具体实施方式

本发明基于(至少部分基于)这样的发现：使用某些抗VSIG4抗体抑制VSIG4与CD8⁺T细胞的相互作用导致CD8⁺T细胞增殖，从而可以导致癌症抑制。

如本文所用，术语“约”在用于述及数值之时，指在上下文中与该值相似的值。一般而言，熟悉相关内容的本领域技术人员将理解就所述相关内容而言“约”所涵盖的差异程度。例如，在一些实施方式中，术语“约”表示与所提及的值相差25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少范围内的值。

本文中，“给药(给予)”通常是指将组合物给予对象或系统以实现物质的递送，所述物质即所述组合物或包含于所述组合物中。本领域普通技术人员知道适当情形下用于对象(如人)给药的各种途径。例如，在一些实施方式中，给药可以是眼部、口服、胃肠外、局部给药等。某些具体实施方案中，给药可以是支气管(如通过支气管灌注)、口颊、皮肤(其可以是或包括例如局部至真皮、真皮内(intradermal)、皮内(interdermal)、透皮等中的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(如肝内)、黏膜、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(如通过气管内灌注)、阴道、玻璃体等。在一些实施方式中，给药/给予仅包括一个剂次。在一些实施方式中，给药/给予可包括施用固定数目的剂次。在一些实施方式中，给药/给予可包括间歇给药(例如在时间上分开的多个剂次)和/或定期给药(例如各剂次间隔相同)。在一些实施方式中，给药可以包括连续给药(如输液)至少选定的一段时间。

如本文所用，术语“亲和力(affinity)”通常指特定配体结合其配体(partner)紧密度的量度。亲和力可用不同方法来测定。在一些实施方式中，亲和力是用定量试验测定的。在一些实施方式中，可以将结合配偶体浓度固定为超过配体浓度，以此模拟生理条件。或者或另外，在一些实施方式中，可改变结合配偶体的浓度和/或配体浓度。在一些实施方式中，可在可比条件(例如浓度)下将亲和力与参照进行比较。

如本文所用，术语“亲和力成熟”指这样的过程，其中抗体由参比抗体(在本文中也称为模板或亲本抗体)演化而来(通常通过对一个或多个氨基酸残基进行突变)，使得对于靶抗原的活性有增于参比抗体的对应形式对相同靶抗原的活性。因此，相较于参比抗体或模板抗体，演化的抗体经优化。如本文所用，术语“亲和力成熟的抗体”通常指相对于参比抗体对靶抗原活性增加的抗体。在一些实施方式中，相较于参比或亲本抗体，亲和力成熟的抗体表现出与靶抗原结合增加。通常，亲和力成熟的抗体与参比抗体结合相同的表位。

本文中，术语“抗体”指这样的多肽，其包含足以令其与特定靶抗原特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件。如本领域所知，天然产生的完整抗体是约150kD的四聚体，其包含两条相同重链多肽(各约50kD)和两条相同轻链多肽(各约25kD)，它们彼此缔合成常说的“Y形”结构。各重链包含至少四个结构域(各长约110个氨基酸)—氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的两个顶端)，其后的三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端的CH3(位于Y的干底部)。称为“转换岔(switch)”的短区域将重链可变区与恒定区相连。“铰链”将CH2和CH3结构域与抗体其余部分相连。完整抗体中，铰链区内的两个二硫键将两条重链多肽彼此相连。各轻链包含两个结构域—氨基末端可变(VL)结构域，其后的羧基末端恒定(CL)结构域，它们通过另一“转换岔”彼此分开。完整抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过一个二硫键彼此相连；另两个二硫键将重链铰链区域彼此相连，从而使得所述二聚体彼此连接形成所述四聚体。天然产生的抗体还是糖基化的，通常在CH2结构域上糖基化。天然抗体中的各结构域具有以“免疫球蛋白折叠”为特征的结构，该结构由压扁的反向平行β桶内两个β折叠(例如3-、4-或5-股折叠)相叠而成。各可变域包含三个称为“互补决定区”CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个某种程度上不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成β折叠提供结构域的结构框架，重链和轻链的CDR环区在三维空间上相互聚拢，从而形成位于Y结构顶端的一个高变抗原结合位点。天然抗体的Fc区结合补体系统的元件，还结合效应细胞上的受体，效应细胞包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域所知，Fc区对于Fc受体的亲和性和/或其它结合属性可通过糖基化或其它修饰来调节。某些实施方式中，据本发明生成和/或使用的抗体包含糖基化的Fc结构域，包括具有经修饰或工程改造的所述糖基化的Fc结构域。就本发明而言，某些实施方式中，包括足够的天然抗体中所见免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽的复合物都可称作和/或用作“抗体”，不论这些多肽是天然产生(例如由生物体对抗原的反应而产生)还是重组工程法产生、化学合成或由其它人工系统或方法产生。某些实施方式中，抗体是多克隆抗体；某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。某些实施方式中，抗体的恒定区序列具有小鼠、兔、灵长类或人抗体特性。在一些实施方式中，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等，如本领域所知。此外，本文中术语“抗体”在合适的实施方式中指本领域已知的或已有的以其它表现形式利用抗体结构和功能特征的任何构建体或形式(除非另有说明或基于上下文可以明确)。例如，作为实施方式，本发明所用抗体可以是选自以下所述但不限于以下所述的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双或多特异性抗体(如等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段和分离的CDR或CDR组；单链Fvs；多肽-Fc融合体；单域抗体(如鲨鱼单域抗体，如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(如)；小模块免疫药物(“SMIPs^TM”)；单链或串联双功能抗体Humabody抗体，VHH；微型抗体；锚蛋白重复蛋白或 DART；TCR样抗体； MicroProteins；和某些实施方式中，抗体可缺失天然形式中的共价修饰(例如接装聚糖)。某些实施方式中，抗体可包含共价修饰(例如接装聚糖、有效荷载[如可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其它附属基团[例如聚乙二醇等]。

本文中，“抗体片段”指如本文所述抗体或抗体类物质的一部分，通常是指包括抗原结合部分或其可变区的部分。抗体片段可用任何方式来制造。例如，某些实施方式中，抗体片段可以通过将完整抗体或抗体类物质通过酶促或化学方法片段化来产生。或者，某些实施方式中，抗体片段可用重组技术产生(即通过工程化核酸序列的表达)。某些实施方式中，抗体片段可以全部或部分合成产生。某些实施方式中，抗体片段(尤其抗原结合性抗体片段)的长度可为至少约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190个氨基酸或更长，某些实施方式中至少约200个氨基酸。

如本文所用，术语“结合”通常指两个或更多实体间的非共价联合。“直接”结合包括实体或部分之间的物理接触；间接结合包括通过与一个或多个中间实体的物理接触发生的物理相互作用。通常可在各种情形下评估两个或更多实体之间的结合—包括对相互作用的实体或部分单独进行研究或在更复杂系统背景中(例如，与载体共价或以其他方式相关联和/或在生物系统或细胞内)进行研究。

如本文所用，术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”通常指表现出相对异常、失控和/或自主性生长的细胞，它们因此表现出以细胞繁殖明显失控为特征的异常生长表型。在一些实施方式中，肿瘤可以是或包含癌前(如良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。本文具体提示了某些可能特别相关的癌症。在一些实施方式中，相关癌症可以实体瘤为特征。在一些实施方式中，相关癌症可以血液肿瘤为特征。总体来说，本领域已知的不同类型癌症例子包括例如：包括白血病、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病的造血系统癌症；肉瘤，黑色素瘤，腺瘤，实体组织癌，口腔、喉咙、喉和肺的鳞状细胞癌，肝癌，泌尿生殖系统癌如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌、子宫内膜癌和肾细胞癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，皮肤或眼内黑素瘤，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，头颈癌，乳腺癌，胃肠癌和神经系统癌症，良性病变如乳头状瘤，等等。

