用于在洁净度高的空间中制备细胞培养物的容器及套件
阅读说明：本技术 用于在洁净度高的空间中制备细胞培养物的容器及套件 (Container and kit for preparing cell cultures in a high-cleanliness space ) 是由 野口枝莉 结城理沙 于 2020-03-24 设计创作，主要内容包括：本发明的目的在于提供在制备细胞培养物时,不用导入用于准备洁净度高的空间的大规模设备而能够简便地在洁净的环境下进行细胞培养物的制备的用具。通过提供下述密闭的袋状容器能够解决上述课题,所述密闭的袋状容器具有：通过空气过滤器而成为ISO14644-1所规定的1～9级的洁净度的内部空间；能够从容器外进行容器内的操作的操作部；收纳用于制备各种细胞培养物所需要的物质的收纳部。(The purpose of the present invention is to provide a tool that can easily prepare a cell culture in a clean environment without introducing large-scale equipment for preparing a space with high cleanliness when preparing the cell culture. The above object can be achieved by providing a sealed bag-like container comprising: an internal space having a cleanliness of class 1 to 9 defined in ISO14644-1 by an air filter; an operation unit capable of performing an operation inside the container from outside the container; a storage part for storing substances required for preparing various cell cultures.)
技术领域
本发明涉及用于制备细胞培养物的密闭的袋状容器，所述密闭的袋状容器在内部包含用于制备细胞培养物的物质，且内部是洁净的。
背景技术
近年来，为了修复损伤的组织等，进行了移植各种细胞的尝试。例如，为了修复因心绞痛、心肌梗塞等缺血性心脏病而损伤的心肌组织，尝试利用胎儿心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞、心脏干细胞、ES细胞、iPS细胞等(非专利文献1)。
作为这种尝试的一例，开发了将细胞形成为片状的片状细胞培养物。这种细胞培养物的一部分利用已进入临床应用的阶段，已经在医疗现场中用于再生医疗等(非专利文献2)。
在制备临床应用中的细胞培养物时，需要在洁净度高的空间、例如无菌区域中进行作业(非专利文献2)。例如，专利文献1中公开了使无菌区域内的污染风险降低的细胞培养系统。专利文献2中公开了使交叉污染风险降低的细胞培养系统。然而，在任一系统中都需要导入隔离器等大规模的设备。此外，在专利文献1所记载的系统中，在将细胞培养物导入离心分离机、孵育箱时，存在穿过非无菌区域的风险，在专利文献2所记载的系统中，由于离心分离机等机械设置于无菌区域，因此在进行无菌化步骤时会蓄积对仪器的损伤。虽然也有不使用大规模设备的专利文献3所记载的系统，但其用途中仅包括将冷冻的细胞解冻，而不包括培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5592080号说明书
专利文献2：日本特开2010-259378号公报
专利文献3：日本特开2001-70402号公报
非专利文献
非专利文献1：Haraguchi等人,Stem Cells Transl Med.2012Feb；1(2):136-41
非专利文献2：HeartSheet(日文：ハートシート)(注册商标)附件文档(2019年2月修订)
发明内容
发明所要解决的课题
