具体实施方式

以下是本公开的实施方式的详细描述。实施方式是非常详细的以清楚地传达本公开。然而，所提供的细节量并不旨在限制实施方式的可预期变化；相反，本发明旨在涵盖落入由所附权利要求所定义的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代方案。

本文中的所有出版物(publication)均通过引用方式被并入，就如每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地表示以通过引用被并入一样。如果并入的文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义适用，而文献中该术语的定义不适用。

整个说明书中对“一个实施方式”或“实施方式”的引用是指结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包含在至少一个实施方式中。因此，在整个说明书的多个地方出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定都指同一实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。

在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明某些实施方式，表达成分、性质(例如浓度、反应条件)等数量的数字应理解为在一些情况下被术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，所写说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是大约值，其可以根据具体实施方式寻求获得的期望性质而变化。在一些实施方式中，应该根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来理解数值参数。尽管陈述本发明的一些实施方式的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中陈述的数值是被尽可能精确地报告的。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差必然导致的某些误差。

除非上下文另有明确规定，否则如本文的说明书和随后的权利要求中使用的，“a”、“an”和“the”的含义包括复数形式。此外，如本文说明书中使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在...中(in)”的含义包括“在...中(in)”和“在...上(on)”。

除非上下文另有要求，否则在随后的整个说明书中，词语“包括”及其变形，如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应以开放、非排他的意义(即“包括，但不限于”)解释。

本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有说明，否则将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独被记载一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。关于本文中特定实施方式所提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并不对本发明要求保护的范围构成限制。说明书中的任何语言不应被解释为表示对本发明的实行必不可少的任何未要求保护的要素。

本文公开的本发明的可选择要素或实施方式的分组不应被解释为限制性的。每个组成员可以单独地、或以与该组的其他成员或本文出现的其它要素的任何组合的方式被引用和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，一个组的一个或更多个成员可以被包含在一个组中或从一个组中删除。当发生任何此类包含或删除时，本文的说明书被视为含有修改后的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

下面的描述以及其中描述的实施方式是通过说明本公开的原理和方面的特定实施方式的一个或更多个实施例的方式而被提供的。提供这些实施例是为了解释本公开的这些原理，而不是为了限制的目的。

还应当理解，本公开能够以包含作为系统、方法或设备的多种方式进行实施。在本说明书中，这些实施方式或本发明可以采用的任何其他形式可以被称为工艺(process)。一般而言，在本发明的范围内可以改变所公开工艺的步骤的顺序。

本文提供的本发明的标题和摘要仅为方便起见，并不解释实施方式的范围或含义。

以下讨论提供了本发明主题的许多示例性实施方式。尽管每个实施方式代表发明要素的单一组合，但本发明主题被认为包含所公开要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方式包括要素A、B和C，而第二实施方式包括要素B和D，那么即使没有明确公开，本发明的主题也被认为包含A、B、C或D的其他剩余组合。

以下示出了本文使用的各种术语。如果在权利要求中使用的术语没有在下文中被定义，则应该如印刷出版物和已发布的专利在提交时所反映出的，给出相关领域内的人员所给出的最广泛的定义。

本文所用的术语“类似物”是指结构类似于另一种化合物，但在某一组分方面与该另一种化合物不同的化合物。这些类似物可以具有非常不同的物理、化学、生化或药理性质。

本文所使用的缩写指的是以下完整形式：

Boc：叔丁基氧羰基

DCM：二氯甲烷

Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-1-亚基)乙基

DIC：N,N’-二异丙基碳化二亚胺

DIPEA：二异丙基乙胺

DMF：二甲基甲酰胺

DODT：2,2’-(伸乙二氧基)二乙硫醇

Fmoc：9-芴甲氧羰基

HBTU：六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲

HOBt：N-羟基苯并三唑

HPLC：高效液相色谱

MTBE：甲基叔丁基醚

OtBu：叔丁基酯

tBu：叔丁基

TFA：三氟乙酸

Trt：三苯甲基

2-CTC：2-氯三苯甲基氯

HCl：盐酸

mL：毫升

g：克

℃：摄氏度

h：小时

min：分钟

IPA：异丙醇

vol：体积

RT：室温

Mmol：毫摩尔

TIPS：三异丙基硅烷

A°：埃

HPLC：高效液相色谱

本公开涉及(glp-1)受体激动剂的合成类似物。

在一般的实施方式中，本公开提供胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的类似物。

在某些实施方式中，本公开提供胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的类似物，其中天然胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的第2位氨基酸被D-丙氨酸取代。

胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的类似物(其中天然胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的第2位氨基酸被D-丙氨酸取代)优于天然胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂，例如，它可以比相应的胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂具有更好的生物利用度和增强的功效。

在一个实施方式中，本公开提供了胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的类似物，其中胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂是利拉鲁肽或索马鲁肽。

在一个实施方式中，本公开公开了能够保持其生物活性的利拉鲁肽的合成类似物。

在一个实施方式中，本公开公开了能够保持其生物活性的索马鲁肽的合成类似物。

在本文中，利拉鲁肽的合成类似物也称为GLP-1的类似物、GLP-A类似物、利拉鲁肽的类似物、利拉鲁肽类似物或D-利拉鲁肽、胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的类似物，这些表述在全文中互换使用。

在本文中，索马鲁肽的合成类似物也称为GLP-1的类似物，GLP-A类似物，索马鲁肽的类似物，索马鲁肽类似物或D-索马鲁肽，胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的类似物，这些表述在全文中互换使用。

在另一实施方式中，本公开公开了利拉鲁肽的合成类似物，其可以通过固相肽合成很容易地被合成。

在另一实施方式中，本公开公开了索马鲁肽的合成类似物，其可以通过固相肽合成很容易地被合成。

在一个实施方式中，本公开提供了胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的合成类似物的制备方法，其中，天然胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的第2位氨基酸被D-丙氨酸取代。

在一个实施方式中，本公开提供了利拉鲁肽的合成类似物的制备方法，其中，天然胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体激动剂的第2位氨基酸被D-丙氨酸取代。

在一个实施方式中，本公开提供了D-利拉鲁肽的制备方法，其中天然利拉鲁肽的第2位氨基酸被D-丙氨酸取代，其中该方法包括步骤：

a)将Fmoc-Gly-OH锚定到树脂上并将其封端；

b)选择性地将氨基基团脱保护；

c)顺序偶联片段Fmoc-Arg(Pbf)OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH；

d)脱除赖氨酸侧链保护基团Dde，然后与Fmoc-Glu-OtBu偶联，接着进行Fmoc脱保护，以及与棕榈酸偶联；以及

e)从树脂上切割肽以获得线性D-利拉鲁肽。

在一个方面，该方法可选地包括纯化D-利拉鲁肽以提供纯化的D-利拉鲁肽。

在另一实施方式中，本公开提供了D-利拉鲁肽的制备方法，该方法包括如方案1(图1)所示的步骤。

在一个实施方式中，本公开提供了D-索马鲁肽类似物的制备方法，其中天然索马鲁肽的第2位氨基酸被D-丙氨酸取代，其中该方法包括以下步骤：

a)将Fmoc-Gly-OH锚定到树脂上并封端；

b)选择性地将氨基基团脱保护；

c)顺序偶联片段Fmoc-Arg(Pbf)OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH；

d)脱除赖氨酸侧链保护基团Dde，然后与Fmoc-PEG2-CH2-COOH序列、Fmoc-Glu-OtBu偶联，接着进行Fmoc脱保护，以及与氧代十八烷酸偶联；以及

e)将肽从树脂上切割下来以得到线性D-索马鲁肽。

在一个实施方式中，该方法可选地包括纯化D-索马鲁肽以提供纯化的D-索马鲁肽。

在一个实施方式中，本公开提供了D-索马鲁肽的制备方法，该方法包括方案2(图2)中所示的步骤。

在一个实施方式中，固相为树脂。

在一个实施方式中，该树脂选自但不限于：2-氯三苯甲基氯(2-CTC)、Sasrin、TentaGel S、TentaGel TGA、Rink、Wang、AmphiSpheres以及其它适用的树脂。

在一个实施方式中，偶联剂选自但不限于：1-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、六氟磷酸盐苯并三唑四甲脲(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基-氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、氧-(7-氮杂苯并三唑-l-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酯(HATU)以及它们的组合。

