具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、资料和实验方法

1.1研究对象

本研究回顾性分析了自2020年1月至5月的131例Sars-cov-2感染患者，依据国家卫生健康委员会“新冠肺炎防治议定书”(第6版)纳入了14例无症状患者，依据《新型冠状病毒诊断与治疗指南》纳入了12例轻型患者、34例普通型患者、 18例重/危重型患者，此外，依据该指南规定的康复出院标准，我们纳入了33 例康复型患者。20例健康对照样本来自广州中医药大学顺德医院。样本均采集于疾病早期，康复组患者样本采集时间在出院前三天至出院20天内。

1.2抗体阵列Q440

COVID19 Cytokines采用瑞博奥QAH-CAA-440蛋白芯片，测量了131份血清标本中生物标志物的水平，分析观察样本中COVID19不同分型患者血清细胞因子水平。

具体地，使用可定量检测440种的人类血清蛋白的细胞因子阵列 Q440(QAH-CAA-440，RayBiotech，Inc，Peachtree Corners，GA，USA)进行蛋白质筛选。抗体阵列操作严格按照厂家说明书进行。简而言之，将阵列在室温下干燥2小时，然后在每孔中加入100μl的2倍稀释的样品稀释剂进行封堵，30分钟后吸出样品稀释剂。每孔中加入100μl 2倍稀释血清样品，4℃孵育过夜。用洗涤缓冲液I洗涤玻片5次，每次5min，然后用洗涤缓冲液II洗涤3次，每次5min。吸干洗涤缓冲液，每孔加入80ul生物素偶联抗体混合物，室温孵育2小时。清洗阵列后，每孔加入80ul AlexaFluor 555-偶联链霉亲和素，室温避光孵育1小时。最后，使用InnoScan310扫描仪(Innopsys，Carbonne，法国)扫描并提取信号。

1.3统计分析

通过分析研究中不同来源的变异对总变异的贡献大小，从而确定可控因素对研究结果影响力的大小。差异表达蛋白(DEP)定义为p值(P.val)小于0.05， foldchange大于1.2或小于0.83(absolutelogFC>0.263)。使用R软件(版本3.6.3) 分析所有统计数据。

主成分分析和层次聚类分析是基于蛋白质表达模式的差异来分析不同组样本和蛋白质之间的差异。GO分析和KEGG富集分析确定了蛋白功能和信号通路的显著富集，p值<0.05。使用R软件(版本3.6.3)分析PCA(R包“ggbilot”)、分级聚类分析(R包“gplots”)、KEGG富集分析(R包“clusterProfiler”)和GO富集分析(R 包“org.hs.e.db”和“clusterProfiler”)。利用R软件包“pROC”构建ROC曲线，评价蛋白对COVID-19不同时期、不同症状的诊断价值。

2、实验结果

统计数据如表1所示

表1

2.1组间进行两两差异比较，差异表达蛋白(DEPs)定义为p-value(P.Val)小于0.05、foldchange大于1.2或小于0.83(absolutelogFC>0.263)。本实验筛选出健康对照组与重型组间差异蛋白160个；无症状组与重型组间差异蛋白56个；轻型组与重型组间的差异蛋白有107个；普通组与重型组间差异蛋白有60个；康复组与重型组间的差异蛋白有88个。

将筛选出的重型组分别与健康组、无症状组、轻型组、普通型组间的差异蛋白制作韦恩图，得到8个重叠细胞因子，包括：Eotaxin-2、IP-10、IL-18Rb、IL-18、 OPN、IL-2Rb、GDF-15、IL-12p40。见图1。

同时得到71个健康对照与重型组间独有的细胞因子，15个无症状组与重型组间独有的细胞因子，41个轻型组与重型组间独有的细胞因子，8个普通型与重型组间独有的细胞因子，28个康复组与重型组间独有的细胞因子。

2.2利用重叠的8个蛋白的表达量制作趋势图，以观察细胞因子在疾病不同严重程度下的表达情况，见图2。

2.3用R软件包“clusterProfiler”对蛋白质功能进行GO和KEGG分析。KEGG 分析显示差异因子主要富集于“细胞因子及其受体相互作用”、“Toll样受体信号通路”、“病毒蛋白与细胞因子及其受体相互作用”等通路，见图3。GO分析显示，差异因子主要参与“T细胞及NK介导的免疫反应”等生物学过程(图4)，发挥调节“细胞因子及其受体活性与结合”等功能(图5)。细胞因子功能见表2。

表2

2.4使用R软件包“pROC”构建ROC曲线并计算ROC曲线下面积(AUC)。对于重型和非重型患者，GDF-15(AUC＝0.887)，IP-10(AUC＝0.858)， OPN(AUC＝0.858)，Eotaxin-2(AUC＝0.798)，IL-18(AUC＝0.792)， IL-12p40(AUC＝0.728)具有较好的诊断效能，见图6。

实施例2

基于上述结果，本发明提供了一种用于诊别新型冠状病毒肺炎重症与疗效评价的细胞因子标志物组合，选自如下细胞因子中的一种或几种组合：包括： Eotaxin-2、IP-10、IL-18Rb、IL-18、OPN、IL-2Rb、GDF-15、IL-12p40。

同时还提供了一系列区分新型冠状病毒肺炎重症与非重症以及疗效评价的细胞因子标志物组合，所述非重症包括健康、无症状、轻型、普通型、康复，具体包括如下：

(1)用于区分新型冠状病毒肺炎重症与健康以及疗效评价的细胞因子标志物组合选自如下细胞因子中的一种或几种组合：

(2)用于区分新型冠状病毒肺炎重症与无症状以及疗效评价的细胞因子标志物组合选自如下细胞因子中的一种或几种组合：

(3)用于区分新型冠状病毒肺炎重症与轻型以及疗效评价的细胞因子标志物组合选自如下细胞因子中的一种或几种组合：

(4)用于区分新型冠状病毒肺炎重症与普通组型以及疗效评价的细胞因子标志物组合选自如下细胞因子中的一种或几种组合：

(5)用于区分新型冠状病毒肺炎重症与康复以及疗效评价的细胞因子标志物组合选自如下细胞因子中的一种或几种组合：

更重要的，基于上述结果，本发明提供了一种新型冠状病毒肺炎重症区分与疗效评价系统，包括预设值模块、数据收集模块，数据存储模块，数据处理模块，结果显示模块；

(1)所述预设值模块包括重症与非重症对应的上述细胞因子标志物的浓度值：

(2)所述的数据收集模块包括数据监测模块和/或数据录入模块，用于采集和/或录入上述细胞因子标志物的浓度值；

(3)所述的数据存储模块用于存储所述数据收集模块的信息；

(4)所述的数据处理模块用于比较预设值模块与数据收集模块的信息；

(5)所述的数据显示模块用于显示数据处理模块的结果。

步骤(5)的结果显示依据为：

所述细胞因子标志物的浓度值对应重症与非重症的判断标准如下：

进一步地，所述系统还可包括通讯设备关联装置或接口，所述的通讯设备关联装置或接口用于连接计算机、手机、存储云端或其它移动设备；

所述的数据收集模块还可与无创医疗检测设备相连，所述无创医疗检测设备包括细胞因子浓度测试仪。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。