一种基于纳米复合材料传感器的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种基于纳米复合材料传感器的制备方法及应用 (Preparation method and application of sensor based on nano composite material ) 是由 惠妮 王家胜 王欣惠 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于纳米复合材料传感器的制备方法及应用,先用GO-Fe-(3)O-(4)和EDOT配制成沉积液,通过电化学的方法,制备出GO-Fe-(3)O-(4)/PEDOT纳米复合材料,修饰玻碳电极为工作电极,在催化剂的作用下将氨基化DNA固定在GO-Fe-(3)O-(4)/PEDOT纳米复合材料上,制备出可以检测microRNA的生物传感器,建立了CC法和I-T法两种检测模式,其具有较好的选择性和较高的灵敏度,可以适应当前血清中microRNA表达水平检测精度的要求,为开发快速在线检测血清中microRNA表达水平的检测装置提供了重要支持。(The invention discloses a preparation method and application of a sensor based on a nano composite material, wherein GO-Fe is firstly used 3 O 4 Preparing deposition solution with EDOT, and preparing GO-Fe by electrochemical method 3 O 4 the/PEDOT nanometer composite material adopts a modified glassy carbon electrode as a working electrode, and fixes aminated DNA on GO-Fe under the action of a catalyst 3 O 4 The biosensor capable of detecting microRNA is prepared on the PEDOT nanometer composite material, two detection modes of a CC method and an I-T method are established, the biosensor has good selectivity and high sensitivity, can meet the requirement of the detection precision of the expression level of the microRNA in the current serum, and provides an important support for developing a detection device for rapidly detecting the expression level of the microRNA in the serum on line.)
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器领域，具体涉及一种基于纳米复合材料传感器的制备方法及应用。
背景技术
小分子核酸microRNAs是一类广泛的小型非编码RNA，它们在人体内可以抑制基因表达和蛋白质翻译过程，从而影响身体代谢、细胞存活周期等，所以称其为疾病标志物。利用这种特点，如果可以简单迅速地检测血清中microRNA的表达水平，便能有效推断人体疾病的发生与进展。现有的血清中microRNA的表达水平检测方法中存在的样品前处理过程繁琐、仪器昂贵，所以用电化学的方法用于血清中microRNA的表达水平的检测，成为了研究的热点，但电化学生物传感器存在检测灵敏度低、稳定性差等问题，制约了电化学检测的发展。
电化学生物传感器是结合了电化学分析及生物传感技术而发展的一种新型检测血清中microRNA的表达水平技术，比传统的检测方法，具有更高的灵敏度、选择性和稳定性，不需要进行繁琐的预处理和专业的人员操作。因此，针对电化学的方法检测血清中microRNA的表达水平，开发出基于GO(氧化石墨烯)-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器，增强生物传感器的灵敏度和稳定性对于开发出快速检测血清中microRNA的表达水平的检测装置具有重要的支持作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于纳米复合材料传感器的制备方法及应用，增强生物传感器的灵敏度和稳定性，建立了CC和I-T双模式检测方法，提高快速在线检测血清中microRNA的表达水平。
为实现上述技术目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器的制备方法，包括以下步骤：
在GO-Fe3O4纳米复合材料中加超纯水，超声溶解后加入EDOT(3,4-乙烯二氧噻吩)，继续超声溶解至完全没有油滴出现，得到沉积液，采用循环伏安法对沉积液进行沉积，得到GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料；
催化剂和氨基化DNA充分混合制成孵化液，将孵化液滴涂于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料上，在湿润(湿度大于80％)环境下进行孵化处理，在催化剂的作用下将氨基化DNA固定在GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料上，制成基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器。
GO-Fe3O4纳米复合材料的制备：
在GO中加入超纯水制成GO悬浮液；
将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O混合后加超纯水制成混合溶液；
在80℃水浴温度下，将混合溶液缓慢加入GO悬浮液中，滴加完毕后将温度调至85℃，快速加入氨水调节pH至10(氨水用于沉淀Fe2+/Fe3+离子，合成磁铁矿(Fe3O4)粒子)，恒温快速搅拌，冷却，洗涤，离心，烘干，即得到GO-Fe3O4纳米复合材料。
进一步地，所述GO-Fe3O4纳米复合材料与所述超纯水的质量体积比为(1-3)mg：1mL。利用超声溶解至无明显可见的固体颗粒后再加入EDOT。
进一步地，所述GO-Fe3O4纳米复合材料与所述EDOT的质量体积比为(1-3)mg：2μL。
进一步地，所述循环伏安法(CV)参数设置：沉积电压-0.2～1.5V，以0.1V/s的扫速(Scan Rate)沉积10-25圈，即Sweep Segments设置为20-50。
