一种酶集成稀土配位聚合物的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种酶集成稀土配位聚合物的制备方法及应用 (Preparation method and application of enzyme-integrated rare earth coordination polymer ) 是由 谭宏亮 翁宇豪 朱巧玉 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及荧光探针的制备及应用领域,具体涉及一种酶集成稀土配位聚合物的制备方法及应用。本发明将酶与具有荧光特性的稀土配位聚合物结合,构建了集成酶的稀土配位聚合物荧光探针,并应用于超氧阴离子的时间分辨荧光检测,解决了现有荧光探针在实际检测中不溶于水、光稳定性差、背景干扰严重的问题。稀土配位聚合物可以保护酶结构免遭环境因素的破坏,极大提高酶的催化活性和稳定性。在超氧阴离子检测过程中,酶能够特异性识别超氧阴离子,并通过分子内电荷转移过程猝灭稀土配位聚合物的荧光。稀土荧光长的荧光寿命可以消除背景荧光的干扰,进而实现时间分辨荧光检测。本发明的方法具有操作简便、成本低和效率高等优点。(The invention relates to the field of preparation and application of fluorescent probes, in particular to a preparation method and application of an enzyme-integrated rare earth coordination polymer. The invention combines enzyme and rare earth coordination polymer with fluorescence characteristic, constructs the rare earth coordination polymer fluorescent probe integrated with enzyme, is applied to time-resolved fluorescence detection of superoxide anion, and solves the problems of water insolubility, poor light stability and serious background interference of the existing fluorescent probe in actual detection. The rare earth coordination polymer can protect an enzyme structure from being damaged by environmental factors, and the catalytic activity and the stability of the enzyme are greatly improved. In the superoxide anion detection process, the enzyme can specifically recognize superoxide anions and quench fluorescence of the rare earth coordination polymer through an intramolecular charge transfer process. The long fluorescence lifetime of rare earth fluorescence can eliminate the interference of background fluorescence, thereby realizing time-resolved fluorescence detection. The method has the advantages of simple and convenient operation, low cost, high efficiency and the like.)
技术领域
本发明涉及荧光探针的制备及应用领域，具体涉及稀土配位聚合物与酶结合形成复合物探针的方法。
背景技术
超氧阴离子(O2 ·-)是活性氧(ROS)的一种，在细胞生长和代谢过程中发挥着重要作用。然而，O2 ·-的过度表达会引起生物体的氧化应激，导致严重的疾病，如类风湿性关节炎、心血管疾病和癌症。因此，对O2 ·-的高灵敏和选择性检测对于评估其在生理和病理过程中的作用具有十分重要的意义。目前，已建立了多种O2 ·-检测的技术，如电子自旋共振、电化学、化学发光和荧光。其中，荧光分析法因具有简单、灵敏度高、易操作等优势而常被认为是一种理想的分析方法。虽然当前已有O2 ·-荧光探针报道，但它们大多是基于氢乙啶、硝基苯、咖啡酸和萘酰亚胺等构建的复杂有机分子。这些荧光探针的制备需要经过费时费力的多步合成和表面修饰过程。并且，它们中还存在水溶性差、光稳定性不高、背景干扰严重等不足。因此，急需构建一种制备简单、发光性能稳定、灵敏度高的O2 ·-荧光探针。
