4次平行实验。

取1gMIP于试管中，加入甲醇除去微小颗粒后，填入固相萃取空柱内，制备得到分子印迹固相萃取柱。称取0.5g奶粉于试管中，加10ml水涡旋溶解，转移到分子印迹固相萃取柱(已用5ml活化)上，用10ml水淋洗固相萃取柱，加入20ml乙腈洗脱，收集全部洗脱液浓缩至干，采用衍生试剂N- 甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)-三甲氧基碘硅烷(TMIS)-二硫赤藓糖醇(DTE)衍生化后，采用气相色谱质谱仪测定。按照上述检测方法，使用实施例1～3制备的MIP分别对应(1、5、10μg/kg)浓度水平下的雌二醇，对奶粉中的雌二醇进行检测，检测结果见表1。

其中，仪器测定条件：

1)色谱条件：

a)色谱柱：30m×0.25mm(内径)，膜厚0.25μm，Rxi-5ms石英毛细管柱，或相当者；

b)载气：氦气，纯度≥99.999％，流速1.5ml/min；

c)色谱柱温度：100℃保持1min，然后以20℃/min程序升温至280℃，保持5min。

d)进样口温度：240℃；

e)进样方式：无分流进样，0.75min后开阀；

f)进样量：1μL；

2)质谱条件：

a)电离方式：EI；

b)色谱-质谱接口温度：260℃；

c)离子源温度：230℃；

d)溶剂延迟：5min；

e)离子检测模式：选择离子反应监测(SIM)，监测离子及其丰度比416， 285，232。

表1实施例1～3制备的MIP对奶粉中的雌二醇测定结果

结果表明奶粉样品中添加雌二醇1～10μg/kg，回收率范围为87～104.9％，相对标准偏差为2.9～5.8％。

图5为实施例2得到的样品选择离子流图，横坐标为保留时间，纵坐标为响应值。其中m/z416为定量离子，m/z285，232为定性离子，目标物的保留时间为11.72min,其它时间的峰为杂质峰。由图5可以得出：无论是定量离子峰和定性离子峰都未受到杂质峰的干扰，不影响雌二醇的定量测定，说明此净化有较好的效果。

由以上实施例及应用例可知，本发明提供的限进介质-分子印迹聚合物分子量分布较窄、结构均匀的聚合物，材料的主要孔径为40nm左右，具有较好的的吸附性能，应用于奶粉中雌二醇测试时，该材料能有效的排除奶粉中大分子杂质的干扰，而对雌二醇具有特异性吸附，可准确检测奶粉中雌二醇残留量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。