随着移植用的细胞培养物的临床应用的进展，愈加广泛地要求使用细胞培养物的处置。由于这种移植用的细胞培养物需要在实施移植手术的医院内进行制备作业，因此为了在临床应用中处理这些细胞培养物，在医院内也需要能高度地保持用于制备这些细胞培养物的洁净度的空间。为了准备这样的空间，必须导入大型设备，因此需要高额的设备投资费用，这种设备的导入、移植用的细胞培养物的处理限于一部分专业性高的医院。本发明的课题在于，在制备细胞培养物时，如何使大规模的设备为最小限度、简便地在洁净的环境下进行细胞培养物的制备。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现：在制备细胞培养物时，通过替代以往使用的隔离器、安全柜那样的大型设备，而使用利用空气过滤器等将内部的空间的洁净度提高的密闭的袋状容器，从而能够确保将用于制备细胞培养物的洁净度保持得充分高的空间。发现通过在该容器的内部制备细胞培养物，能够以无需导入大规模的设备的方式在洁净的空间中制备细胞培养物，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1]容器，其为密闭的袋状容器，所述容器具备：
用于将内部空间的洁净度维持在ISO14644-1所规定的1～9级的规定范围内的空气过滤器；
设置在内部的用于收纳细胞培养物的制备中使用的物质的1个或2个以上的收纳部；
能够从外部对所述细胞培养物的制备中使用的物质进行操作的操作部。
[2]根据[1]所述的容器，其具有能够伸缩的结构。
[3]根据[1]或[2]所述的容器，其由能够冷冻的材料构成。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的容器，其中，操作部具有向容器内部突出的手套状的结构。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的容器，其中，收纳部包括选自由以下各部组成的组中的1种或2种以上：
细胞培养部，其收纳所接种的细胞并进行培养；
液体收纳部，其用于收纳多种液体；
离心沉淀处理部，其收纳离心分离的细胞悬浮液；
细胞保存部，其收纳待培养的细胞；
废液部，其收纳废液。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的容器，其中，收纳部具有能够从容器分离的结构。
[7]根据[5]或[6]所述的容器，其中，细胞培养部具有温度响应性细胞培养基材。
[8]细胞培养物制备用套件，其包括[1]～[7]中任一项所述的容器。
[9]根据[8]所述的细胞培养物制备用套件，其还包括培养容器，所述培养容器具有温度响应性细胞培养基材。
[10]根据[8]或[9]所述的细胞培养物制备用套件，其还包括细胞培养物的制备中使用的器械。
[11]制备细胞培养物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)对要培养的细胞进行接种的步骤；
(ii)对细胞进行培养的步骤，
上述步骤在具备洁净度被维持在ISO14644-1所规定的规定范围内的空间、并且为密闭的能够伸缩的袋状容器内，通过来自外部的操作进行。
[12]根据[11]所述的制备细胞培养物的方法，其包括：a)对容器加热的步骤、b)将容器收纳在离心分离机的桶中的步骤、或c)将容器供于孵育箱的步骤，上述步骤在袋状容器收缩的状态下进行。
[13]根据[11]或[12]所述的制备细胞培养物的方法，其包括在袋状容器伸长的状态下使操作部和各收纳部能够使用的步骤。
[14]根据[11]～[13]中任一项所述的方法，其还包括在不影响容器内部的洁净度的情况下取出容器的内容物的步骤。
[15]根据[11]～[14]中任一项所述的方法，其中，所制备的细胞培养物为移植用细胞培养物。
[16]根据[15]所述的方法，其中，移植用细胞培养物为片状细胞培养物。
[17]移植用细胞培养物，其是通过[11]～[16]中任一项所述的方法制备的。
发明的效果
根据本发明，不需要导入大型的设备，只要准备本发明涉及的袋状容器、和根据需要的离心分离机、孵育箱等，就能够进行移植用的细胞培养物的处理。即，即使在能够实现导入大型设备的设备投资的大医院以外，只要是具有展开本发明涉及的容器的空间及离心分离机、孵育箱等仪器的医院，就能够进行移植用的细胞培养物的处理。