在一个实施方式中，偶联反应的溶剂选自但不限于：DMF、吡啶、乙酸酐、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯乙烷、1,4-二氧六环、2-甲基四氢呋喃、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、乙酸乙酯、乙腈、丙酮等或它们的组合。

在一个实施方式中，通过本领域已知的方法，例如通过使用适当的溶剂(如DMF)中哌啶、DBU和二氯甲烷的混合物，能够选择性地对氨基基团进行脱保护。

在一个实施方式中，使用选自但不限于二氟乙酸、三氟乙酸等的化学品，能够使所形成的肽从树脂上切割。

在一个实施方式中，可以通过本领域公知的方法，进行选自D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽的GLP-1类似物的纯化工艺。纯化工艺可选择但不限于制备反相HPLC、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱等。

分别与天然利拉鲁肽和索马鲁肽相比，根据本公开提供的GLP-1的合成类似物即D-利拉鲁肽和D-索马鲁肽具有更好的药代动力学特性。

根据本公开提供的GLP-1类似物即D-利拉鲁肽和D-索马鲁肽，例如通过减少包括利拉鲁肽或索马鲁肽类似物的剂型的给药频率，可以有利于减轻患者的负担。

本公开的GLP-1类似物即D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽，可用于治疗代谢障碍例如糖尿病和肥胖症。

本公开的GLP-1类似物即D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽相对于各自常规的GLP-1可提供如下优点：其可以较低频率给药，从而为患者提供方便，并由此增加患者依从性，进一步地在较长时间内提供有效的血糖控制。

根据本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽可以是适合于每周或每两周或每月给药一次的长效类似物。

GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽能够以碱的形式或以其盐或其混合物的形式存在。盐的代表性例子包含与合适的无机酸，如盐酸、氢溴酸等形成的盐。盐的代表性例子还包含与有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、抗坏血酸等形成的盐。盐的代表性例子还包含与碱，如三乙醇胺、二乙胺、葡甲胺、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、二乙基乙醇胺、三乙胺、氨丁三醇、胆碱、三甲胺、牛磺酸、苯扎明、甲胺、二甲胺、三甲胺、甲基乙醇胺、丙胺、异丙胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤等形成的盐。

然而，本领域技术人员会明白，在不脱离本公开的范围和精神的情况下，可以使用如本领域普通技术人员已知的，不能被DPP-IV降解的任何其它合成部分。

在另一实施方式中，根据本公开提供的GLP-1类似物，即D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽，可以分别以各自的冻干混合物的形式被提供，该冻干混合物包括D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽，和胃肠外可接受的的胺碱。可按照如下步骤制备所述冻干混合物：通过将GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽或其药学上可接受的盐和胃肠外可接受的的胺碱在注射用水中混合来形成溶液，并将该溶液冻干来形成冻干混合物。所述胃肠外可接受的胺碱可选自三乙醇胺、二乙胺、葡甲胺、鸟氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、二乙基乙醇胺、乙醇胺、三乙胺、氨丁三醇、葡萄糖胺、胆碱、三甲胺、牛磺酸、苯扎明、三甲基氢氧化铵、依泊胺甲胺、二甲胺、三甲胺、甲基乙醇胺、丙胺、异丙胺等。

本公开还提供了根据本公开提供的GLP-1类似物，即本公开的D-利拉鲁肽和D-索马鲁肽在代谢性疾病治疗中的用途。在优选实施方式中，本公开的索马鲁肽类似物能够适用于糖尿病的治疗。在另一实施方式中，本公开的索马鲁肽类似物可适用于肥胖的治疗。

在另一实施方式中，本公开的GLP-1类似物，即D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽能够适用于将有需要的患者的血糖水平降低至少一周的时间。

在另一实施方式中，本公开提供了用于通过口服或胃肠外途径施用本公开的GLP-1类似物，即D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽的合适剂型。

本公开的GLP-1类似物，即D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽可被配制成合适的胃肠外剂型。通过皮下注射或肌肉注射，可以施用本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽或包括其的组合物，或包括其的剂型。

本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽可被配制成合适的口服剂型。根据需要GLP-1给药的受试者的需求，以一定的频率通过口服给药施用本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽，或包括其的组合物，或包括其的口服剂型。

本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽在单次给药后很长时间内能够维持治疗水平，该很长时间可为一周或两周或一个月。