如本文所用，术语“CDR”指抗体可变区内的互补决定区。重链和轻链的可变区各自有三个CDR，它们是各可变区的CDR1、CDR2和CDR3。“CDR组”或“成组CDR”指一组三个或六个CDR，它们或者是能够结合抗原的单个可变区内的CDR，或者是能够结合抗原的相互关联的重链和轻链可变区的CDR。本领域已确立了用于定义CDR边界的某些系统(例如Kabat、Chothia等)；本领域技术人员知道这些系统之间的差异，并且能够理解CDR的边界到理解和实践所要求保护的本发明所需的的程度。

如本文所用，术语“化学治疗剂”具有其本领域公知的含义，指一种或多种促细胞凋亡、细胞抑制性和/或细胞毒性物质，例如具体包括用于和/或推荐用于治疗一种或多种与不期望的细胞增殖有关的疾病、紊乱或病症。许多实施方式中，化学治疗剂能用于治疗癌症。在一些实施方式中，化学治疗剂可以是或包含一种或多种烷化剂，一种或多种蒽环类抗生素，一种或多种细胞骨架破坏剂(如微管靶向剂，如紫杉烷、美登素及其类似物)，一种或多种埃坡霉素，一种或多种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC)，一种或多种拓扑异构酶抑制剂(如拓扑异构酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂)，一种或多种激酶抑制剂，一种或多种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物，一种或多种肽抗生素，一种或多种铂基药物，一种或多种类视黄醇，一种或多种长春花生物碱，和/或一种或多种下列物质的一种或多种类似物(即同样具有相关的抗增殖活性)。某些具体实施方式中，化学治疗剂可以是或包含一种或多种以下所述：放线菌素，全反式视黄酸，奥瑞他汀，阿扎胞苷，硫唑嘌呤，博来霉素，硼替佐米，卡铂，卡培他滨，顺铂，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，姜黄素，阿糖胞苷，柔红霉素，多西紫杉醇，多西氟尿苷，多柔比星，表柔比星，埃坡霉素，依托泊苷，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，伊达比星，伊马替尼，伊立替康，美登素和/或其类似物(例如DM1)，二氯甲基二乙胺(氮芥，Mechlorethamine)，巯嘌呤，甲氨蝶呤，米托蒽醌，美坦生类化合物，奥沙利铂，紫杉醇，培美曲塞，替尼泊苷，硫鸟嘌呤(Tioguanine)，拓扑替康，戊柔比星(valrubicin)，长春碱，长春新碱，长春地辛，长春瑞滨及其组合。在一些实施方式中，化学治疗剂可以用于抗体-药物缀合物。在一些实施方式中，化学治疗剂是选自以下所述抗体-药物辍合物中的化学治疗剂：hLL1-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、本妥昔单抗-维多汀(brentuximab vedotin)、曲妥珠单抗-美坦新(trastuzumab emtansine)、依托珠单抗-奥佐米星(inotuzumab ozogamicin,)格巴妥莫单抗-维多汀(glembatumomab vedotin)、SAR3419、SAR566658、BIIBO15、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗-PSMA ADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、伏司妥珠单抗-马弗多汀(vorsetuzumabmafodotin)和罗瓦妥珠单抗-美登木素DM1(lorvotuzumab mertansine)。

本文所用术语“联合治疗”是指其中对象同时接触2种或更多种治疗方案(例如，2种或更多种治疗剂)的情况。在一些实施方式中，可以同时给予2种或更多种治疗方案。在一些实施方式中，依次给予2种或更多种治疗方案(例如，在给予任何剂量的第二方案之前给予第一方案)。在一些实施方式中，2种或更多种治疗方案以重叠给药方案给予。在一些实施方式中，联合疗法的给药包括向接受其他试剂或疗法(modality)的对象给予1个或更多个治疗剂或疗法。

如本文所用，术语“框架”或“框架区”指扣除CDR的可变区序列。由于CDR序列可据不同更多系统来确定，同样，框架区序列也适用相应的不同解释。六个CDR将重链和轻链上的框架区在各链上分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中，CDRl位于FRl与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，CDR3位于FR3与FR4之间。除非特指亚区为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他所称，框架区代表单个天然免疫球蛋白链可变区内FR的总和。本文中，单个FR表示四个亚区中的一个，例如，FR1表示最靠近可变区氨基末端的第一个框架区，位于CDR1的5'侧，而多个FR表示构成框架区的两个或更多亚区。

如本文所用，术语“人源化”通常用于指抗体(或抗体组分)，其氨基酸序列包括来自非人物种(如小鼠)中产生的参比抗体的V_H和V_L区序列，但也包括相对于参比抗体进行的的这些序列中的修饰，这旨在使它们更具备“人样特征”，即更类似于人种系可变序列。某些实施方式中，“人源化”抗体(或抗体组分)免疫特异性结合目标抗原，且其框架(FR)区具有基本上与人抗体框架区相同的氨基酸序列而互补决定区(CDR)具有基本上与非人抗体相同的氨基酸序列。人源化抗体包含基本上全部至少一个、通常两个可变域(Fab、Fab'、F(ab')₂,、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即供体免疫球蛋白)的那些而所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列框架区。在一些实施方式中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，一般是人免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方式中，人源化抗体既含有轻链又至少含有重链的可变结构域。抗体还可包含重链恒定区的C_H1、铰链区、C_H2、C_H3和可选地C_H4区。

如本文所用，术语“体外”指人工环境中(如试管或反应容器中、细胞培养物中等)而非多细胞生物体内发生的事件。

如本文所用，术语“体内”指多细胞生物体(如人和非人动物)内发生的事件。就基于细胞的系统而言，该术语可指活细胞内发生的事件(相对于体外系统)。

如本文所用，术语“分离(的)”指这样的物质和/或实体：(1)已分离掉其原初产生时(无论天然和/或实验环境中)与之关联的组分中至少部分组分，和/或(2)是人工设计的、生成的、制备的和/或制造的。分离的物质和/或实体可以是已经分离掉约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99％以上原初与之关联的其他组分。在一些实施方式中，分离的物质为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或超过约99％纯。本文中，如果某物质基本不含其他组分，则认为其是“纯的”。在一些实施方式中，如本领域技术人员理解的，某物质在与某些其他组分(例如一种或多种运载体或赋形剂(如缓冲剂、溶剂、水等))组合后仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”。仅举一个例子：在一些实施方式中，在以下情形时天然生物聚合物如多肽或多核苷酸被认为是“分离的”：a)就其起源或衍生之源而言，与其天然状态下的伴随组分部分或全部不相关联；b)它基本上不含其天然生产者所产同种物质中的其他多肽或核酸；c)经表达或因其他方式或原因而关联细胞或其他表达系统的组分，但所述细胞或其他表达系统不是其天然生产者。因此，举例来说，在一些实施方式中，将化学合成或由非其天然生产者的细胞系统合成的多肽认为是“分离的”多肽。或者或此外，在一些实施方式中，在以下程度上可以将已经历一种或多种纯化技术的多肽认为是“分离的”，即它已经与其他组分分离，所述其他组分是a)天然情况下与之关联的，和/或b)在其原初产生时与之关联的。