另外，使用本发明涉及的容器时，细胞培养物从制备的最初至使用时取出为止，持续处于作为洁净空间的容器内，因此没有与外界接触的机会，污染的风险也降低。
附图说明
[图1]图1为示出本发明的实施方式涉及的袋状容器的概略图。
[图2]图2为示出使袋状容器收缩并收纳于离心分离桶中的状态的概略图。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。
本发明的一个方面涉及用于制备细胞培养物的袋状容器。
本发明中，“细胞培养物”是指通过细胞培养而制备的物质，其中，细胞培养可以是粘附培养也可以是悬浮培养。细胞培养物不限于这些，为片状细胞培养物、注入用细胞培养物、块状细胞培养物。在一个方式中，细胞培养物用于细胞移植的用途。优选地，细胞培养物为移植用片状细胞培养物、培养软骨(例如，JACC(ジャック)(注册商标))。
片状细胞培养物是指细胞相互连结而成为片状的培养物。细胞彼此可以通过细胞粘附因子等而直接连结，也可以介由细胞外基质等而间接地连结。片状细胞培养物可以是单层，也可以是2层、3层、4层或其以上这样的多层，或者还可以是不具有层结构的立体结构。
本发明中，“袋状容器”是指能够形成使容器的内部与外界隔离的密闭空间的容器，具有能够在内部进行细胞培养物的制备的充分的大小。在一个方式中，容器具有能够伸缩的结构。其中，能够伸缩的结构包括容器成为波纹状而能够伸缩的结构，但不限于此。在一个方式中，容器具有为了保持内部的密闭性而在用于制备细胞培养物的用途的过程中不易产生孔、裂缝的结构。其中，所谓不易产生孔、裂缝的结构，包括容器成为双重结构的结构，但不限于此。在一个方式中，容器由能够冷冻的材料制成。其中，能够冷冻的材料包括聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯，但不限于这些。优选地，能够冷冻的材料是聚酯。例如，由于容器能够冷冻，因此能够在将冷冻细胞等收纳于容器内的状态下，连同容器一起进行冷冻保管。
一般而言，空气过滤器是用于从空气中去除垃圾、尘埃等从而形成洁净空气的部件。空气过滤器包括HEPA过滤器、ULPA过滤器、除气过滤器等，但不限于这些，用于空气净化器、洁净工作台等。
本发明中，“空气过滤器”被组装于容器的表面，成为将容器的内部与外界连接的唯一的部分。其中，空气过滤器在吸入外界的空气时，去除空气中的微粒等，不会将其带入容器的内部。另外，在将容器内部的空气排出时，空气过滤器捕捉内部物质，使它们不向外界逃逸。利用这种功能，空气过滤器能够将容器内部的空间保持洁净。并且，利用这种功能，空气过滤器不会因内部因素而污染外界。
在一个方式中，空气过滤器能够较高度保持容器内空间的洁净度。优选地，利用空气过滤器，容器内部的空间具有ISO14644-1或JIS B9920中所规定的1～9级的洁净度、或美国联邦标准209E中规定的1～100,000级的洁净度，进一步优选地，容器内的空间具有ISO14644-1的1～5级的洁净度。在一个方式中，可以为：容器在洁净度高的空间中制造，空气过滤器将容器内的空间持续保持为制造时的洁净度高的状态。在一个方式中，为了自发地提高容器内空间的洁净度，空气过滤器可以组装于空气洁净装置等中。在一个方式中，空气过滤器是排气过滤器。
在一个方式中，在使容器伸长时，介由空气过滤器将空气吸入容器内。其中，空气通过空气过滤器时，空气因尘埃、微粒等被除去而变得洁净。在一个方式中，在使容器收缩时，介由空气过滤器将容器内的空气排出。其中，空气通过空气过滤器时，就空气而言，存在于容器内的因素被除去，从而不会将它们带到外界。
本发明中，“操作部”是设置于容器的表面且能够从容器的外部对容器内进行操作的部分。在一个方式中，操作部形成向容器的内部突出的手套状的结构，能够将手放入其中而对位于内部的容器的部分或器械等进行操作。在一个方式中，操作部可以在容器收缩的状态下一同收缩，并且在容器伸长、容器内的空间扩大到能够扩展开操作部那样的程度时才成为能够使用的状态。