通过每周一次、每两周一次或每月一次施用GLP-1类似物、或包括其的组合物或剂型，本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽可用于糖尿病的治疗。

在另一实施方式中，本公开提供了降低有需要的患者的葡萄糖水平的方法，该方法包括以治疗有效量施用本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽。

根据另一实施方式，本发明提供药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽，与一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。

根据另一实施方式，可以通过将本文描述的一种或更多种类似物、或其药学上可接受的盐或互变异构体，与药学上可接受的载体等混合来制备组合物，以治疗或改善各种GLP-1相关病症。可以通过本领域公知的方法，例如常规的制粒、混合、溶解、封装、冻干、乳化或磨细工艺等来制造本公开的药物组合物。该组合物可以是例如颗粒、粉末、片剂、胶囊糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、悬浮液或溶液的形式。可配制本发明组合物以用于各种途径的给药，例如通过口服给药、经粘膜给药、直肠给药、局部给药或皮下给药以及鞘内、静脉内、肌肉内、腹腔内、鼻内、眼内或脑室内注射。本发明的一种或更多种化合物也能够以局部而不是全身方式被施用，例如以持续释放制剂的形式注射。

根据另一实施方式，本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽能够单独被使用或与一种或更多种额外的治疗活性剂联合使用。

在一个实施方式中，本发明提供治疗受试者的GLP-1介导疾病、障碍或综合征的方法，该方法包括施用有效量的本公开的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽。

在另一实施方式中，本发明提供治疗受试者的GLP-1介导疾病、障碍或综合征的方法，该方法包括施用有效量的GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽，其中疾病是2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、高血糖、代谢综合征(X综合征和/或胰岛素抵抗综合征)、糖尿、代谢性酸中毒、关节炎、白内障、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性心肌病、肥胖、被肥胖加重的病症、高血压、高血脂、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨量减少、衰弱、骨损失、骨折、急性冠脉综合征、生长激素缺乏导致的身材矮小、多囊卵巢综合征导致的不孕、焦虑、抑郁、失眠、慢性疲劳、癫痫、饮食障碍、慢性疼痛、酒精成瘾、肠动力相关疾病、溃疡、肠易激综合征、炎症性肠综合征或短肠综合征。

在另一实施方式中，本发明提供了GLP-1类似物D-利拉鲁肽或D-索马鲁肽用于治疗疾病的用途，该疾病选自2型糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量降低、高血糖、代谢综合征(X综合征和/或胰岛素抵抗综合征)、糖尿、代谢性酸中毒、关节炎、白内障、糖尿病性神经病变、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性心肌病、肥胖、被肥胖加重的病症、高血压、高血脂、动脉粥样硬化、骨质疏松、骨量减少、衰弱、骨损失、骨折、急性冠脉综合征、生长激素缺乏导致的身材矮小、多囊卵巢综合征导致的不孕、焦虑、抑郁、失眠、慢性疲劳、癫痫、饮食障碍、慢性疼痛、酒精成瘾、肠动力相关疾病、溃疡、肠易激综合征、炎症性肠综合征或短肠综合征。

尽管前面描述了本公开的多种实施方式，但在不脱离本公开基本范围的情况下，可以设计本公开的其它和进一步的实施方式。本公开的范围由随之的权利要求确定。本公开不限于所描述的实施方式、版本或示例，在与本领域普通技术人员可获得的信息和知识相结合时，所包含的实施方式、版本或示例使得本领域普通技术人员能够作出和使用本发明。

实施例

用以下实施例进一步说明本发明。然而，应当理解，以下实施例仅仅是说明性的，并不能被视为对本发明范围的限制。

实施例1

D-利拉鲁肽的合成

步骤1：将Fmoc-Gly-CTC锚定在树脂上

称取取代度为0.35mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂并加入到固相反应柱中。随后，将Fmoc-Gly-CTC树脂用DMF洗涤两次，并在DMF中溶胀30分钟。

步骤2：将氨基酸脱保护

用20％哌啶去除Fmoc保护，然后将树脂用DMF洗涤4次且用DCM洗涤2次。通过茚三酮试验对树脂进行测试，其中通过树脂的颜色情况来指示Fmoc的去除。

步骤3：顺序耦联其它Fmoc保护的氨基酸

将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(6.0mmol)、HOBt(7.2mmol)、DIC(7.2mmol)溶解于体积比为1：1的DCM和DMF的混合溶液中，装入固相反应柱，室温下反应2h。通过茚三酮试验确定反应终点，其中无色透明树脂表示反应完全；而树脂显色表示反应不完全，需要再反应1小时。此标准被应用于通过茚三酮试验的终点测定。

