阅读说明：本技术 3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙及用其检测呼出气中乙偶姻含量的方法 (3-hydroxy-2-butanone-2, 4-dinitrophenylhydrazone and method for detecting content of acetoin in exhaled breath by using same ) 是由 温铁芳 赵伟军 周伟 汪小知 张厚德 郝雷 段兴斌 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种3-羟基-2-丁酮-2,4-二硝基苯腙及用其检测呼出气中乙偶姻含量的方法,属于生物化工领域。一种3-羟基-2-丁酮-2,4-二硝基苯腙,其特征在于,该化合物的结构式如式(I)所示：<Image he="572" wi="700" file="DDA0002527212260000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明的3-羟基-2-丁酮-2,4-二硝基苯腙是一种新化合物,且能够用来检测人体呼出气中乙偶姻的含量,开拓了新的应用领域。(The invention provides 3-hydroxy-2-butanone-2, 4-dinitrophenylhydrazone and a method for detecting the content of acetoin in exhaled breath by using the same, and belongs to the field of biochemical engineering. The 3-hydroxy-2-butanone-2, 4-dinitrophenylhydrazone is characterized in that the structural formula of the compound is shown as the formula (I): the 3-hydroxy-2-butanone-2, 4-dinitrophenylhydrazone is a new compound, can be used for detecting the content of acetoin in exhaled breath of a human body, and develops a new application field.)

3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙及用其检测呼出气中乙偶姻 含量的方法

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙及用其检测呼出气中乙偶姻含量的方法。

背景技术

人体呼出气体是直接由肺呼出，最早由Pauling等人在1971年采集了正常人的呼出气体，并检测到其中250种挥发性有机物。

人体呼出气体中的挥发性有机物与疾病的诊断息息相关，这些挥发性有机物中包含有乙偶姻(又名3-羟基2-丁酮)，若检测到呼出气中有乙偶姻，则代表该人可能患有某种疾病例如肺癌，而呼出气中测出乙偶姻的含量则可以一定程度上代表该种疾病的严重程度，疾病的确诊需要后续的进一步的诊断。但是前期人体呼出气中乙偶姻的检测，是一种非入侵式检测，对于早期疾病的预防具有重要的意义。

对于呼出气挥发性成分而言，样品成分复杂，现有的人体呼出气中的检测大多为定性检测，而无法定量的检测出含量。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙；本发明的第二个目的是提供一种用3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙检测呼出气中乙偶姻含量的方法。

本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙，其特征在于，该化合物的结构式如式(I)所示：

本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现：一种用3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙检测呼出气中乙偶姻含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01：3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙标准品的制备；

S02：收集人体呼出气，并进行衍生化反应，得到含有乙偶姻-DNPH的待测液；

S03：将步骤S01中的3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙标准品配置成浓度不同的标准品溶液，并用检测仪器对标准溶液进行检测，绘制工作曲线；

S04：将含有乙偶姻-DNPH的待测液用检测仪器进行检测，带入工作曲线，得到人体呼出气中乙偶姻的含量。

优选地，3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙标准品的制备包括如下步骤：

(a)、将2，4-二硝基苯肼加入有机溶剂中溶解，配置成2，4-二硝基苯肼饱和溶液，再往2，4-二硝基苯肼饱和溶液中加入酸性溶液，得到酸性饱和2，4-二硝基苯肼溶液；将3-羟基-2-丁酮加入有机溶剂中溶解，配置成3-羟基-2-丁酮溶液，在恒定的温度下，边搅拌边往酸性饱和2，4-二硝基苯肼溶液中加入3-羟基-2-丁酮溶液；完成反应后，将反应溶剂蒸干得到固体样品；

(b)、利用液相色谱和二极管阵列连用检测器，色谱流动相为100％的乙腈，固体样品用乙腈溶解并过滤，在360nm波长下，进行固体样品中反应物2，4-二硝基苯肼与反应产物的分离；

(c)、将分离后的反应产物溶于有机溶剂中，配置浓度为10ppm的溶液待用，利用液相色谱和二极管阵列连用检测器在200nm-400nm检测10ppm的溶液，利用面积归一化法计算3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的纯度。