本发明中，“收纳部”是设置于容器内部的、对在细胞培养物的制备中使用的物质或在制备中产生的废液进行收纳的部分。其中，收纳部具有在细胞培养物的制备中能够开闭以使得收纳于内部的物质不会漏出至容器内的结构。在细胞培养物的制备中使用的物质为制备培养基、清洗液、缓冲液、细胞悬浮液、待培养的细胞、用于制备细胞培养物的器械，但不限于这些。其中，关于制备培养基、清洗液、缓冲液，能够使用用于细胞培养的已知的物质。另外，用于制备细胞培养物的器械是指除收纳部自身以外的用于制备细胞培养物的所有器械，包含移液器、吸头、滴管、镊子、刮刀，但不限于这些。在一个方式中，收纳部可以是多个。
收纳部可以包含选自由作为“细胞培养部”发挥功能的收纳部、作为“液体收纳部”发挥功能的收纳部、作为“离心沉淀处理部”发挥功能的收纳部、作为“细胞保存部”发挥功能的收纳部、作为“废液部”发挥功能的收纳部组成的组中的1者或2者以上的收纳部。在一个方式中，收纳部可以具有在不影响容器内的洁净度的条件下可从容器分离的结构。可从容器分离的结构是指，例如能够在利用来自容器外的热封等而将容器内和收纳部的空间进行分隔的状态下、以不影响容器内的空间的方式将收纳部分离的结构等。在一个方式中，为了在容器外测定细胞悬浮液的浓度，收纳部可以收纳细胞悬浮液的一部分并被分离。
其中，“细胞培养部”是收纳所接种的细胞制备细胞培养物的部分。在一个方式中，细胞培养部可以是培养容器。培养容器能够使用用于细胞培养的已知的容器，包括培养皿、培养烧瓶、微孔板，但不限于这些。作为优选的方式，细胞培养部的底面被培养基材包覆。培养基材能够使用用于细胞培养的已知的培养基材，包括胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等，但不限于这些。作为进一步优选的方式，细胞培养部的底面被温度响应性细胞培养基材包覆，例如能够使用作为株式会社Cellseed的UpCell(注册商标)而市售的产品。
其中，“液体收纳部”是收纳除用于制备细胞培养物的细胞以外的各种液体的收纳部，是能够收纳培养基、清洗液、缓冲液等的部分。在一个方式中，液体收纳部可以具有能够以使内部液体不漏出的方式密闭的可开闭的结构。该结构例如为卡盘等。
其中，“离心沉淀处理部”是在细胞培养物的制备中，为了收纳细胞悬浮液并进行离心分离而形成适于离心分离的结构的部分。其中，适于离心分离的结构是指：不因在进行离心分离时所施加的离心力而破损、变形，并具有前端尖锐的结构以使得在进行离心分离后细胞与上清液易于分离，但不限于此。
其中，“细胞保存部”是收纳在细胞培养物的制备作业前的待培养的细胞的部分。在一个方式中，细胞保存部可以在容器内收纳有包含细胞的冷冻小瓶。
其中，“废液部”是收纳在细胞培养物的制备中所产生的废液的部分，为如下结构：所收纳的废液不会泄漏至废液部的外部，不会对收纳于其他收纳部的液体、培养物等造成影响。
在一个方式中，收纳部可以兼具多个功能。例如，某个收纳部可以具有离心沉淀处理部和细胞保存部这两者的功能，即，保存有待培养的细胞的收纳部具有适于离心分离的结构，可以向其中加入清洗液，制成细胞悬浮液，供于离心分离。例如，收纳用于制备细胞培养物的器械的收纳部可以在取出器械后作为废液部使用。
本发明的一个方面涉及包含上述袋状容器的、用于制备细胞培养物的套件。
本发明中的套件可以包含例如用于制备细胞培养物的细胞、制备培养基、清洗液、缓冲液、培养容器、离心沉淀管、试管、用于细胞培养的器械、输送容器、使用说明书等，但不限于这些。
本发明的另一方面涉及使用洁净度得以保持的、密闭的能够伸缩的袋状容器来制备细胞培养物的方法。
其中，“能够伸缩”是指，能够在不对洁净度等内部状态造成影响的情况下使容器伸长和/或使容器收缩。
本发明中，“细胞培养物的制备”包括以下的步骤：(i)将冷冻细胞加热、融解的步骤；(ii)将细胞转移至能够离心分离的容器的步骤；(iii)向转移的细胞中加入清洗液的步骤；(iv)进行离心分离，将上清液与细胞分离的步骤；(v)将上清液废弃的步骤，其中，根据需要，步骤(iii)～(v)可以重复多次，另外细胞未被冷冻的情况下，步骤(i)～(v)是不需要的；(vi)向细胞中加入培养基并悬浮，接种到适于培养的容器中的步骤；(vii)将接种的细胞进行孵育的步骤：(viii)将通过上述步骤中的孵育而制成的细胞培养物用缓冲液清洗的步骤；(ix)回收细胞培养物的步骤，但不限于这些。
在一个方式中，“细胞培养物的制备”可以在(i)的步骤之后从(vi)的步骤继续。此时，保存冷冻细胞的溶液的成分通过培养基更换而被去除。