重复上述步骤2和相应的氨基酸偶联步骤，根据D-利拉鲁肽的肽骨架序列，将Fmoc-Arg(Pbf)OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)OH,Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH顺序偶联。

步骤4：制备Dde脱保护树脂片段

在上述步骤-3顺序偶联后得到的树脂片段中加入第一批次(lot-1)DMF(10vol)中有3％水合肼的澄清混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃将悬浮液缓慢搅拌10分钟。排出溶剂，在树脂中加入第二批次(lot-2)DMF(10vol)中有3％水合肼的澄清混合物。在25-30℃将悬浮液搅拌10分钟。排出溶剂，用DMF(2×10vol)和IPA(1×10vol)和DMF(2×10vol)洗涤树脂。通过Kaiser显色试验确认Dde脱保护的完成。

第5步：Fmoc-Glu-OtBu与棕榈酸的偶联

步骤(5a)：Fmoc-Glu-OtBu的偶联

将DMF(10vol)中Fmoc-Glu-OtBu(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)的澄清混合物加入到树脂中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在45-55℃将悬浮液缓慢搅拌30分钟。通过Kaiser显色试验监控反应进程。反应完成后，排出反应溶剂，用DMF(4×10vol)洗涤树脂。

步骤(5b)：Fmoc-脱保护

在树脂中加入第一批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃缓慢搅拌悬浮液10分钟。排出溶剂，在树脂中加入第二批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在25-30℃下将悬浮液搅拌10分钟。排出溶剂并用DMF(2×10vol)和IPA(1×10vol)和DMF(2×10vol)洗涤树脂。通过Kaiser显色试验确认Fmoc脱保护的完成。

步骤(5c)：棕榈酸的偶联

将DMF(10vol)中棕榈酸(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)的澄清混合物加入到树脂中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在45-55℃将悬浮液缓慢搅拌30分钟。通过Kaiser显色试验监控反应进程。反应完成后，排出反应溶剂，用DMF(4×10vol)洗涤树脂。

步骤6：D-利拉鲁肽的制备

将步骤5中得到的2-CTC树脂结合保护片段装入肽合成瓶中。使树脂悬浮在二氯甲烷(DCM)(10vol)中10分钟，其中不进行搅拌。在树脂中加入TFA：TIPS：DODT：水(8.5：0.5：0.5：0.5vol)的混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃将悬浮液缓慢搅拌3.0h。通过烧结漏斗对树脂进行过滤。在0-10℃，将滤液加入到预冷的MTBE混合物中。加入完成后，在0-35℃下将反应混合物搅拌1.0h以沉淀出灰白色固体。然后将沉淀的固体通过巴克纳漏斗进行过滤，并用MTBE进行洗涤。然后将抽吸干燥的固体在真空烘箱中35-40℃下进行干燥，直到获得恒重的D-利拉鲁肽。