优选地，步骤(a)中，所述3-羟基-2-丁酮与2，4-二硝基苯肼的摩尔比为1：1-3。

优选地，步骤(a)中，酸性饱和2，4-二硝基苯肼溶液中及用来溶解3-羟基-2-丁酮的有机溶剂中均含有0.005％体积分数的氢离子。

优选地，步骤(a)中，酸性饱和2，4-二硝基苯肼溶液放置于60℃的恒温水浴中进行反应；反应时间≥1小时。

优选地，步骤(c)中，分离后的反应产物检测所选波长为254nm、300nm、360nm；所用色谱流动相为乙腈：水＝70％：30％，流速为0.4mL/min。

优选地，步骤S02中，将人体呼出气通入附着有衍生试剂的吸附装置，用洗脱剂洗脱吸附装置，得到待测液；所述的吸附装置为吸附采样管，所述的吸附采样管采用如下步骤制备：

(1)将衍生试剂用乙腈配置成含有衍生试剂的含量为3％的涂渍液；

(2)将固定相填料填充到空白吸附柱上；

(3)将涂渍液涂渍在装填固定相的吸附柱上，最后用氮气吹干，4℃密封冷藏保存；

所述的衍生试剂的化学式为R-NH-NH₂，制备过程中在低醛酮环境中进行，要求以甲醛计≤0.1μg，以丙酮计≤0.25μg。

优选地，所述的衍生试剂为2，4-二硝基苯肼。

优选地，步骤S02中，对收集的人体呼出气进行加热恒温处理，处理的温度在40-70℃之间，然后以恒定的流速流经吸附装置，再用洗脱剂洗脱吸附装置，过滤得到待测液；人体呼出气流经吸附装置的流速在5-1000mL/min之间。

本发明的工作原理：3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙采用的合成路线如下：

3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙能用于检测人体呼出气中乙偶姻含量，通过收集人体呼出气，将其进行衍生化反应，得到衍生产物乙偶姻-DNPH，并通过合成制备乙偶姻-DNPH标准工作溶液，目前在市面上没有可以提供乙偶姻-DNPH的厂家，故本发明通过合成反应来进行自行合成，并在合成后对其进行提纯及提纯后的纯度测试。当提纯后的纯度大于98％时，则可用来作为标准品使用。

然后将3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙标准品配置成浓度不同的标准品溶液，并用检测仪器对标准溶液进行检测，绘制工作曲线；将乙偶姻-DNPH待测液用检测仪器进行检测，带入工作曲线，得到人体呼出气中乙偶姻的含量。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明的3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙是一种新化合物，且能够用来检测人体呼出气中乙偶姻的含量，开拓了新的应用领域。

2.本发明的3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的合成方法的反应条件简单不苛刻，流程短，综合收率高，收率在85％以上。

3.采用本发明的方法合成并提纯得到的反应产物，反应产物中的3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的纯度高，能达到98％以上。

3.本发明的3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙合成路线简单、成本低廉、操作处理方便安全，是一条适用于产业化的工艺路线。

附图说明

图1为本发明的3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的光谱图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

准备一定量的2，4-二硝基苯肼(DNPH)试剂于烧杯中，加入乙腈溶解，配成DNPH过饱和溶液，将上层溶液转移到另一个烧杯中(上层的溶液即为饱和DNPH溶液)，向该饱和DNPH溶液中加入浓盐酸(浓盐酸为实验室用浓盐酸，含量在36％-38％之间)，得到酸性饱和2，4-二硝基苯肼溶液，酸性饱和2，4-二硝基苯肼溶液中含有0.005％体积分数的氢离子。

将3-羟基-2-丁酮加入乙腈中溶解，配置成3-羟基-2-丁酮溶液，该乙腈中含有0.005％体积分数的氢离子，将上述酸性饱和DNPH溶液放入到恒温60℃水浴中，待酸性饱和DNPH溶液温度达到60℃后，往酸性饱和DNPH溶液中加入3-羟基-2-丁酮溶液。3-羟基-2-丁酮的加入量和2，4-二硝基苯肼的量的摩尔比为1：1。3-羟基-2-丁酮溶液分少量多次加入并同时不断搅拌溶液，让反应充分进行,反应时间1.5小时，反应完成后将反应溶剂完全蒸发至干，得到固体样品。

定性检测：将固体样品取微量，用乙腈溶解并过滤，用LC-PDA(液相色谱和二极管阵列连用检测器)进行定性检测，所用波长为3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的最佳吸收波长360nm。在360nm的波长下，色谱出峰，表示固体样品中存在目标产物3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙。3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的光谱图如图1所示。

利用液相色谱和二极管阵列连用检测器，在最大吸收波长360nm下，将固体样品用乙腈溶解并过滤，分离DNPH与反应产物，提纯得到反应产物。反应产物的收率为92％。

纯度测试：先配置浓度为1000ppm的反应产物乙腈溶液，随后将溶液稀释配置成10ppm、1ppm的标准工作溶液备用待测；

利用LC-MS/MS定性确认纯化后的物质是否是目标物，进样浓度为1ppm；

连接仪器，利用LC-PDA检测器在254nm、300nm、360nm下检测10ppm的标准工作溶液，利用面积归一化法计算3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的纯度。所用色谱流动相为乙腈：水＝70％：30％，流速为0.4mL/min。

面积归一化法计算标记物纯度如表1所示。测得反应产物中，3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的纯度为99.8％。