在一个方式中，“细胞培养物的制备”可以包括：对容器加热的步骤、将容器收纳在离心分离机的桶中的步骤、或供于孵育箱的步骤，上述步骤在袋状容器收缩的状态下进行。在一个方式中，“细胞培养物的制备”可以包括在袋状容器伸长的状态下使操作部及各收纳部能够使用的步骤。例如，通过使容器处于收缩的状态，能够减小容器的占有体积，在细胞培养物的制备中能够将其收纳于现有的离心分离机或孵育箱等中。例如，通过使容器处于伸长的状态，能够增大容器内的体积，从而在细胞培养物的制备中能够提供充分的作业空间。
在一个方式中，“细胞培养物的制备”可以还包括在不影响容器内的洁净度的情况下取出容器的内容物的步骤。例如，通过该步骤，能够将收纳有使用后的液体的收纳部、使用后的废液部分离至容器外。另外，例如通过该步骤，能够将上述步骤(iii)～(v)中的细胞悬浮液取出至容器外并测定细胞浓度。
以下，针对本发明的优选的实施方式，参照附图详细地进行说明。
图1是本发明的实施方式涉及的容器的概念图。需要说明的是，本申请的附图中，为了容易进行说明，各部分的大小、配置被适当放大，图中的各部分并不表示实际的大小、配置。
如图1所示，本发明的实施方式涉及的容器1包括空气过滤器2、操作部3、收纳部4。容器1可以还包括待培养的细胞5、用于制备细胞培养物的器械6。操作部2以能够实现下述作业的方式构成：将手放入来使用各收纳部。收纳部4也能够以任选地包括细胞培养部41、离心沉淀处理部42、液体收纳部43的方式构成。另外，收纳部4也能够以任选地还包括细胞保存部44的方式构成。
接下来，对使用容器1来制备细胞培养物时的作业的概略进行说明。
使用者对发货状态的容器1或收缩状态的容器1进行加热，使位于细胞保存部44的冷冻细胞融解。例如，加热通过浸入设定为37℃的恒温热水浴中来进行。另外，通过使容器收缩并进行加热，能够减小用于加热的仪器的大小，并且热容易传递到冷冻细胞。接下来，使容器1伸长，扩大容器内的空间，使操作部3及各收纳部4能够使用。
使用者将手放入操作部3，将融解的冷冻细胞移至离心沉淀处理部42。进而，向其中添加收纳于任意液体收纳部43的清洗液(以下，称为清洗液)。根据需要，清洗液的添加分几个阶段进行。
使用者使容器1收缩，将该收缩状态的容器收纳于离心分离机的离心桶中进行离心分离。图2示出将收缩状态的容器1收纳于离心分离机时的概略图。此时，通过使容器收缩，能够收缩至能够收纳于现有的离心分离桶的尺寸，从而能够使用现有的离心分离机。
离心分离后，使容器1伸长，使操作部3及各收纳部4能够使用，介由操作部3将离心沉淀处理部42的上清液废弃至废液部45。进而，加入清洗液，重复进行上述离心分离操作。
结束最后的离心分离操作，再次使容器1伸长，弃去上清液后，将收纳于任意液体收纳部43的制备培养基加入细胞中进行悬浮。
其中，在最后的离心分离操作之前，对于在收纳部4中能够分离的部分，通过以其中包含细胞悬浮液的方式且以不影响容器内的洁净度的方式进行分离，从而将细胞悬浮液取出至容器外，通过测定该细胞悬浮液的细胞浓度，能够算出添加至制备培养基中的细胞悬浮液量。例如，细胞浓度可以在容器外使用血细胞计数板测定。
使用者将悬浮在制备培养基中的细胞接种于细胞培养部41。然后，使容器1收缩，将该收缩状态的容器1供于孵育箱进行培养。例如，培养在CO2孵育箱中进行2～26小时。此时，通过使容器收缩，能够减小孵育箱内的容器的占有体积，能够将多个容器供于1个孵育箱。
培养结束后，将培养上清液废弃至废液部45，用收纳于任意液体收纳部42的缓冲液进行清洗。根据需要进行多次清洗。
根据需要静置细胞培养物，然后，在洁净度高的例如手术室等中将容器1开封，回收细胞培养物。
产业上的可利用性
通过使用本发明的容器，能够在不需要导入用于准备洁净度高的空间的大规模设备的条件下制备细胞培养物。因此，不需要用于导入大规模设备的高额投资，即使在中等规模医院中也能够进行使用期限短的移植用细胞培养物的处理，使用移植用细胞培养物的再生医疗能够更加广泛地普及。
附图标记说明
1 容器
2 空气过滤器
3 操作部
4 收纳部
41 细胞培养部
42 离心沉淀处理部
43 液体收纳部
44 细胞保存部
45 废液部
5 待培养的细胞
6 用于制备细胞培养物的器械。
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