如本文所用，术语“K_D”指结合性物质(如抗体或其结合性组分)从与其配偶体(如所述抗体或其结合性组分所结合的表位)组成的复合物上解离的解离常数。

如本文所用，术语“巨噬细胞”指脾脏中存在或已经分化为组织巨噬细胞的单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。这些细胞包括滤泡树突细胞(FDC)，树突细胞，朗格汉斯细胞以及其他组织巨噬细胞。巨噬细胞是吞噬细胞和抗原呈递细胞，其由循环的外周血中的单核细胞分化而来。它们通过激活T淋巴细胞在先天免疫和适应性免疫中都起着重要作用。激活Th1 T淋巴细胞的巨噬细胞提供了炎症反应并被称为M1巨噬细胞。M1巨噬细胞也称为“杀手巨噬细胞”，其抑制细胞增殖，引起组织损伤，并具有抵细菌能力。激活Th2 T淋巴细胞的巨噬细胞提供抗炎反应并称为M2巨噬细胞。M2巨噬细胞也称为“修复巨噬细胞”，其促进细胞增殖和组织修复并具有抗炎作用。如本文所用，术语“肿瘤相关巨噬细胞”(TAM)通常指存在于癌症(例如肿瘤)微环境中的巨噬细胞。

如本文所用，术语“操作性地连接”指并置位置，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。“操作性地连接”功能元件的控制元件以这样的方式相互关联：功能元件的表达和/或活性在与控制元件相容的条件下实现。在一些实施方式中，“操作性地连接”的控制元件与感兴趣的编码元件相邻(例如，共价连接的)；在一些实施方式中，控制元件与感兴趣的功能元件以反式或其他方式作用。

如本文所用，术语“药物组合物”指这样的组合物，即其中的活性物质与一种或多种药学上可接收的运载体配制在一起。在一些实施方式中，组合物适合给予人或动物对象。在一些实施方式中，活性物质以单位剂量存在，该单位剂量需适合在治疗方案中给药并在用于相关群体时显示出实现预定疗效的统计学显著性概率。

如本文所用，术语“多肽”在此总体上具有其领域内公知的含义即至少三个氨基酸的聚合物。本领域普通技术人员明白，术语“多肽”应理解为足够广义从而不仅涵盖具有本文中的全序列的多肽，还涵盖代表这些完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。并且，本领域普通技术人员明白，蛋白质序列通常容许一些不损害其活性的取代。因此，本文中，相关术语“多肽”涵盖如下所述的任何多肽：相比另一同类多肽，其保留活性并具有至少约30-40％的整体序列相同性，一般高于约50％、60％、70％或80％，且通常在一个或多个高度保守性区域内包括至少一个相同性高得多的区域，该相同性一般超过90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％，通常包括至少3-4个、一般多达20或更多个氨基酸。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或这两者，并可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方式中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。某些实施方式中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征性部分。

如本文所用，术语“预防”或“防止”在用于疾病、紊乱和/或病症的出现时指降低发展成所述疾病、紊乱和/或病症的风险和/或延迟所述疾病、紊乱和/或病症一种或多种特征或症状的发生和/或严重程度。在一些实施方式中，预防是基于群体评估的，即如果在疾病、紊乱或病症易感人群中观察到所述疾病、紊乱或病症一种或多种症状的发生发展、频率和/或强度有统计学显著的降低，则认为某药剂/物质能够“预防”所述具体疾病、紊乱或病症。

如本文所用，术语“重组”意指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、创造、制造和/或分离的多肽，如用转染到宿主细胞中的重组病毒载体表达的多肽；分离自重组、组合性人多肽文库的多肽；分离自这样的动物(例如，小鼠、兔、羊、鱼等)的多肽，所述动物经转基因或以其他方式经操纵以表达编码和/或直接表达多肽或其一种或更多种组分、部分、元件或结构域的一种或更多种基因或基因组分；和/或通过任何其他方式制备、表达、产生或分离的多肽，所述任何其他方式涉及将选定的核酸序列元件彼此之间剪接或连接，化学合成选定的序列元件和/或以其他方式产生编码和/或直接表达多肽或其一种或更多种组分、部分、元件或结构域的核酸。在一些实施方式中，一种或多种这类选定的序列元件是天然的。在一些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件是计算机模拟(in silico)设计的。在一些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件来自已知序列元件的突变(如体内或体外)，例如来自天然或合成来源，如在目标源生物种系(如人、小鼠等)中。

如本文所用，术语“特异性结合”指在结合发生的环境中能够在可能的结合的配偶体之间进行区分的能力。结合性物质在存在有其他潜在靶标时与一种特定靶标相互作用时则称其为“特异性结合”其与之相互作用的靶标。在一些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合性物质与其配偶体之间的结合程度来评定；在一些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评定；在一些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合剂竞争其配偶体和其他实体之间选择性相互作用的能力来评定。在一些实施方式中，特异性结合通过在一系列浓度上进行这样的检测或测定来评定。

本文中，术语“对象”指生物体，通常是哺乳动物(如人，在一些实施方式中包括人的产前形式)。在一些实施方式中，对象患有相关疾病、紊乱或病症。在一些实施方式中，对象易患相关疾病、紊乱或病症。在一些实施方式中，对象表现出疾病、紊乱或病症的一种或多种症状或特征。在一些实施方式中，对象未表现出疾病、紊乱或病症的任何症状或特征。在一些实施方式中，对象具有疾病、紊乱或病症的一种或多种易感特征或风险特征。在一些实施方式中，对象是人。在一些实施方式中，对象是确诊和/或接受治疗的个体或是已经确诊过和/或接受过治疗的个体。

如本文所用，短语“治疗剂”泛指给予生物体后激发所需药理学效应的任何物质。在一些实施方式中，如果某物质在适当的群体中表现出统计学上显著的作用，则认为其是治疗剂。在一些实施方式中，合适的群体可以是模式生物群体。在一些实施方式中，合适的群体可以用各种标准来界定，例如特定年龄组、性别、遗传背景、原有临床病症等。在一些实施方式中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟疾病、紊乱和/或病症一种或多种症状或特征的发作，降低其严重性和/或降低其发生率的物质。在一些实施方式中，“治疗剂”是曾经或目前须经政府机构批准才能上市人用的物质。在一些实施方式中，“治疗剂”是须经处方才能人用的物质。

术语“治疗有效量”在此指按照治疗剂量给药方案给予患有或易患疾病、紊乱和/或病症的群体时足以治疗所述疾病、紊乱和/或病症的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低疾病、紊乱和/或病症一种或多种症状的发病率和/或严重性，稳定所述症状的一种或多种特征和/或延迟所述症状发生的量。本领域普通技术人员会明白，“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现治疗成功。相反，治疗有效量可以是给予需要这种治疗的患者时在显著数量的对象中提供特定的所需药理学反应的量。例如，在一些实施方式中，术语“治疗有效量”是指这样的量，即在创新疗法背景下，给予有需要的个体时能阻断、稳定、减轻或逆转该个体内的癌症支持性进程，或将增强或增加该个体内的癌症抑制性进程的量。就癌症治疗而言，“治疗有效量”是当给予癌症确诊个体时能预防、稳定、抑制或减少个体内癌症进一步发展的量。本文所述组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转(在治疗性处置中)恶性肿瘤如胰腺癌的发展或辅助实现或延长恶性肿瘤的缓解。给予个体以治疗该个体癌症的治疗有效量可以与用于促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。像就大多数癌症疗法而言的那样，本文描述的治疗方法不应解释为限于或以其他方式限于癌症的“治愈”；相反，治疗方法指使用所述组合物来“治疗”癌症，即，对患癌个体的健康产生期望的或有益的改变。这样的益处是肿瘤学领域有经验医疗保健提供者所知道的，包括但不限于患者病情稳定，肿瘤减小(肿瘤消退)，重要机能改善(例如患癌组织或器官的功能改善)，进一步转移的减少或抑制，机会性感染的减少，生存能力的提高，疼痛的减轻，运动机能改善，认知功能改善，精力改善(活力，不适减少)，健康感改善，恢复正常食欲，恢复健康的体重增加，以及它们的组合。此外，个体内特定肿瘤的消退(例如作为本文所述治疗的结果)还可以如下来评估：从肿瘤部位取样癌细胞如胰腺癌(例如在治疗过程中)并对癌细胞进行代谢标志物和信号转导标志物水平检测，从而监测癌细胞的状态，由此在分子水平上验证癌细胞消退为低恶性表型。例如，采用本发明方法诱导的肿瘤消退可由以下所述来指示：发现任一前文所述促血管生成标志物减少，本文所述抗血管生成标志物增加，代谢路径或细胞间信号转导路径或细胞内信号转导路径(在癌症确诊个体内表现出异常活性)的正常化(即朝非癌患正常个体的状态方向改变)。本领域普通技术人员会明白，在一些实施方式中，治疗有效量可以配制成单剂量和/或以单剂量给药。在一些实施方式中，治疗有效量可以配制成多剂量和/或以多剂量给药，例如作为给药方案的一部分。