进一步地，所述催化剂是由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中配制而成得到的两种催化剂。磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
进一步地，所述催化剂的浓度为0.2M-0.8M。催化剂EDC的浓度为0.8M，催化剂NHS的浓度为0.2M。催化剂需要现配现用。
进一步地，所述氨基化DNA浓度为10-6M。根据检测不同的microRNA，选取特定的氨基化DNA。
根据孵化电极的根数确定所配置的氨基化DNA的量，每根电极孵化大约需20μL的最终浓度为10-6M的氨基化DNA。
本发明还提供一种利用上述制备方法得到的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器。
若实验室中的氨基化DNA浓度为10-5M，可用PBS(PH7.4)将其稀释5倍，得到浓度为2×10-6M的DNA，将浓度为2×10-6M的DNA与催化剂1∶1混合即可获得加入催化剂后的目标浓度氨基化DNA孵化液。将其滴涂在GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料，在湿润的环境下孵化60min，在催化剂的作用下将氨基化DNA固定在GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料上，制成基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器。
本发明还提供一种基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器在双模式检测microRNA中的应用。将含microRNA的样品滴涂在生物传感器上，在湿润的环境下孵化时间为30min，检测样品中microRNA的含量。
进一步地，所述检测方法包括电流-时间曲线法(i-t)和计时电量法(CC)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明可以实现合成生物传感器基底的GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料，其导电性好、比表面积大纳米多孔的形貌，可以选用氨基化DNA开发出适用于检测血清中microRNA的表达水平的生物传感器。
(2)本发明制备的生物传感器采用CC的检测方法对不同浓度的血清中microRNA的表达水平进行检测，生物传感器的信号抑制率与血清中microRNA的表达水平的浓度的对数值之间呈线性关系，线性范围10-15-10-6mol/L，检测限为5.18×10-15mol/L；采用i-t的检测方法对不同浓度的血清中microRNA的表达水平检测，生物传感器的信号抑制率与血清中microRNA的表达水平的浓度的对数值之间呈线性关系，线性范围10-15-10-6mol/L，检测限为7.36×10-15mol/L。
(3)本发明提出的双模式检测，与传统的检测方法相比，可以实现快速性检测，现场检测和互相印证。
(4)本发明可以适应当前血清中microRNA的表达水平检测精度的要求，为开发快速在线检测血清中microRNA的表达水平的检测装置提供了重要支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1-4制备的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器CC表征图；
图2为实施例1中GO、GO-Fe3O4纳米复合材料、GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料和基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器FT-IR分析表征图；
图3为实施例1和实施例5制备得到的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器扫描电镜图；
图4为实施例1所得到的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器检测不同浓度microRNA的CC曲线图；
图5为实施例1所得到的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器检测不同浓度microRNA的i-t曲线图；
图6为GO-Fe3O4/PEDOT传感器在铁标中的50圈CV扫描曲线；
图7为GO-Fe3O4/PEDOT/DNA生物传感器在PBS 7.4中对不同RNA检测的干扰情况；
图8为本发明纳米复合材料和检测流程图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)GO-Fe3O4纳米复合材料的制备：
准确称取40mg的GO为原料于称量瓶中，加入超纯水制成5mL氧化石墨烯悬浮液；再称取37.2mg的FeCl3·6H2O和19.2mg的FeSO4·7H2O混合，加入超纯水配制成5mL混合水溶液。在80℃水浴条件下，向氧化石墨烯悬浮液中缓慢加入FeCl3和FeSO4的混合水溶液，滴加完毕后将温度调至85℃，快速加入30％氨水调节pH至10；氨水用于沉淀Fe2+/Fe3+离子，合成磁铁矿(Fe3O4)粒子。恒温快速搅拌45min，将溶液冷却至室温，产品用超纯水冲洗两次，离心去除上清液后于烘箱中干燥，即得到GO-Fe3O4纳米复合材料。
(2)GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料的制备：
准确称取10mg的GO-Fe3O4纳米复合材料加入称量瓶中，移液枪加入5mL超纯水，塞紧塞子后用封口膜密封，放入超声清洗仪中超声溶解，当无明显可见的固体颗粒后向其中加入10μL的EDOT，再次封口后继续超声溶解至完全没有油滴出现，即制备好沉积液。
通过循环伏安法(CV)，参数设置为：沉积电压为-0.2～1.5V，以0.1V/s的扫速(Scan Rate)沉积15圈，即Sweep Segments设置为30，在玻碳电极上制备出GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料。
(3)催化剂的制备：
准确称量0.3834g EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.05754g NHS(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))于10mL称量瓶中，用移液枪移取2.5mL PBS(PH7.4)加入其中，充分混匀溶解即得到EDC和NHS浓度分别为0.8M和0.2M的催化剂，催化剂需要现配现用。