酶因具有超高的转换数和独特的底物选择性的催化优势，而被广泛应用于食品加工、废水处理和制药工业等领域。然而，天然酶的催化活性极易受到外界环境(如pH值、温度和有机溶剂)的影响。近年来，配位聚合物被认为是固定化酶的理想载体。与多孔二氧化硅和水凝胶等传统固体载体不同，配位聚合物是由金属离子和有机桥配体组成的杂化材料，具有可调的结构和性能。此外，作为酶固定化载体，配位聚合物不仅具有优异的力学和热稳定性，而且通过疏水和/或配位相互作用可以增强对酶的亲和力，得到较高的酶负载率和可忽略的酶泄漏。更吸引人的是，由于配位聚合物的自适应封装特性，酶在配位聚合物中可以很好地保持原有构象。因此，在配位聚合物的限域环境中，酶的催化活性和稳定性都可以得到显著提高。虽然如此，目前的研究大多集中在使用配位聚合物作为载体来提高酶的催化性能，而利用酶集成配位聚合物作为纳米探针的研究仍处于初级阶段。
发明内容
针对传统的超氧阴离子检测方法中，荧光探针制备繁琐、背景干扰严重、灵敏度低、选择性差等技术现状，本发明制备了一种酶集成的稀土配位聚合物，能够结合时间分辨荧光技术检测超氧阴离子。
本发明采用的技术方案为：
一种酶集成稀土配位聚合物的制备方法，将酶与具有荧光特性的稀土配位聚合物结合，具体包括以下步骤：
(1)将金属盐水溶液与20μg/mL～25μg/mL的超氧化物岐化酶(SOD)预搅拌30min～60min后；
(2)加入配体三磷酸腺苷(ATP)的水溶液，反应3h～5h后，分离得到固态产物；
(3)将步骤(2)中分离得到的固态产物与400μL浓度为200mM的羧基苯硼酸(CPBA)混合反应12h～24h后，分离得到的最终固态产物，即为所述的酶集成稀土配位聚合物。
优选的，所述步骤(1)中的金属盐是硝酸铽(Tb(NO3)3)。
优选的，所述的金属盐与配体的摩尔比为8:3。
优选的，所述步骤(1)中的搅拌时间为30min，所述步骤(2)中的反应时间为3h，所述步骤(3)中的反应时间为12h。
优选的，所述步骤(2)中通过离心分离得到固态产物，离心条件为13000rpm、10min。
优选的，所述酶集成稀土配位聚合物的制备方法还包括洗涤步骤，在步骤(3)中先用水洗涤固态产物3次，再与羧基苯硼酸混合反应。
本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到酶集成稀土配位聚合物。
本发明还包括上述酶集成稀土配位聚合物在时间分辨荧光检测超氧阴离子中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的制备方法不含有毒元素、条件温和，稀土配位聚合物能保护酶免受外界环境的影响，能有效提高酶的催化活性和稳定性。
(2)通过本发明的制备方法制备得到的酶集成的稀土配位聚合物能够用于超氧阴离子的时间分辨荧光检测。在超越阴离子检测过程中，具有超氧化物岐化酶可以特异性的识别超氧阴离子起到转导的作用，提高检测灵敏度和选择性。此外，稀土配位聚合物具有独特的稀土荧光发射特性，可以通过时间分辨技术有效地消除背景荧光的干扰。
(3)本发明的方法操作简便，价格低且效率高。
附图说明
图1为实施例1中ATP/Tb与[email protected]/Tb-CPBA的扫描电镜图。
图2为实施例2中水溶性四唑盐试剂(WST-1)试剂在不同条件下的吸收光谱和照片。
图3为实施例3中ATP/Tb-CPBA和[email protected]/Tb-CPBA在不同条件下的发射光谱。
图4为实施例4中[email protected]/Tb-CPBA和游离SOD+ATP/Tb-CPBA体系对超氧阴离子的时间依赖性荧光响应比较图。
图5为实施例5中[email protected]/Tb-CPBA和游离SOD+ATP/Tb-CPBA体系在贮藏不同时间后对超氧阴离子响应活性比较图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开的具体实施例的限制。
一种酶集成稀土配位聚合物的制备方法，将酶与具有荧光特性的稀土配位聚合物结合，具体包括以下步骤：
(1)将金属盐硝酸铽(Tb(NO3)3)水溶液与20μg/mL～25μg/mL的超氧化物岐化酶(SOD)预搅拌30min后；
(2)加入配体三磷酸腺苷(ATP)的水溶液，反应3h后，以转速13000rpm离心10min，分离得到固态产物，其中，所述的金属盐硝酸铽(Tb(NO3)3)与配体三磷酸腺苷(ATP)的摩尔比为8:3；
(3)将步骤(2)中分离得到的固态产物先用水洗涤3次，再与天线分子羧基苯硼酸(CPBA)混合反应12h后，分离得到的最终固态产物，即为所述的酶集成稀土配位聚合物。
在以下实施例中，超氧化物歧化酶标记为SOD，三磷酸腺苷标记为ATP，羧基苯硼酸标记为CPBA，不含CPBA的样品标记为[email protected]/Tb，不含SOD的样品标记为ATP/Tb-CPBA，最终样品标记为[email protected]/Tb-CPBA。
实施例1
按照以下步骤制备[email protected]/Tb-CPBA：
(1)将5.5mg硝酸铽溶于4mL水中，得到硝酸铽水溶液；
(2)将0.1mg SOD溶于0.1mL水中，得到SOD水溶液；
(3)将6.1mg ATP溶于4mL水中，得到ATP水溶液；
(4)将4mL硝酸铽水溶液与0.1mL SOD水溶液混合后，搅拌30min；然后加入ATP水溶液，继续搅拌3h后；用水洗涤3次，得到[email protected]/Tb；
(5)将13.3mg CPBA溶于0.4mL水中，得到CPBA水溶液；
(6)取上述步骤(4)、步骤(5)中制得的3.6mL [email protected]/Tb(0.1mg/mL)水溶液与0.4mL CPBA水溶液混合，搅拌12h后离心(13000rpm，10min)，并用水洗涤3次，得到[email protected]/Tb-CPBA。
实施例2
结合水溶性四唑盐试剂(WST-1)检测超氧阴离子，利用紫外分光光度计记录其最大吸收峰对应的吸光度，以检测SOD的超氧阴离子催化活性。其方法步骤为：