在本文中就分子(如核酸、蛋白质或小分子)而言，术语“变体”指与参照分子显示出显著的结构同一性但结构上区别于参照分子的分子，例如，与参照相比，在一个或多个化学部分的存在或不存在或水平上有区别。在一些实施方式中，变体在功能上也区别于其参照分子。通常，将特定分子认为参照分子的“变体”是否恰当是基于其与参照分子的结构同一性程度。如同本领域技术人员所理解的，任何生物或化学参照分子都具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共享一种或多种此类特征性结构元件但在至少一个方面与参照分子有差异的不同分子。仅举几个例子，多肽可具有由多个氨基酸组成的特征性序列元件，这些氨基酸在线性或三维空间上具有彼此相对的指定位置和/或参与构成特定的结构基序和/或生物学功能；核酸可具有多个核苷酸残基组成的特征性序列元件，这些核苷酸残基在线性或三维空间上具有彼此相对的指定位置。在一些实施方式中，变体多肽或核酸可能因氨基酸或核苷酸序列上一处或多处差异而区别于参照多肽或核酸。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与参照多肽或核酸的总体序列相同性为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与参照多肽或核酸不共有至少一种特征序列元件。在一些实施方式中，参照多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与参照多肽或核酸共有一种或多种生物学活性。

如本文所用，术语“载体”指能够运输与之相连的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，指可在其中连接其他DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一类型是病毒载体，其中，其他DNA区段可连入病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和其他游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能够引导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化可采用标准技术(如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可按照生产商的说明书或按照本领域常规操作或按照本文所述来进行。以上所述技术和方法可以一般性地按照如本领域所知、亦如本说明书所引用和论述的众多综合性和专论性文献中所述来进行。参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(1989))，该书通过援引纳入本文用于所有目的。

癌症中的巨噬细胞

巨噬细胞是吞噬细胞和抗原呈递细胞，其由循环的外周血中的单核细胞分化而来。已知这些细胞通过激活T淋巴细胞在先天免疫和适应性免疫中都起着重要作用。激活Th1 T淋巴细胞的巨噬细胞提供了炎症反应并被称为M1巨噬细胞。M1巨噬细胞也称为“杀手巨噬细胞”，其抑制细胞增殖，引起组织损伤，并具有抵细菌能力。激活Th2 T淋巴细胞的巨噬细胞提供抗炎反应并称为M2巨噬细胞。M2巨噬细胞也称为“修复巨噬细胞”，其促进细胞增殖和组织修复。

虽然巨噬细胞通过单核细胞的分化形成，但是单核细胞成熟形成M1(CD 68⁺和CD80⁺)或M2(CD68⁺和CD163⁺)巨噬细胞，这取决于导致它们分化的细胞因子和生长因子。脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFNγ)激活单核细胞以分化为M1巨噬细胞，其分泌高水平的白介素1(IL-1)和白介素12(IL-12)和低水平的白介素10(IL-10)。或者，白介素-4(IL-4)，IL-10，白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)和转化生长因子β(TGFβ)激活单核细胞，以分化为分泌高水平IL-10、TGFβ和胰岛素样生长因子1(IGF-1)以及低水平的IL-12的M2巨噬细胞。

免疫在癌形成中的作用越来越受到人们的重视。由于已知巨噬细胞在先天免疫和适应性免疫中都起着重要作用，因此它们被认为是肿瘤及其微环境的关键组成部分。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)通常指存在于癌症微环境中的巨噬细胞。人们已经广泛研究了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在肿瘤的生长、侵袭和转移中的作用，并且已知TAM表现出广泛的表型，范围从选定的肿瘤的早期阶段中的M1样表型到大多数晚期肿瘤中的M2样表型。作为其在促进肿瘤发生中作用的证据，M2巨噬细胞展现出这样的特征表型：IL-10、IL4、MMP和VEGF表达升高，但促炎性细胞因子和细胞毒性iNO和ROI表达下降，这与杀肿瘤活性有关。除了其在促进肿瘤发生的内在功能外，TAM还通过交替肿瘤微环境中的T细胞反应和平衡来导致抑制抗肿瘤免疫力。

在癌症中，除了促进细胞增殖起抗炎作用外，M2巨噬细胞还可以诱导肿瘤区域中的血管形成。因此，在这种情况下，抑制巨噬细胞的M2极化并诱导已知攻击肿瘤细胞的巨噬细胞的M1极化将是有用的。

VSIG4

VSIG4(V-set和含免疫球蛋白结构域4)是B7家族相关的膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族(CRIg)的补体受体，其已知通过结合iC3b和C3b来负调节CD8⁺T细胞增殖和IL-2产生。VSIG4的表达限于组织巨噬细胞，包括腹膜巨噬细胞和肝驻留性库普弗(Kupffer)细胞。图2A和2B显示了VSIG4与其他B7蛋白家族的关系(分别为同源性和系统发育关系)(在图2A和2B中，VSIG4被称为EU103)。图2A显示了VSIG4与各种其它B7蛋白家族的氨基酸序列比对。图2B显示了VSIG4和其他B家族蛋白之间的进化关系。

抗VSIG4抗体治疗癌症

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是产生免疫抑制肿瘤微环境(TME)的关键细胞，为免疫疗法提供多个靶标。还已知巨噬细胞具有很高的可塑性，并且还可以重新极化并获得抗致瘤性M1样表型。

人们知晓，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的特点是具有促肿瘤功能，如促进癌细胞运动、转移形成和血管生成。TAM的形成取决于存在于发展中肿瘤中的微环境因子。TAM在许多癌症中，尤其是在肿瘤微环境中含量很高，并且常常展现出促进肿瘤生长并增强对治疗抗性的免疫抑制性M2样表型。TAM还产生免疫抑制性细胞因子，例如IL-10、TGFβ和PGE2，非常少量的NO或ROI和低水平的炎性细胞因子，例如IL-12、IL-1β、TNFα和IL-6。巨噬细胞向TAM的转化导致递呈肿瘤相关抗原并刺激T和NK细胞的抗肿瘤功能的能力降低。此外，TAM不能裂解肿瘤细胞。因此，靶向TAM是用于抑制或治疗癌症的新型治疗策略，例如，通过递送物质以改变TAM的募集和分布，耗竭已有TAM或诱导TAM由M2至M1表型的再归化(或转化)。

本发明是基于这样的发现：表达VSIG4的M2巨噬细胞可以经人源化抗VSIG4抗体处理以将M2巨噬细胞转化(或重新极化)成肿瘤抑制性M1巨噬细胞，从而诱导CD8⁺T细胞增殖和促炎细胞因子产生，导致肿瘤抑制。此外，通过靶向(1)M2巨噬细胞向M1巨噬细胞的转化，和(2)诱导CD8⁺T细胞增殖和促炎性细胞因子产生，使用抗VSIG4抗体可以有效抑制癌症，从而影响肿瘤微环境本身。这种使用抗VSIG4抗体抑制癌症的方法优于仅诱导T细胞增殖或仅阻断巨噬细胞肿瘤辅助活性的其他疗法。参见图1(示意性地显示了抗VSIG4抗体对巨噬细胞功能的作用，其对T细胞增殖的作用，以及随后的癌症抑制)。