步骤7：D-利拉鲁肽的纯化

步骤(7a)：纯化-1

将整体脱保护后得到的3.6g D-利拉鲁肽溶于300mL缓冲液A中，用约0.5mL氢氧化铵溶液调节pH为8.5-9.5。用以下参数进行纯化：

柱规格：250x50毫米SS

介质规格：C-18(第3代)，10μ，100A°

流动相A：0.01M碳酸氢铵，流动相B：乙腈，

汇集标准：将HPLC纯度≥85％且单个最大杂质≤3％的级分汇集以用于纯化2。

将HPLC纯度≤85％且≥60％的级分汇集以用于再纯化。

步骤(7b)：纯化-2

将肽含量为900毫克的纯化-1的汇集级分用等量的纯化水进一步进行稀释，并按以下参数进行纯化：

柱规格：250x50毫米SS

介质规格：C-18(第3代)，10μ，100A°

流动相A：水中的0.1％TFA，流动相B：乙腈，

汇集标准：将HPLC纯度≥96％且单个最大杂质≤0.5％的级分汇集以用于纯化3。

将HPLC纯度≤96％且≥85％的级分汇集以用于再纯化。

步骤(7c)：纯化-3

将肽含量为1200毫克的纯化-2的汇集级分用等量的纯化水进一步进行稀释，并按照如下所述进行纯化：

柱规格：250x50毫米SS

介质规格：C-18(第3代)，10μ，100A°

流动相A：水中的0.05％氢氧化铵，流动相B：乙腈，流动相C：水中的3％醋酸铵，流动相D：纯化水

汇集标准：将HPLC纯度≥98％且单个最大杂质≤0.3％的级分汇集以用于浓缩。

将HPLC纯度≤98％且≥96％的级分汇集以用于再纯化。

将来自纯化-3的汇集级分浓缩并进行冻干，得到灰白色至白色粉末的纯D-利拉鲁肽(I)。

所得到的D-利拉鲁肽具有不低于99.0％的HPLC纯度，且分离产率在9-12％的范围内。

实施例2

D-索马鲁肽的合成

按照以下工艺合成D-索马鲁肽。

步骤1至步骤4：按照用于合成D-利拉鲁肽制剂的实施例1中所述工艺的步骤1至4进行。

步骤5：Fmoc-PEG2-CH₂-COOH、Fmoc-PEG2-CH₂-COOH、Fmoc-Glu-OtBu和18-TBu-18-氧代十八烷酸的偶联

按照以下方案以分步方式进行耦联：

步骤(5a)：Fmoc-PEG2-CH₂-COOH的偶联

将DMF(10vol)中Fmoc-PEG2-CH₂-COOH(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)的澄清混合物加入到树脂中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在45-55℃将悬浮液缓慢搅拌30分钟。通过Kaiser显色试验监控反应进程。反应完成后，排出反应溶剂，用DMF(4×10vol)洗涤树脂。

步骤(5b)：Fmoc-脱保护

在树脂中加入第一批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃将悬浮液缓慢搅拌10分钟。排出溶剂，在树脂中加入第二批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在25-30℃下将悬浮液搅拌10分钟。排出溶剂并用DMF(2×10vol)和IPA(1×10vol)和DMF(2×10vol)洗涤树脂。通过Kaiser显色试验确认Fmoc脱保护的完成。

步骤(5c)：Fmoc-PEG2-CH₂-COOH的偶联

将DMF(10vol)中的Fmoc-PEG2-CH₂-COOH(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)的澄清混合物加入到树脂中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在45-55℃将悬浮液缓慢搅拌30分钟。通过Kaiser显色试验监控反应进程。反应完成后，排出反应溶剂并用DMF(4×10vol)洗涤树脂。

步骤(5d)：Fmoc-脱保护

在树脂中加入第一批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃将悬浮液缓慢搅拌10分钟。排出溶剂并在树脂中加入第二批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在25-30℃下将悬浮液搅拌10分钟。排出溶剂并用DMF(2×10vol)和IPA(1×10vol)和DMF(2×10vol)洗涤树脂。通过Kaiser显色试验确认Fmoc脱保护的完成。

步骤(5e)：Fmoc-Glu-OtBu的偶联

将DMF(10vol)中Fmoc-Glu-OtBu(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)的澄清混合物加入到树脂中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在45-55℃将悬浮液缓慢搅拌30分钟。通过Kaiser显色试验监控反应进程。反应完成后，排出反应溶剂并用DMF(4×10vol)洗涤树脂。

步骤(5f)：Fmoc-脱保护

在树脂中加入第一批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃将悬浮液缓慢搅拌10分钟。排出溶剂并在树脂中加入第二批次DMF(10vol)中有20％哌啶的澄清混合物。在25-30℃下将悬浮液搅拌10分钟。排出溶剂并用DMF(2×10vol)和IPA(1×10vol)和DMF(2×10vol)洗涤树脂。通过Kaiser显色试验确认Fmoc脱保护的完成。

步骤(5g)：18-tBu-18-氧代十八烷酸的偶联

将DMF(10vol)中18-tBu-18-氧代十八烷酸(2.0当量)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(2.0当量)和1-羟基苯并三唑(HOBt)(2.0当量)的澄清混合物加入到树脂中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在45-55℃将悬浮液缓慢搅拌30分钟。通过Kaiser显色试验监控反应进程。反应完成后，排出反应溶剂，并用DMF(4×10vol)洗涤树脂。