(4)基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器的制备：
根据孵化电极的根数确定所配置的5’氨基化DNA的量，每根电极孵化需20μL的最终浓度为10-6M的氨基化DNA。
采用PBS(PH7.4)将浓度为10-5M的氨基化DNA稀释五倍，得到浓度为2×10-6M的氨基化DNA。
将浓度为2×10-6M的5’氨基化DNA与催化剂(EDC+NHS混合催化剂，EDC浓度为0.8M，NHS为0.2M.)体积比1∶1混合即可获得加入催化剂后的目标浓度氨基化DNA孵化液。将其滴涂在GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料，在湿润的环境下孵化60min，在催化剂的作用下将氨基化DNA固定在GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料上，制成基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器。
实施例2-4
同实施例1，区别在于，将CV沉积圈数由15分别改为10、20和25。
实施例1-4制备得到的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器CC表征图如图1所示，可以看出，CV沉积圈数为15时是最佳沉积圈数。
图1为不同沉积圈数的传感器在铁标中的CC对比(A)及对应线性拟合(B)，a为10圈、b为15圈、c为20圈、d为25圈。结果如图所示，沉积15圈的电极传感性能更好，电活性表面积最大。所以本实验后续制备的GO-Fe3O4/PEDOT传感器皆采用CV沉积15圈的方法。
图2为实施例1中GO、GO-Fe3O4纳米复合材料、GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料和基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器FT-IR分析表征图，其中，a为GO的红外光谱；b为GO-Fe3O4的红外光谱；c为GO-Fe3O4/PEDOT的红外光谱；d为DNA/GO-Fe3O4/PEDOT的红外光谱。可以看出，Fe3O4与GO形成了纳米复合材料，GO-Fe3O4也成功掺杂到GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料中，氨基化DNA也成功固定在GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料表面。
实施例5
同实施例1，区别在于，将GO-Fe3O4纳米复合材料替换成氧化石墨烯。
图3为实施例1和实施例5制备得到的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器扫描电镜图，(A)为GO/PEDOT纳米复合材料放大20000倍扫描电镜图，(B)为GO/PEDOT纳米复合材料放大50000倍的扫描电镜图；(C)为GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料分别放大20000倍扫描电镜图，(D)为GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料分别放大50000倍的扫描电镜图。可以看出，GO-Fe3O4纳米复合材料具有一种多孔的微结构，提供较大的表面积，作为传感器的修饰材料最佳选择。
实施例6
分别用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水配制10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15mol/L的microRNA样品，分别将其滴涂在实施例1制备的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器上，在湿润的环境下孵化30min，采用CC检测方法实验，结果如图4所示，A图为传感器定量检测microRNA24的CC对比；B图为对应线性拟合；microRNA24浓度从10-15到10-6mol L-1(a→j)，可以看出，microRNA的浓度与响应信号之间存在良好的线性关系，其线性方程为y＝-0.01462x+0.404(R2＝0.993)，线性范围为线性范围10-15-10-6mol/L，检测限为5.18×10-15mol/L。
实施例7
分别用DEPC处理水配制10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10- 15mol/L的microRNA样品，分别将其滴涂在实施例1制备的基于GO-Fe3O4/PEDOT纳米复合材料传感器上，在湿润的环境下孵化30min，在5mL用PBS(PH 8.0)配制的NaNO2溶液，采用i-t检测方法实验，检测电压设置为0.75V，结果如图5所示，A图为传感器定量检测microRNA24的i-t对比；B图为对应线性拟合；microRNA24浓度从10-15到10-6mol L-1(a→l)。可以看出，microRNA的浓度与响应信号之间存在良好的线性关系，其线性方程为y＝-0.0495x+0.382(R2＝0.994)，线性范围为10-15-10-6mol/L，检测限为7.36×10-15mol/L。
实施例8
将实施例1制备好的GO-Fe3O4/PEDOT传感器在铁标准溶液中进行50圈的CV扫描(扫速0.1V/s)。从图6观察扫描结果，50圈的CV转换信号基本不变，Fe氧化还原峰分别在+0.25V和+0.05V左右。说明此传感器具有良好的稳定性，电极表面的沉积物质不会随实验的进行而脱落。
实施例9
为了评价GO-Fe3O4/PEDOT/DNA生物传感器(实施例1)的特异性，研究了在相同条件下该传感器对其他可能的干扰，包括microRNA21、M1(单碱基错配的RNA24，曲线b)、M2(双碱基错配的RNA24，曲线c)、M3(三碱基错配的RNA24，曲线d)，microRNA21(曲线e)五种RNA。GO-Fe3O4/PEDOT/DNA后分别与10-6mol L-1的不同的RNA孵化30min，PBS 7.4缓冲液冲洗3次后直接在PBS 7.4溶液中进行CV和CC扫描，最后再与microRNA24(曲线f)孵化并检测。图7对比结果表明，该生物传感器与RNA24孵化后CV、CC变化最大，而与其他的4种RNA反应后均出现了较小的变化。所以GO-Fe3O4/PEDOT/DNA传感器对microRNA24的检测具有良好选择性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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