小鼠抗体的人源化

虽然可以通过小鼠免疫系统快速产生单克隆抗体用于生物学研究，但是在临床环境中，使用这些鼠类抗体可能导致人抗小鼠抗体应答(HAMA)。虽然嵌合抗体可以减少人的抗IgG反应，但是鼠可变结构域可能仍具有挑衅性(provocative)T细胞表位内容物，这需要对其框架区进行“人源化”。

经典抗体人源化通常开始于将所有六个鼠互补决定区(CDR)转移至人抗体框架上(Jones等,Nature 321,522-525(1986))。这些CDR移植的抗体通常不保留其对抗原结合的原始亲和力，并且实际上亲和力通常会受到严重损害。除了CDR，还必须将某些非人框架残基纳入可变结构域以维持适当的CDR构象(Chothia等,Nature 342:877(1989))。在人框架中的关键位置纳入鼠残基以恢复功能通常被称为“回复突变”。回复突变可以支持移接的CDR的结构构象并恢复抗原结合和亲和力。已经确定了有可能影响亲和力的多种框架位置，因此以逐步方式进行结构建模以选择新型残基通常可以导致具有恢复的抗原结合的变体。或者，靶向这些残基的噬菌体抗体文库也可用于增强和加速亲和力成熟过程(Wu等,J.Mol.Biol.294:151-162(1999)和Wu,H.,Methods in Mol.Biol.207:197-212(2003))。

抗体亲和力成熟

亲和力成熟是这样的过程，通过该过程T_FH细胞激活的B细胞在免疫应答的过程中产生对特定抗原亲和力增强的抗体。通过重复暴露于同一抗原，宿主将产生亲和力依次更高的抗体。二次应答可以引发亲和力比初次应答大数倍的抗体。亲和力成熟是抗体优化以产生安全有效的第二代治疗剂的重要策略。经典方式是，通过用所需抗原对表达人免疫球蛋白基因的小鼠或转基因动物进行免疫来获得治疗性抗体。将来自这些动物的经抗原刺激的免疫细胞转化为杂交瘤，并随后进行筛选以鉴定对靶抗原具有低纳摩尔亲和力的单克隆抗体。在体内，通过免疫系统的自然亲和力成熟通过体细胞超突变和克隆选择发生，而在体外，在实验室亲和力成熟中，可以通过突变和选择发生。此外，除了使用TFH细胞激活的B细胞的亲和力成熟方法，亲合力成熟的其他方法在本领域中是已知的，并且在本公开的范围内。

实施例

以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。

材料和方法

下述方法和材料用于实施例中所述的实验。

由人PBMC分离CD14⁺单核细胞

将巨噬细胞分化成M1或M2巨噬细胞这样进行：通过由对象分离PBMC并将巨噬细胞在50ng/ml hGM-CSF中孵育6天以转化为M1巨噬细胞或将巨噬细胞在100ng/ml M-CSF中孵育6天以转化为M2巨噬细胞(图5)。

通过表型检查确认巨噬细胞向M1或M2巨噬细胞的转化(图6和7)。

通过将巨噬细胞在LPS(100ng/ml)+IFNγ(100ng/ml)或500ng/ml抗VSIG4抗体(EU103.2)中孵育24小时来进行将M1或M2巨噬细胞向M1巨噬细胞的后续转化(图12)。

通过将巨噬细胞在20ng/ml IL-4中孵育24小时来将M1或M2巨噬细胞转化为M2巨噬细胞(图12)。

人源化抗VSIG4抗体——EU103.2抗体

EU103.2抗体是由小鼠抗VSIG4抗体mu6H8生成的人源化抗VSIG4抗体。图4A和4B显示了使用尺寸排阻HPLC(图4A)和表面等离振子共振实验进行的EU103.2抗体的生化表征，显示了VSIG4与EU103.2抗体的结合(图4B)。下表1中显示了EU103.2抗体纯化数据的总结。

表1：EU103.2抗体尺寸排阻HPLC数据的总结

小鼠抗VSIG4抗体的人源化——EU103.3抗体

如下所述产生了人源化抗VSIG4抗体hu6H8(或EU103.3)。

mu6H8 VH人源化

使用小鼠6H8抗体和Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins)产生VH人源化变体的框架(种系基因：VH2-5/D3-3/JH6c)Kabat编号法用于对CDR进行分类，并使用框架和分类的mu6H8 VH CDR，VH2、VH27、VH30、VH93和VH94的回复突变设计人源化VH(hu6H8.3 VH)。

mu6H8 VL人源化

使用小鼠6H8抗体和Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins)产生VL人源化变体的框架(种系基因：A17/JK2)Kabat编号法用于对CDR进行分类，并使用框架和分类的mu6H8 VL CDR，VH2、VH4、VH36和VH46的回复突变设计人源化VL(hu6H8.3 VL)。

IgG抗体的克隆和表达——EU103.3抗体

通过FES(L234F，L235E，P331S)突变修饰重链可变区序列以构建没有Fc效应功能的重链pOptivec(英杰公司(Invitrogen))表达质粒，如图21A所示。使用pcDNA3.3(英杰公司)构建轻链可变区序列，并使用IDT合成，如图21B所示。编码重链(HC)的基因侧接Nhe1限制酶EcoR1以构建pOptivec(FES)质粒载体，而编码轻链(LC)的基因侧接BsiW1限制酶EcoR1以构建pcDNA3.3质粒载体。通过将突变位点亚克隆到hu6H8.3主链进行克隆。使用HD Cloning Kit(克隆泰克公司(Clontech))分别克隆所得插入基因和线性化载体，并使用CMV正向，EMCV IRES反向引物鉴定测序引物。

VSIG4敲除小鼠

VSIG K/O小鼠通过同源重组用新霉素抗性基因替换外显子1生成。生成靶向载体，用于ES细胞中的同源重组。E1和E1和E2指示CRIg基因的外显子1和2(图41A)。通过Southern印迹确认将CRIg等位基因同源重组到由ES细胞克隆1和2(C1,C2)嵌合小鼠繁育到WT小鼠的杂合子雌性后代(图41B)。比较WT和K/O雄性和雌性小鼠外周血中白细胞的数量。使用血细胞计数器确定总血细胞计数。白细胞与对多种细胞表面标志物具有特异性的荧光染料偶联的抗体孵育，并通过流式细胞术确定不同白细胞亚组的数量。数据代表5-7只小鼠的平均值+SD(图41C)。

A1、A2、A1.3和A2.3抗体

A1和A2抗体通过亲和力成熟EU103.3抗体生成(参见下表2)，其中位置76、90和/或92(kabat编号)处的轻链可变区发生经突变，如下表2所示。

由A1和A2抗体分别生成A1.3和A2.3抗体，以进一步改善对VSIG4的亲和力。

图40提供了EU103.3、A1、A2、A1.3和A2.3重链和轻链的氨基酸序列比对，以及重链和轻链的共有氨基酸序列。以矩形框显示不同抗体之间不同的氨基酸残基。

表2：亲和力成熟实验中筛选的人源化抗VSIG4抗体的克隆

产生具有高结合亲和力的抗体

将人源化抗体基因插入质粒，并使用Expi293表达系统(英杰公司)以IgG形式表达，然后使用AktaPure纯化器(GE医疗公司(GE Healthcare))、AktaPrime纯化器(GE医疗公司)和MabselectSURE柱(GE医疗公司，目录号11-0034-95)进行纯化。使纯化的抗体运行通过PBS缓冲液变化的脱盐柱(GE医疗公司，目录号17-1408-01)，并用Multiskan GO(赛默飞公司(Thermo))测量抗体浓度。