步骤6：D-索马鲁肽的制备

将步骤5中得到的2-CTC树脂结合保护片段装入肽合成瓶中。使树脂悬浮在二氯甲烷(DCM)(10vol)中10分钟，其中不进行搅拌。在树脂中加入TFA：TIPS：DODT：水(8.5：0.5：0.5：0.5vol)的混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25-30℃将悬浮液缓慢搅拌3.0h。通过烧结漏斗对树脂进行过滤。在0-10℃，将滤液加入到预冷的MTBE混合物中。加入完成后，在0-35℃下将反应混合物搅拌1.0h以沉淀出灰白色固体。然后将沉淀的固体通过巴克纳漏斗进行过滤，并用MTBE进行洗涤。然后将抽吸干燥的固体在真空烘箱中35-40℃下进行干燥，直到获得恒重的D-利拉鲁肽。然后将抽吸干燥的固体在真空烘箱中35-40℃下干燥至恒定重量以提供D-索马鲁肽。

实施例3

(L-Ala)-利拉鲁肽和(D-Ala)-利拉鲁肽的纯化

固相合成得到的(L-Ala)-利拉鲁肽(天然)和(D-Ala)-利拉鲁肽的粗品的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将固相合成得到的100mg利拉鲁肽粗品溶于0.01M碳酸氢铵和25％氨水中，并用0.2微米的过滤器进行过滤，得到利拉鲁肽粗品溶液。

步骤2：用10*250mm的Phenominex C18(3代)100A，10微米柱，使用0.01M碳酸氢铵作为流动相A，乙腈作为流动相B，以表1中提到的梯度洗脱，从而对利拉鲁肽(L-Ala)-利拉鲁肽和(D-Ala)-利拉鲁肽粗品溶液进行第一次HPLC纯化。收集目标峰并用RP-HPLC分析纯度和含量。

表1：HPLC显示了流动相B对利拉鲁肽粗品的洗脱

图3和图4显示了纯度分别为50.4％和15.1％的利拉鲁肽和D-利拉鲁肽粗品的RP-HPLC图。

图5和图6描绘了利拉鲁肽和D-利拉鲁肽目标峰的色谱图。用于利拉鲁肽和D-利拉鲁肽的所汇集的冻干纯化级分显示RP-HPLC纯度分别为93.1％和90.0％(分别为图7和图8)。

详情如下表2所示：

表2：纯化工艺收率的总结

实施例4

利拉鲁肽和D-利拉鲁肽的生物学特性

基于对大鼠甲状腺C-细胞系6-23(克隆6)中腺苷酸环化酶活性的刺激来确定内部产品的体外效力。GLP-1受体的激活引发级联事件，其最终导致细胞内cAMP浓度升高，使用cAMP ELISA试剂盒进行确定及与RMP(Victoza)比较。

采用Graph Pad Prism软件进行统计分析。

如图9所分别描述的，所观察到的参照物(Victoza)的EC50值为1.99ng/ml，合成的利拉鲁肽和D-利拉鲁肽的EC50值为1.82ng/ml和1.43ng/ml。

实施例5

利拉鲁肽和D-利拉鲁肽在糖尿病(DM-2)Wistar大鼠中的药代动力学(PK)分析

链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)优先对胰岛β细胞有毒性，常用于包括Wistar大鼠的众多物种的2型糖尿病(DM-2)模型。选择12-14周龄雄性Wistar大鼠(体重300-380克)用于研究。根据随意进食(ad-lib fed)的血糖和体重将大鼠随机分为不同组。通过在对照组和试验组中单次腹腔内注射60mg/kg STZ(n＝6)链脲佐菌素两周，来诱导Wister大鼠的糖尿病(DM)。

在注射STZ前记录所有动物的基础葡萄糖水平。在STZ处理15天后，再次评估所有动物升高的血液水平。在确认有高的葡萄糖水平后，通过皮下途径，采用单剂量(5mg/kg)的利拉鲁肽和D-利拉鲁肽对动物进行治疗。

在0(给药前)、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120和144h、(给药后)采集血液样品。在每个时间点，在轻度异氟醚麻醉下，通过后眼眶丛抽取大约0.3mL的血液在标记的微量离心管中。所有血液样品在4℃的设定温度下，以7000rpm的速度离心5分钟。在离心后，将血清分离并在-80℃保存以进行进一步分析。