表1面积归一化法计算标记物纯度

实施例2

3-羟基-2-丁酮的加入量和2，4-二硝基苯肼的量的摩尔比为1：2，其他同实施例1。测得反应产物的收率为97.6％，提纯后3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的纯度为99.42％。

实施例3

3-羟基-2-丁酮的加入量和2，4-二硝基苯肼的量的摩尔比为1：3，其他同实施例1。测得反应产物的收率为99.7％，提纯后3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙的纯度为98.83％。

吸附采样管的制备

将2，4-二硝基苯肼(DNPH)用乙腈配置成含有衍生试剂的含量为3％的涂渍液；再将固定相填料200mg填充到空白吸附柱上；最后将涂渍液涂渍在装填固定相的吸附柱上，涂渍方法采用直接涂渍法进行。涂渍前先用乙腈润洗空白吸附柱，负压固相萃取系统除去润洗的乙腈试剂，然后将3％的涂渍液直接涂渍在吸附柱上，涂渍饱和后采用负压固相萃取系统除去多余的涂渍液，制成能够进行选择性吸附呼出气醛酮类物质的选择性吸附柱，用氮气吹干吸附柱并在4℃下密封保存待用。制备过程中需要在低醛酮环境中进行，要求以甲醛计≤0.1μg，以丙酮计≤0.25μg。固定相可以选用硅胶填料、C18填料和弗洛里硅藻土填料中的一种或任意组合。

气袋的预处理

先对气袋进行预处理，气袋可以是泰德拉气袋或者nalophen或者PFV或者其他材质的气袋。

将气袋放入恒温控制箱中，温度设定在60℃之间，再往气袋内充入氮气，氮气在气袋内停留3-5分钟，再抽出氮气，重新通入氮气，反复4次后，进行气袋的清洁验证。

改变温度、清洗次数、通入的气体，其他步骤同上。

气袋的清洁验证：气袋清洗完成后，充入3L的氮气，加热50℃恒温条件下，用吸附采样管吸收，将袋子的气体全部吸收完成，吸附采样管用溶剂洗脱并定容至2mL过滤测试背景，背景测试满足要求后(采样袋背景中测定的标记物定量结果醛类物质以甲醛计，换算后结果以甲醛计≤0.1μg，酮类物质以丙酮计，换算后结果以丙酮计≤0.25μg)，袋子才能使用。

实验证明：当温度在60-80℃，往气袋内通入氮气或者氦气，在气袋内停留30分钟，抽出再通入，反复4-8次，其背景测试均能满足要求。

含量的测定

人往气袋内吹入气体，气袋收集人体呼出气3L，对收集到的人体呼出气随气袋一起进行加热处理，将温度控制在40℃，控制精度要求±0.5℃。

在40℃的温度下，将人体呼出气全部以20mL/min的流速流经吸附采样管，吸附采样管的温度也控制在40℃，控制精度要求±0.5℃。吸附采样管选择性的吸收人体呼出气中的醛酮类物质。

再用洗脱剂乙腈洗脱吸附采样管，洗脱后的溶液过滤，并用乙腈定容至2ml作为待测液，待测液中含有乙偶姻-DNPH，即3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙。

取实施例1的反应产物为3-羟基-2-丁酮-2，4-二硝基苯腙标准品，标准品用乙腈配置成浓度为2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、75μg/L、100μg/L的标准溶液，其对应的乙偶姻的浓度分别为0.8175μg/L、1.635μg/L、3.27μg/L、8.175μg/L、16.35μg/L、24.525μg/L、32.7μg/L，用液相色谱-串联质谱仪对标准溶液进行测定，以浓度含量为横坐标，对应的测定出来的峰面积为纵坐标绘制线性回归工作曲线。得到的标准工作曲线的线性回归方程如下：y＝47071x-1817，R²为0.99984。

以3倍的信噪比处的量作为检测限，以9倍的信噪比处的量作为定量限；

将用液相色谱-串联质谱仪对待测液进行测定，将测定出来的峰面积带入工作曲线，得到待测液中乙偶姻。

气袋收集人体呼出气在0.1L-10L、处理的温度在40-70℃之间、人体呼出气流经吸附装置的恒定流速在5-1000ml/min之间也能够定量检测到人体呼出气中乙偶姻的含量。

利用气相色谱或气相色谱串联质谱也能够定量检测人体呼出气中乙偶姻的含量，也是先对标准溶液进行测定，以浓度含量为横坐标，对应的测定出来的峰面积为纵坐标绘制线性回归工作曲线。再用利用气相色谱或气相色谱串联质谱对待测液进行测定，将测定出来的峰面积带入工作曲线，得到待测液中乙偶姻-DNPH的含量，在根据乙偶姻-DNPH定量换算得到人体呼出气中乙偶姻的含量。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。