表3：具有高结合亲合力的抗体的产率

PBMC衍生的巨噬细胞分化

使用下述方案由PBMC获得M1和M2巨噬细胞。

1.含PBS的血液混合物(1:1)20ml覆盖在10ml的Ficoll-Paque^TM Plus(GE医疗公司，目录号17-1440-02)

2.以400xg离心35分钟(2加速，0制动)

3.PBMC分离并用RPMI-1640培养基(WelGene公司，目录号LB011-01)在2000rpm下洗涤5分钟x2次

4.计数

5.MAC缓冲液(2％FBS(密理博公司(Millipore)，目录号TMS-013-BKR)的PBS(WelGene公司，目录号LB004-02)1～2ml悬浮液。

6.添加CD14-微珠(20ul/10⁷细胞)(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，目录号130-050-201)

7.在冰上孵育30分钟

8.通过MAC缓冲液以2000rpm洗涤5分钟x2次

9.计数

10.将细胞加载到MAC柱(美天旎生物技术公司，目录号130-042-401)

11.正选择和计数

12.通过培养基(RPMI-1640+10％FBS+青霉素/链霉素(吉布可公司(Gibco)，目录号15140-122))+Glutamax(吉布可公司，目录号35050-061)+20～40ng/ml的rhM-CSF(白乐津公司，目录号574806)进行悬浮

13.将CD14⁺细胞接种于100mm培养皿(1x10⁶细胞/10ml/皿)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，目录号150466)

14.每3天后，更换新鲜培养基

15.7～10天后，通过FAC检测M0巨噬细胞分化

16.通过LPS 20ng/ml(西格玛奥里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号L4391)+rhIFNγ20ng/ml(白乐津公司，目录号570204)(M1)和rhIL4 20ng/ml(白乐津公司，目录号574002)+rhIL13 20ng/ml(白乐津公司，目录号571102)(M2)培养基(RPMI-1640+10％FBS+青霉素/链霉素+Glutamax)从M0向M1或M2巨噬细胞分化，2天

17.M1或M2分化后，通过FACs检查细胞表型

18.对于M2至M1巨噬细胞转化，添加抗体20ug/ml或LPS 20ng/ml+rhIFNγ20ng/ml(阳性对照)于新鲜培养基(RPMI-1640+10％FBS+青霉素/链霉素+Glutamax)，2天

19.M2至M1转化后，细胞表型检查通过FACs进行，而培养的悬浮液中细胞因子/趋化因子检查通过LEGENDplex^TM(白乐津公司，目录号740502)进行

FACS分析

下述抗体用于FAC分析：

·hCD14-BV650(BD生物科学公司(BD Bioscience)，目录号563419)

·hCD14-BV421(BD生物科学公司，目录号565283)

·hIFNγ-PE/Cy7(BD生物科学公司，目录号557844)

·hCD3-BV510(BD生物科学公司，目录号563109)

·hCD8-V450(BD生物科学公司，目录号560347)

·hCD68-PE(白乐津公司(Biolegend)，目录号333808)

·hCD93-PE(白乐津公司，目录号336108)

·HLA-DR-BV421(白乐津公司，目录号307636)

·hCD45-PE(白乐津公司，目录号304008)

·hCD64-APC(白乐津公司，目录号305014)

·hCD163-APC/Cy7(白乐津公司，目录号333622)

·hCD86-PerCP/Cy5.5(白乐津公司，目录号305420)

·hCD86-BV421(BD生物科学公司，目录号562432)

实施例1：巨噬细胞中的VSIG4表达

VSIG4在M2巨噬细胞中表达。图3A和3B显示了VSIG4表达(通过mRNA测量)和各种与2型巨噬细胞(M2)和肿瘤相关巨噬细胞相关的基因的相关数据。如图3A所示，VSIG4表达与[CXCL11，CXCL13，ZNMB，IFNAR1，IFNAR2]表达负相关，而其与CCL19，IRF5和IL1A表达正相关。图3B显示了VSIG 4表达与CD163，CSF1R，MSR1，TGFBR2，STAT6，IL1R1，IL10RA，MS4A4A，CCL2，CCL14，CCL17和MS4A6A表达正相关。

图5显示M2巨噬细胞中的VSIG4表达。图5上排中的两个分图显示了光学显微镜图像，其显示了M1和M2巨噬细胞的形态学。第二和第三排显示了针对CD14和VSIG4进行染色的淋巴细胞的流式细胞术数据，表明M2细胞(对CD14染色呈阳性)也表达VSIG4。

实施例2：人抗VSIG4抗体诱导M2巨噬细胞中的细胞因子和趋化因子分泌M1和M2巨噬细胞经EU103.2抗体处理并测量促炎细胞因子和趋化因子的分泌。如图6所示，使用EU103.2处理M2巨噬细胞导致诱导细胞因子和化学因子IL12、IFNγ、IL10和IL23。

实施例3：人源化抗VSIG4抗体将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞

为了进一步测试EU103.2对巨噬细胞的作用，M2巨噬细胞经EU103.2抗体处理并对M2巨噬细胞标志物CD163进行染色。如图7所示，EU103.2处理降低M2巨噬细胞中M2巨噬细胞标志物CD163表达，这表明使用EU103.2阻断VSIG4导致M2巨噬细胞转化为另一不同的细胞类型。

然后，通过共孵育M2巨噬细胞和CD8⁺T细胞(经EU103.2抗体处理或未经其处理)来测试EU103.2抗体对巨噬细胞-T细胞相互作用的影响。如图8所示，经EU103.2处理的M2巨噬细胞在与CD8⁺T细胞共孵育时将导致CD8⁺T细胞增殖，这表明M2巨噬细胞在用EU103.2抗体处理时将转化为M1巨噬细胞，鉴于M1巨噬细胞诱导CD8⁺T细胞增殖，而M2巨噬细胞抑制CD8⁺T细胞增殖。

然后，为了进一步研究在癌症生物学背景下EU103.2抗体对人巨噬细胞的影响，收集来自卵巢癌患者的腹水样品并首先分析了VSIG4表达。如图9所示，获自卵巢癌患者腹液的巨噬细胞包括共表达VSIG4和CD14的M2巨噬细胞，而如图10和11所示，诱导CD8⁺T细胞增殖。

此外，显微镜图像证实EU103.2抗体处理将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，如图12所示。

如图13所示，通过将表达VSIG4的HeLa细胞与PBMC共培养，有或没有抗VSIG4抗体来阻断VSIG4，VSIG4信号转导在通过巨噬细胞的CD8⁺T细胞增殖中的作用得到进一步证实。该实验表明阻断VSIG4和CD8⁺T细胞之间的相互作用导致CD8⁺T细胞的增殖增强。

为了进一步检查VSIG4在CD8⁺T细胞中的作用，在抗VSIG4抗体或对照IgG抗体存在的情况下，将单核THP-1细胞以各种比例与T细胞共孵育，以显示相较于对照IgG，抗VSIG4抗体能够以4次分裂(4divisions)增加CD8⁺T细胞。

实施例4：使用抗-VSIG4抗体或VSIG4敲除小鼠模型阻断VSIG4信号转导的抗肿瘤作用

为了确定抗VSIG4抗体的抗肿瘤作用，使用了三种小鼠肿瘤模型：MC38结肠腺癌小鼠肿瘤模型，B16F10黑色素瘤小鼠肿瘤模型和3LL肺癌小鼠肿瘤模型(使用VSIG4敲除小鼠)，并与野生型小鼠进行了比较，其分别如图15A、15B和15C所示。相较于野生型小鼠，肿瘤生长受到抑制，特别是对于VSIG4敲除小鼠中的MC38和3LL小鼠肿瘤模型(分别参见图15A和15C)，这证明了肿瘤生长在没有VSIG4信号转导的情况下受到抑制。