采用Cloud-Clone公司(CEV769GE96测试)试剂盒，进行ELISA以定量测量血清样品中的利拉鲁肽。该试剂盒采用竞争性抑制酶抑制试验技术。利拉鲁肽和D-利拉鲁肽这两组的所有血清样品都使用样品稀释缓冲液进行1:100的稀释，并在ELISA中使用标准图在不同时间点测试利拉鲁肽的存在。

使用非房室模型，通过PK求解器软件运行在ELISA和统计分析完成后获得的数据，以确定如表3和图10所示的PK参数(T_1/2、C_max、T_max、AUC_0-t和MRT)。

表3：两组(利拉鲁肽和D-利拉鲁肽)的PK参数比较表

对D-利拉鲁肽进行研究是为了探讨延迟吸收是否能够延长给药间隔而不影响预测的临床疗效，从而降低治疗成本，提高处方依从性，并有利于动物福利。结果显示，检测出在利拉鲁肽和D-利拉鲁肽之间存在显著差异(用于SC给药时，半衰期(T1/2)分别为24.77hr对54.44hr)。因为发现D-利拉鲁肽的AUC值是利拉鲁肽的3倍，所以D-利拉鲁肽的绝对生物利用度是非常高的。D-利拉鲁肽较高的Cmax值也支持了上述发现。

实施例6

相对于皮下途径，D-利拉鲁肽的口服生物利用度

进行药代动力学研究的第二阶段以了解相对于皮下途径D-利拉鲁肽的口服生物利用度。通常，由于蛋白质和肽在胃肠道中被酶大量降解以及穿过胃肠道粘膜的渗透性有限，所以显示出较差的口服生物利用度。它们的口服生物利用度小于1％。

将7-9周龄的健康雄性成年大鼠随机分为两组。以6mg/kg向对照组皮下施用Victoza，以15mg/kg向实验组口服施用D-利拉鲁肽试验微粒。按照表4采集血液样品，评估血液中利拉鲁肽的含量以用于进行PK比较。

表4：利拉鲁肽PK研究

评估血浆样品中的利拉鲁肽：

制备SD大鼠血浆中50×剂量的利拉鲁肽，并在试验缓冲液(HBSS与IMBX、MgCl₂和Ro)中将其稀释。然后通过胰蛋白酶消化和离心获得过表达GLP-1R的细胞[(CHOK1/GLP1/Gα15)目录号M00451批号:R10081093-12)]。然后用试验缓冲液洗涤这些细胞。以15k/孔/15uL的细胞接种，加入15μL的2×剂量，将板在37℃孵育30分钟。然后使用cAMP评估试剂盒(Promega camp-glo^TMMax Assay Cat No：V1682)V1682)评估cAMP产品。孵育30分钟后，将20μL蛋白激酶A溶液加入板中，在室温下孵育20分钟。然后在室温下将50μL底物加入到板中10分钟

在读板仪(plate reader)上读取发光。使用根据表5每次运行生成的校准曲线反算血浆中的利拉鲁肽含量。反算采用Gen5软件。利拉鲁肽的临床前PK参数见表6。

表5：校准曲线表

表6：利拉鲁肽的临床前PK参数

由于消化酶降解、疏水性等，肽类药物在口服给药方面总是面临挑战。需要5-10分钟的生理活性形式的GLP-1，另外，葡萄糖波动所需的GLP-1浓度为个位数或较低的两位数pM。即使在使用DPP-IV抑制剂后，循环的GLP-1浓度也高达50-60pM，这被证明是具有临床意义的。

口服施用D--利拉鲁肽和皮下施用Victoza的PK曲线如图11所示。口服施用的D-利拉鲁肽显示cmax为1.5ng/ml，对应于400pM。由于生理上GLP1 R激活需要在餐后90-150分钟。循环水平为60pM的GLP-1足以改善葡萄糖耐量。在3只动物中观察到的D-利拉鲁肽400pM的水平可能是治疗可行的选择。即使考虑到与本研究中D-利拉鲁肽循环浓度相比，利拉鲁肽的效力较低(2-5倍)，也可能足以显著改善葡萄糖耐量。