(1)以pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)作为缓冲溶液，总体积200μL，反应温度37℃；
(2)超氧阴离子由溶解在二甲基亚砜(DMSO)溶液中的KO2获得；
(3)用96孔板，分别对反应孔编号为a、b、c、d；其中，
反应孔a中溶液的配制方法为：包含10μM WST-1试剂的pH＝7.4的HEPBS缓冲溶液，37℃水浴反应20min；
反应孔b中溶液的配制方法为：包含10μM WST-1试剂和50μM超氧阴离子溶液的pH＝7.4的HEPBS缓冲溶液，37℃水浴反应20min；
反应孔c中溶液的配制方法为：包含10μM WST-1试剂、50μg SOD和50μM超氧阴离子的pH＝7.4的HEPBS缓冲溶液，37℃水浴反应20min；
反应孔d中溶液的配制方法为：包含10μM WST-1试剂、50μg [email protected]/Tb和50μM超氧阴离子的pH＝7.4的HEPBS缓冲溶液，37℃水浴反应20min；
(4)上述反应孔a、b、c、d同时反应20min后，观察得知反应孔d为无色且与反应孔a类似，其余反应孔为黄色；
(5)将4个反应孔中的样品分别利用紫外分光光度计在440nm处测定其最大吸收峰对应的吸光度。
检测结果如图2所示，游离SOD与超氧阴离子的反应后的吸光度要远高于[email protected]/Tb，由此可知，包埋在ATP/Tb中的SOD催化活性得到了极大的增强。
实施例3
利用荧光光谱仪记录最大发射峰对应的荧光强度，以检测[email protected]/Tb-CPBA识别超氧阴离子的能力。具体方法是：
(1)用4支0.5mL离心管，分别编号为a、b、c、d；
(2)离心管a中溶液的配制方法为：取5μL 1mg/mL ATP/Tb-CPBA加入到95μL pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，37℃水浴反应3min；
(3)离心管b中溶液的配制方法为：取5μL 1mg/mL ATP/Tb-CPBA加入到95μL含有50μg SOD和50μM超氧阴离子的pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，37℃水浴反应3min；
(5)离心管c中溶液的配制方法为：取5μL 1mg/mL [email protected]/Tb-CPBA加入到95μLpH＝7.4的HEPES缓冲溶液中，37℃水浴反应3min；
(6)离心管d中溶液的配制方法为：取5μL 1mg/mL [email protected]/Tb-CPBA加入到95μL含有50μM超氧阴离子的pH＝7.4HEPES缓冲溶液中，37℃水浴反应3min；
(7)反应结束后，利用荧光光谱仪在时间分辩荧光模式下分别在300nm激发波长下测定4支离心管中的样品的最大发射峰对应的荧光强度。
检测结果如图3所示，[email protected]/Tb-CPBA在加入超氧阴离子后荧光发生明显猝灭，且猝灭程度远大于SOD和ATP/Tb-CPBA的混合体系，由此可知[email protected]/Tb-CPBA具有灵敏的超氧阴离子识别能力。
实施例4
对比[email protected]/Tb-CPBA和ATP/Tb-CPBA +SOD体系的超氧阴离子响应性，利用荧光光谱仪记录最大发射峰对应的荧光强度；具体方法步骤如下：
参照实施例3中进行荧光响应实验时在试管中的实验操作方法，设定SOD的终浓度为50μM，超氧阴离子的终浓度为50μM，ATP/Tb-CPBA和[email protected]/Tb-CPBA的终浓度为0.05mg/mL，最终反应总体积为100μL，在37℃水浴锅中反应3min，反应结束后，利用荧光光谱仪在时间分辩荧光模式下分别在300nm激发波长下测定荧光强度。
检测结果如图4所示，[email protected]/Tb-CPBA对超氧阴离子的荧光响应速度比SOD和ATP/Tb-CPBA混合体系更快，由此可知[email protected]/Tb-CPBA具有更高的荧光猝灭效率用于超氧阴离子检测。
实施例5
对比[email protected]/Tb和ATP/Tb+SOD体系的储存稳定性，利用荧光光谱仪记录最大发射峰对应的荧光强度。具体方法步骤如下：
(1)将[email protected]/Tb和SOD体系在室温分别放置1～7天，每天监测超氧阴离子的浓度；
(2)参照实施例3中进行荧光响应实验时在试管中的实验操作方法，设定SOD的终浓度为50μM，超氧阴离子的终浓度为50μM，[email protected]/Tb的终浓度为0.05mg/mL，最终反应总体积为100μL，在37℃水浴锅中反应3min，反应结束后，利用荧光光谱仪在时间分辩荧光模式下分别在300nm激发波长下测得SOD混合体系和游离[email protected]/Tb体系的荧光强度。
检测结果如图5所示，在7天内[email protected]/Tb的超氧阴离子催化稳定性要远大于游离SOD，由此可知SOD在ATP/Tb中的包埋可以极大增强SOD的催化稳定性。
综上所述，本发明提出的酶集成稀土配位聚合物，是基于酶和稀土配位聚合物结合形成的。在酶集成稀土配位聚合物的制备过程中，由于不含有毒元素、条件温和，所以酶仍保有较高的催化活性和稳定性。本发明的制备方法制得的酶集成稀土配位聚合物与时间分辨荧光技术相结合可以进行超氧阴离子的检测，具有稀土金属的荧光特性和酶的特异性识别作用，从而提高检测灵敏度和选择性；与常用的超氧阴离子检测相比，更简便且效率高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。