相较于注射对照IgG的小鼠，在注射抗VSIG4抗体的野生型小鼠中的MC38小鼠肿瘤模型中观察到了相似的肿瘤生长抑制，如图16所示。抗VSIG4抗体所致肿瘤生长抑制的程度，与VSIG4敲除小鼠相比如果不是显著更大，至少比VSIG4敲除小鼠明显。

然后，在VSIG4敲除小鼠中检查了来自肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞的激活状态，并与野生型小鼠进行了比较。如图17A和17B所示，在VSIG4敲除小鼠中观察到与其野生型对应物相比相当的CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞水平，并且在VSIG4敲除小鼠和野生型小鼠之间表达CD4和CD8的那些淋巴细胞中观察到相当的CD62L表达。此外，VSIG4敲除小鼠相较于野生型小鼠具有增加的CD8β⁺T细胞(如图17C所示)，但具有相当水平的CD11β⁺/Gr-1-淋巴细胞(如图17D所示)。

为了进一步评估VSIG4信号转导在肿瘤生长中的作用，CD38结肠腺癌小鼠肿瘤模型以VSIG4敲除小鼠和野生型小鼠采用，其中在肿瘤注射到对象小鼠中后第18或23天，腹膜内注射化学治疗剂Claforan(CTX)，如图18A上方示意图所示。相较于野生型小鼠，Claforan注射导致VSIG4敲除小鼠中肿瘤体积更大程度地减少，并且肿瘤大小的减小在肿瘤注射后40天得以维持。相反，在野生型小鼠中，CTX注射导致肿瘤大小略微减小，然后肿瘤大小持续增长，如图18A所示。肿瘤注射后第24天时VSIG4敲除小鼠和野生型小鼠的小鼠图像和肿瘤切片的显微照片，如图18B所示。在第24天由VSIG4^+/+和VSIG4^-/-C57BL/6小鼠收集肿瘤切片，并且用H&E对肿瘤组织的石蜡切片进行染色。

抗VSIG4对人源化小鼠模型中肿瘤抑制的作用通过在人源化小鼠中进行HT29癌细胞注射后在第19、22、25、28和31天注射10mg/kg抗VSIG4抗体来评估，如图19所示。相较于接受IgG对照注射的小鼠，接受抗VSIG4抗体的小鼠中观察到肿瘤生长的显著抑制。

这些实验证明，如图20所示例性地显示，VSIG4信号转导调节M2巨噬细胞对T细胞增殖的抑制，并且阻断VSIG4信号转导导致(1)消除M2巨噬细胞诱导的T细胞增殖，从而导致CD8⁺T细胞增殖和肿瘤抑制；(2)将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞。

实施例5：A1、A2、A1.3和A2.3抗体的评估

通过EU103.2抗体的亲和力成熟开发了抗体克隆A1、A2、A1.3和A2.3。通过尺寸排阻HPLC进行的蛋白质概况分别显示在图22、23、24和25中，并总结在下表4中。

表4：A1、A2、A1.3和A2.3抗体的SECHPLC数据

如图26A和26B所示，将A1或A2抗体用于分化的M2巨噬细胞2天，并且FACS分析表明CD163(M2巨噬细胞的标志物)降低和CD86(M1巨噬细胞的标志物)显著增加。用LPS/IFNγ处理2天作为阳性对照。用A1和A2抗体处理显示出M1/M2比率增加。具体地，A2抗体显示出与阳性对照组接近的比例增加。

然后，如图27所示，将A1或A2抗体用于分化的M2巨噬细胞2天，使其重新极化为M1巨噬细胞，并使用LEGENDplex^TM测量培养基中细胞因子和趋化因子生成的变化。

这是为了确认M2巨噬细胞重新极化为M1巨噬细胞。用LPS/IFNγ处理2天作为阳性对照。相较于M2巨噬细胞，A1和A2组均显示M1型细胞因子/趋化因子(TNFα，IL6，IFNγ，IP-10和IL12p40)增加，而M2型细胞因子/趋化因子(IL-10，精氨酸酶，TARC，和IL-1RA)产生降低。具体地，TNFα和IL6产生的增加与阳性对照组相当。

此外，如图28所示，将A1或A2抗体用于分化的M2巨噬细胞2天，并且FACS分析表明CD163(M2巨噬细胞的标志物)表达降低和CD86(M1巨噬细胞的标志物)表达显著增加。用LPS/IFNγ处理2天作为阳性对照。

为了进一步确定A1和A2抗体将M2巨噬细胞重新极化为M1巨噬细胞，将A1或A2抗体以不同的浓度(5、10和20ug/ml)应用于分化的M2巨噬细胞2天，并评估巨噬细胞产生的细胞因子和趋化因子，如图29所示。使用LEGENDplex^TM测量培养基中细胞因子/趋化因子产生的变化。用LPS/IFNγ处理2天作为阳性对照。A1和A2组显示出与M1巨噬细胞相关的TNFα，IL6和IP-10增加，并且这种趋势在用A2抗体处理M2巨噬细胞时尤为明显。无论抗体的浓度如何，与M2巨噬细胞相关精氨酸酶的产生降低。

通过趋化性分析评估经A2抗体由M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞后的巨噬细胞的趋化能力。使用Transwell 24孔5μm孔径室(康宁公司(Corning)，目录号CLS3421-48EA)，下室用化学引诱剂rhCCL19(白乐津公司，目录号582104)(M1型趋化因子)以浓度100ng/ml(体积为400μl)处理，而上室用重新极化的M1巨噬细胞以1.5～5x10⁵细胞/600μl处理，其中M2或A2施用2天。(用LPS/IFNγ处理2天用作阳性对照)。以37℃和5％CO₂进行4小时孵育期后，将下室中的100μl细胞移至96孔板。然后，将10μl的CCK-8溶液(同仁化学公司(Dojindo)目录号CK04)添加到各孔，并在1小时孵育周期后测量吸光度(450nm)。如图30所示，来自A2组的M1巨噬细胞显示出趋化能力，这证实A2抗体将巨噬细胞由M2转化为M1。

进行了基因阵列分析以分析A2抗体将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞后基因表达的变化，如图42所示。用A2抗体处理M2巨噬细胞，并在2天后收获细胞。(Macrogen,AgilentHuman GE 8x60K V3)分析显示，类似于作为阳性对照的经LPS/IFNγ处理的细胞，M1表型标志物和M1型细胞因子/趋化因子的表达增加，而M2表型标志物和M2型细胞因子/趋化因子的表达减少。

实施例6：A1、A2、A1.3和A2.3抗体的抗肿瘤作用

使用人源化小鼠模型评估A1和A2抗体的抗肿瘤作用。将人CD34细胞注入NBSGW小鼠中，然后收集血液样品并测量PBMC中的人CD45细胞，以观察小鼠在12到14周内的人源化。将HCT-15结肠癌细胞以1x10⁷细胞/小鼠注入人源化小鼠中，并在5天后将小鼠分为三组，各自接受hIgG(西格玛奥里奇公司，目录号I4506)，A1抗体或A2抗体的注射。每三天注射一次抗体，总计5次注射，如图31A所示。观察肿瘤大小并在处死小鼠后，将来自血液中的血清用于使用ELISA(英杰公司，目录号88-7316-88)测量IFNγ，并将肿瘤样品用于分析浸润的白细胞。

如在图31B和31C所示，观察到A1抗体没有抗肿瘤作用，但是来自A2抗体组的样品显示出更小的肿瘤大小和IFNγ增加，这确认了A2抗体的抗肿瘤作用。

然后，在体内评估肿瘤生长情况下A2抗体将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞的效果。如图32A所示，将SW480结肠癌细胞注射到小鼠(1x10⁷细胞/小鼠)，并且一旦肿瘤大小生长至一定大小(约1000mm3)，向分化的M2巨噬细胞(7x10⁵细胞/小鼠)注射hIgG或A2抗体。每2天注射一次抗体，总计5次注射，并在第一次注射后，在肿瘤注射后的第4、7和11天收集血样，并将血液样品用于分离血清或PBMC以使用FACS分析对巨噬细胞表型中的变化进行分析。

