具体实施方式

下面对本发明的实施例做出说明。

本发明设计出一种氟虫腈的结构类似物，并以此作为半抗原制备出一种特异性较好的人工抗原，并在此基础上制备出抗氟虫腈的高特异性抗体，进而应用于氟虫腈及其代谢产物残留量的检测。

一种氟虫腈人工半抗原，其结构类似氟虫腈，这种氟虫腈结构类似物可以突出抗原决定簇，具有较高的特异性，结构如式1所示，

式1；

其中，n≤6。

制备氟虫腈人工半抗原的方法，将2,6-二氯-4-三氟甲基苯肼和式2化合物化学合成得到式3化合物；再将式3化合物与碱反应制得式1化合物，即氟虫腈人工半抗原；

式2；

式3；

其中碱优选为LiOH、NaOH或KOH。

具体步骤如下：

步骤一：向容器中加入溶剂、冰乙酸、式2化合物和2,6-二氯-4-三氟甲基苯肼，搅拌旋蒸后，萃取得到式3粗产物；

步骤二：向容器中加入溶剂、碱和干燥后的式3粗产物，搅拌后调pH值至酸性，旋蒸后萃取得到式1化合物，即为氟虫腈人工半抗原；

其中，通过乙酸乙酯和水萃取得到粗产物或氟虫腈人工半抗原。2,6-二氯-4-三氟甲基苯肼、式2化合物和碱可任意比混合，为了提高反应效率，降低生产成本，优选摩尔比为1:1:1。

以n = 1，碱为LiOH·H₂O为例，可按照如下流程制备氟虫腈人工半抗原的方法，

具体步骤如下：

向容器中加入乙醇5-50mL、冰乙酸1-10μL、乙酰乙酸乙酯20-100μL和2,6-二氯-4-三氟甲基苯肼0.5-5g，搅拌旋蒸后，通过乙酸乙酯和水萃取得到粗产物；

向容器中加入乙醇50-100mL、水20-60mL、LiOH·H₂O 0.5-5g和干燥后的粗产物，搅拌后调pH值至酸性，旋蒸后通过乙酸乙酯和水萃取得到氟虫腈人工半抗原。

一种氟虫腈抗原，结构式如式4所示，

式4；

其中，

蛋白质为BSA、HSA、KLH或OVA。

制备氟虫腈抗原的方法，氟虫腈人工半抗原通过生物偶联剂连接载体蛋白后得到氟虫腈抗原；具体步骤如下：

在DMF中加入氟虫腈半抗原10mg，加入 10-20 mgEDC和 5-10 mg NHS，混匀得到预混液；

将10mg载体蛋白溶于10mL 0.1M NaHCO₃溶液中，与预混液混合后搅拌反应，PBS透析得到氟虫腈抗原，-20℃保存。

一种氟虫腈抗体，用氟虫腈抗原免疫小鼠得到的能够与氟虫腈发生特异性免疫反应的单克隆或多克隆抗体。氟虫腈抗原与免疫佐剂混合后再用于注射；免疫佐剂为弗氏完全佐剂、氢氧化铝佐剂、明矾佐剂或脂质体。

氟虫腈抗体在氟虫腈检测中的应用，氟虫腈抗体用于体外诊断试剂盒或微流体芯片，所述体外诊断试剂盒为胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。

下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。

实施例1：氟虫腈人工半抗原的合成

向烧瓶加入乙醇25mL、冰乙酸10μL、乙酰乙酸乙酯2.95mL和2,6-二氯-4-三氟甲基苯肼5g，搅拌3小时，旋蒸后用乙酸乙酯和水萃取并干燥。

向烧瓶中加入乙醇80mL、水40mL、LiOH·H₂O 0.98g和上一步干燥后得到的化合物搅拌4小时后用HCl调pH至酸性，旋蒸后萃取并干燥，从而获得氟虫腈人工半抗原1，化学结构式如下所示：

。

实施例2：氟虫腈人工半抗原的合成

向烧瓶中加入25mL乙醇、2,6-二氯-4-三氟甲基苯肼5g，50μL冰乙酸、7-乙酰基庚酸乙酯4.39g，搅拌反应2小时，旋蒸溶剂除去乙醇，用乙酸乙酯和水萃取两次合并有机相，无水硫酸钠干燥后浓缩。

向烧瓶依次加入乙醇100mL、水50mL、LiOH.H₂O 0.98g和上步所得化合物搅拌1.5小时后，用HCl调ph至酸性，旋蒸溶剂除去乙醇，用乙酸乙酯和水萃取两次合并有机相，无水硫酸钠干燥旋蒸除去溶剂得到氟虫腈人工半抗原2，化学结构式如下所示：

。

实施例3：氟虫腈人工抗原的制备

量取5mL无水DMF于棕色小瓶中，称取10mg实施例1制得的氟虫腈人工半抗原1溶于DMF。在搅拌状态下分别加入 10mgEDC和 5mg NHS，室温搅拌2小时。

称取10mg BSA溶于10mL 0.1M NaHCO₃溶液中，取上述溶液加入到BSA溶液中。室温搅拌4小时，用PBS透析后分装，得到氟虫腈人工抗原1，-20℃保存。

本实施例中，载体蛋白BSA还可为其他载体蛋白，如HSA、KLH、OVA等。

实施例4：氟虫腈人工抗原的制备

量取5mL无水DMF于棕色小瓶中，称取10mg实施例2制得的氟虫腈人工半抗原2溶于DMF。在搅拌状态下分别加入 10mg EDC和5mg NHS，室温搅拌2小时。

称取10mg BSA溶于10mL 0.1M NaHCO₃溶液中，取上述溶液加入到BSA溶液中。室温搅拌4小时，用PBS透析后分装，得到氟虫腈人工抗原2，-20℃保存。