在肿瘤细胞注射后的第7天，由A2抗体组观察到M1巨噬细胞表型的变化，如图32B所示。虽然CD163(M2巨噬细胞标志物)没有变化，但是CD86和HLA-DR(M1巨噬细胞标志物)的表达相较于hIgG组显著增加，这确认了A2抗体使M2向M1巨噬细胞转化，如图32C所示。

然后，分析M2向M1巨噬细胞转化对肿瘤生长的影响。

如图33A示意性地示出，将HCT-15结肠癌细胞(8x10⁶细胞/小鼠)和不同浓度的M2巨噬细胞(2.5x10⁵/5x10⁵/1x10⁶细胞/小鼠)的混合物注射至小鼠。2天后，每3天注射一次hIgG或A2抗体，总计5次注射。

如图33B所示，相较于hIgG对照小鼠，A2抗体在肿瘤注射后的第14天以剂量依赖方式减少或减缓肿瘤的生长，并且这种作用在肿瘤注射后的第25天持续存在。

然后，使用不同小鼠肿瘤模型评估人源化小鼠模型中A2抗体的抗肿瘤作用。如图34A示意性地示出，将人CD34细胞注入NBSGW小鼠，在此之后收集血液样品并测量PBMC中的人CD45细胞以观察小鼠在12～14周期间的人源化。将SW480结肠癌细胞(1x10⁷细胞/小鼠)注入小鼠，并在5天后将小鼠分为两组，每组注射hIgG或A2抗体(20mg/kg)。各组每三天注射一次抗体，总计5次注射。观察肿瘤大小并在处死小鼠后，将来自血液中的血清用于使用ELISA测量IFNγ，并将肿瘤样品用于分析浸润的白细胞。

如在图34B和34C所示，没有观察到A1抗体的抗肿瘤作用，但是来自A2抗体组的样品显示出更小的肿瘤大小，并且观察到IFNγ增加，这进一步确认了A2抗体的抗肿瘤作用。

总之，注射A2抗体的组显示出较小的肿瘤大小和血清中IFNγ的增加。此外，如图34D所示，观察到CD8⁺T细胞，特别是分泌IFNγ的CD8γT细胞增加。如图34E所示，观察到CD93和CD163(M2巨噬细胞标志物)表达减少，而CD86表达(M1巨噬细胞标志物)增加，而未观察到HLA-DR变化。这些数据证实，A2抗体介导CD8⁺T细胞的细胞毒活性。

然后，在人源化小鼠模型中比较了A2和A2.3抗体的抗肿瘤作用。如图35A示意性地示出，将人CD34细胞注入NBSGW小鼠，在此之后收集血液样品并测量PBMC中的人CD45细胞以观察小鼠在12～14周期间的人源化。将HCT-15结肠癌细胞以1x10⁷细胞/小鼠注入人源化小鼠中，并且在肿瘤大小生长至特定大小(约100mm³)后，将小鼠分为三组，各自接受hIgG、A2或A2.3抗体(20mg/kg)的注射。每三天注射一次抗体，总计5次注射。观察肿瘤大小，并在第一次注射后，在D5和D13收集血液样品，其中在来自血液的血清中发现了炎性细胞因子。如图35B所示，A2和A2.3抗体减小了肿瘤大小。

然后，评估四种抗VSIG4抗体A1、A1.3、A2和A2.3对CD8⁺T细胞增殖的作用。将A1、A1.3、A2和A2.3抗体添加到分离自供体的巨噬细胞，以将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，并与分离自同一供体PBMC的CD8⁺T细胞共培养，以进行共培养试验。CD8⁺T细胞用CFSE(生命技术公司公司(Life Technologies)，目录号V12883)标记，并在抗CD3涂覆的96孔板(BDBiocoat公司，目录号354725)中以2:1的比例与转化后的巨噬细胞共培养(CD8 T:巨噬细胞＝2x10⁵细胞/孔:1x10⁵细胞/孔)。5天后，用hCD8-V450对收获的细胞进行染色，并通过FACS分析进行分析。通过观察到CFSE水平降低证实了CD8⁺T细胞增殖。虽然M2巨噬细胞负调节CD8⁺T细胞增殖，但是A1、A1.3、A2和A2.3抗体的共培养导致M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，并导致CD8⁺T细胞增殖增加，如图36A和36B所示。

使用相对上述实验而言分离自不同供体(即不同于图36中的那些供体)的巨噬细胞和T细胞进行比较A2抗体和A2.3抗体作用的相似实验。将A2和A2.3抗体用于巨噬细胞，以将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，并与分离自同一供体PBMC的CD8⁺T细胞共培养，以进行共培养试验。CD8 T细胞用CFSE(生命技术公司公司，目录号V12883)标记，并在抗CD3涂覆的96孔板(BD Biocoat公司，目录号354725)中以1:1或2:1的比例与转化后的巨噬细胞共培养(CD8 T:巨噬细胞＝2x10⁵细胞/孔:2x10⁵细胞/孔或2x10⁵细胞/孔:1x10⁵细胞/孔)。5天后，用hCD8-V450对收获的细胞进行染色，并通过FACS分析进行分析。通过观察CFSE水平降低证实了CD8⁺T细胞增殖。虽然M2巨噬细胞负调节CD8⁺T细胞增殖，但是添加A2和A2.3抗体以将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，导致CD8⁺T细胞增殖增加。

然后，使用表达hVSIG4的HeLa细胞(HeLa-hVSIG4细胞)来确认VSIG4信号转导对A2和A2.3抗体介导的CD8⁺T细胞增殖诱导中的作用。

CD8⁺T细胞分离自健康供体的PBMC，用CFSE标记，并施加至抗CD3涂覆的板(2x10⁵细胞/孔)。1天后，在30GY辐照(X射线)后，将HeLa或HeLa-hVSIG4细胞添加到孔中(1x10⁵或0.5x10⁵细胞/孔)。5天后，通过使用FACS分析测量CFSE水平来分析CD8⁺T细胞增殖。还以不同浓度的抗CD3(美天旎生物技术公司，目录号130-093-387)处理CD8⁺T细胞，并在1天后，在30Gy辐照(X射线)后，将HeLa或HeLa-hVSIG4细胞添加到孔中(1x10⁵细胞/孔)。5天后，将100μl培养的细胞移至单独的96孔板，并向各孔添加CCK-8(10ul/孔)。5小时后，在450nm处测量吸光度，确认CD8⁺T细胞增殖。如图38A和38B所示，HeLa-hVSIG4负调节CD8⁺T细胞增殖，而用A2或A2.3处理诱导T细胞增殖。

人类磷酸激酶阵列用于检查由此A2抗体重新极化巨噬细胞的信号途径。如图39所示，如使用Proteome Profiler^TM抗体阵列(R&D系统公司(R&D Systems)，目录号ARY003B)测量，通过A2抗体处理转化M2巨噬细胞为M1巨噬细胞导致JNK、MSK1/2和p38a磷酸化的显著增加。

抗体序列和结合亲和力信息

下述表5-12中提供了本文所述的各种抗VSIG4抗体的序列信息和结合亲和力信息。

表5：EU103.2抗体的VH和VL序列

表6：EU103.3抗体的VH和VL序列

表7：A1抗体的VH和VL序列

表8：A2抗体的VH和VL序列

表9：A1.3抗体的VH和VL序列

表10：A2.3抗体的VH和VL序列

表11：EU103.2、EU103.3、A1、A2、A1.3和A2.3抗体的CDR序列

表12：EU103.2、EU103.3、A1、A2、A1.3和A2.3抗体对VSIG4的结合亲合力(K_D)

其它实施方式

应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。