本实施例中，载体蛋白BSA还可为其他载体蛋白，如HSA、KLH、OVA等。

实施例5：抗氟虫腈单克隆抗体的制备

实验选用6-10周龄的小鼠，免疫5-10只小鼠，将制备的氟虫腈人工抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射，剂量为5ug/只，以后，每隔三周，取抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共四次，最后一次以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，三天后取脾细胞进行融合。再经3-4次有限稀释法克隆筛选得细胞株，经多次体外传代和多次冻存复苏后细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体，经扩大培养后，用于抗体制备和液氮保存。

实施例6：抗氟虫腈多克隆抗体的制备

实验选用半周岁左右，体重为2-3公斤，健康的雄性家兔，每种免疫原免疫三只兔子，分别编号兔子1-3。实验免疫计量基础免疫为0.5-1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.0-1.5mg/kg，用生理盐水稀释适量的人工抗原，加入等体积弗氏完全佐剂（加强免疫时采用弗氏不完全佐剂），充分乳化，直至滴入水中不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点，大腿肌肉注射2点，3周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后第8天，从兔子耳缘静脉取血，测定效价和特异性。

待免疫血清效价上去后，就可进行采血。本实验采用颈动脉取血法。采血后，将采血瓶放置在37℃温箱中半小时，待瓶中的血液凝固，然后用接种针沿瓶内壁将血块与玻璃脱离，再放到4℃温箱中3-4小时，待血块收缩后，用毛细血管将血清吸入试管中，离心，分离出血清。

实施例7：ELISA检测方法的建立

ELISA检测方法建立：包被：将氟虫腈人工抗原1/氟虫腈人工抗原2按照一定浓度加到酶标板中，37℃孵育3 h。洗板：甩掉孔中液体，用洗涤液 PBST洗板3次。封闭：加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭1 h，洗板3次。加样：将氟虫腈标准品或待测样品，分别加入酶标板中，50μL/孔；再加入一定浓度的抗氟虫腈抗体，50μL/孔37℃孵育1 h后洗板4次。加酶标二抗：将一定浓度的羊抗鼠或羊抗兔酶标二抗，加到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1 h，洗板5次。显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色20 min。终止：加入终止液，50μL/孔，混匀。读数：用酶标仪读取450 nm波长下各孔OD值，计算抑制率，绘制标准抑制曲线并计算出待测液中氟虫腈的浓度。

间接竞争ELISA检测方法的建立，由实验结果所建立标准抑制曲线，根据曲线的线性方程 y = a lnx + b 求出 IC₅₀值（抑制为50%所对应氟虫腈的浓度）和 IC₁₅值（抑制为15% 所对应的氟虫腈标准品的浓度)。以IC₅₀值作为该方法的灵敏度，以IC₁₅值作为该方法的最低检测限（LOD）。同时精密度测定结果也证明该方法可重复性良好。标准曲线如图1图2所示。精密度测定结果也证明该方法可重复性良好。

实施例8 ：交叉反应率

参考上述ELISA方法，将氟虫腈标准品分别换成氟虫腈代谢产物及其结构类似物氟虫腈砜、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟乐灵、氟虫脲、伏虫隆。以氟虫腈人工抗原1为抗原，其他步骤操作方法同ELISA。以不同抗原和抗原结构类似物做竞争抑制曲线，计算交叉反应率。实验结果如表1.所示。

表1. 氟虫腈检测方法的交叉反应

从表1.结果能够看出：本发明案例中所制备的氟虫腈人工抗原，对于氟虫腈及其代谢产物氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜具有良好的亲和性，而与其他氟虫腈结构类似物并不能发生特异性结合。

实施例9：样品检测

消除基质：本发明可用于检测蔬菜、水果及肉、蛋、奶中的氟虫腈及其代谢产物。将待测样品通过提取后进行适当稀释，以氟虫腈人工抗原1为抗原，可直接用于ELISA检测。例如，蔬菜样品可使用甲醇提取后，用PBST稀释后进行检测。在确定检测方法及稀释液之后，作添加回收实验验证实验条件的准确性。结果如表2.所示。

表2. 样品检测准确率

实施例10：胶体金免疫层析检测方法的建立

胶体金标记抗体：用0.1mol/L K₂CO₃将1 mL的胶体金调至最适pH。混匀。加入适量的抗体，混匀，室温静置15 min。加入BSA封闭液，混匀后室温静置15 min，再加入10%PEG2000水溶液，混匀后静置15 min，3000 r/min离心，去掉沉淀，10000 r/min离心后，弃去上清，将沉淀用胶体金工作液重悬。

铺金：将重悬后的金标抗溶液按10-20 μL/cm均匀铺在金标垫上，于37℃干燥。

划膜：利用划膜仪将氟虫腈人工抗原1和二抗分别固定在纤维素膜上，其中人工抗原的固定位置为检测线（T线），二抗位置为质控线（C线）。划膜后于37℃干燥。

组装：在PVC板上分别粘贴纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫，然后用全自动斩切机切成宽度为2-5mm试纸条，密封干燥保存。

样品检测：取100 μL不同浓度的氟虫腈标准品或待测样品稀释液分别滴于试纸条的样品垫上，阴性对照为等体积的PBS溶液。经过一段时间的层析作用后观察T、C线显色情况。

对制作得到的胶体金试纸条进行测试，采用不同浓度的氟虫腈标准品点样，如图3所示，氟虫腈标准品从左至右浓度依次为0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml，检测线也根据不同的氟虫腈浓度显色深浅不同，证明此检测方法建立成功，且具有较高灵敏性。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。