一种锌铝离子识别荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种锌铝离子识别荧光探针及其制备方法和应用 (Zinc-aluminum ion recognition fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 李培勇 芦鑫淼 秦敬灿 朱新远 于 2021-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种锌铝离子识别荧光探针及其制备方法和应用,荧光探针分子内含有席夫碱结构及三个苄基集团。本发明提供的锌铝离子荧光探针具有双机制、双响应、高灵敏度性和高特异性、不受其他金属离子影响、易被细胞摄取、细胞毒性低等特点。将该探针应用于前列腺癌患者的外周血,可以对血清中的锌含量进行定量检测,为疑似前列腺癌患者的诊断提供宝贵信息。将其与前列腺癌血清PSA检测结合,可以有效提升前列腺癌的诊断准确性,避免血清PSA处于灰度区间内的患者的穿刺诊断需要,进而避免过度诊断和过度治疗的发生。(The invention provides a zinc-aluminum ion recognition fluorescent probe and a preparation method and application thereof. The zinc-aluminum ion fluorescent probe provided by the invention has the characteristics of double mechanisms, double response, high sensitivity, high specificity, no influence of other metal ions, easy cell uptake, low cytotoxicity and the like. The probe is applied to peripheral blood of a prostate cancer patient, can quantitatively detect the zinc content in serum, and provides valuable information for diagnosis of a suspected prostate cancer patient. The kit is combined with prostate cancer serum PSA detection, so that the diagnosis accuracy of prostate cancer can be effectively improved, the puncture diagnosis requirement of a patient with serum PSA in a gray scale interval is avoided, and the occurrence of over-diagnosis and over-treatment is further avoided.)
技术领域
本发明涉及荧光探针
技术领域
，尤其涉及一种锌铝离子识别荧光探针及其制备方法和应用。背景技术
前列腺癌是男性患病率最高的癌症，且近些年来发病率存在明显的年轻化趋势。在正常的前列腺中，腺体细胞结构完整，腺体功能正常，血清中的PSA水平一般低于1ng/mL。但是当前列腺发生癌变后，前列腺细胞和组织的形态和结构被破坏，导致细胞表面的抗原泄露进入血清中，血清PSA水平升高。因此一般前列腺癌患者相较于正常患者具有更高的血清PSA含量。尽管血清PSA含量被认为是前列腺癌的重要诊断生物标志，但由于在一些良性前列腺病变(如前列腺增生、局部炎症、感染等)过程中，也伴随着血清PSA水平的升高，因此血清PSA检测对前列腺癌诊断缺乏确定性和特异性，其临床应用受到了限制。
前列腺发生癌变后，腺体内及血清中锌的含量明显降低，而在非癌性病变中，则未观察到血清锌含量的明显变化。血清中锌水平的检测，可以作为血清PSA含量评估的互补和参照，用于实现前列腺癌的精准诊断。对于游离锌的检测目前存在多种方式，其中电感耦合等离体子质谱(ICP-MS)是最常见的方式。但是该检测方式受限于仪器和检测价格昂贵，在推广和应用于临床过程中存在困难。荧光探针由于其价格低廉，操作简单及可视化检测等多种优点，在医学诊断和检测等过程中越来越受到瞩目。
目前也存在多种锌响应的荧光探针，此类探针大多具有一个可与锌特异性识别配位的2-甲吡啶氨基基团。首先在荧光分子中通过安装该基团，借由该基团和荧光分子之间的光诱导电子转移效应(PET)猝灭荧光分子自身荧光，当识别基团特异性的和游离的锌离子配位后，PET效应被阻断，荧光恢复。通过恢复荧光的荧光强度即可对锌离子进行定量检测。但是，此类探针大多具有聚集荧光猝灭(ACQ)效应，即在固态和聚集状态下荧光发生猝灭，影响其检测结果的准确性。聚集诱导发光(AIE)荧光是一类在分散体系中不产生荧光或者荧光微弱，但在聚集状态下可产生明显荧光的分子，开发锌响应的具有AIE荧光探针，可以有效避免荧光探针在检测过程中由于浓度、分子间相互作用等原因发生聚集而导致的荧光猝灭，提高检测准确度。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种双机制、双响应的锌铝离子识别荧光探针。
本发明的第二个目的在于，提供双机制、双响应的锌铝离子识别荧光探针的制备方法。
本发明的第三个目的在于，提供双机制、双响应的锌铝离子识别荧光探针的应用。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种锌铝离子识别荧光探针(3,4,5-Tris-benzyloxy-benzoic acid(2-hydroxy-benzylidene)-hydrazide，缩写HL)，其结构式为：
为了实现上述第二个目的，本发明提供了锌铝离子识别荧光探针的制备方法，所述制备方法为：将3,4,5-三羟基苯甲酸乙酯与苄基氯在碳酸钾作为缚酸剂条件下，通过取代反应得到3,4,5-三苄氧基苯甲酸甲酯，接着3,4,5-三苄氧基苯甲酸甲酯肼解得到3,4,5-三苄氧基苯甲酰肼，3,4,5-三苄氧基苯甲酰肼和水杨醛通过缩合反应得到所述探针。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了锌铝离子识别荧光探针在检测血清锌铝含量中的应用。
本发明的荧光探针HL分子内含有席夫碱结构及三个苄基集团。在乙醇溶剂中，席夫碱单元可以通过光诱导电子转移(PET)作用淬灭荧光探针的荧光，当席夫碱单元和铝离子以1:1形式结合配位后，PET效应消失，蓝色荧光恢复。在DMF溶剂中，荧光探针分子分散，相距较远，苄基之间无法形成有效的分子间π-π堆积作用，荧光探针不发生聚集，聚集诱导发光(AIE)消失，当席夫碱单元和锌离子以2:1的形式结合配位后，多个荧光探针分子相互靠近，荧光探针的苄基之间产生分子间π-π作用，导致荧光探针配位后聚集，产生绿色的AIE荧光。
荧光探针HL分子内的席夫碱结构单元具有螯合金属离子的功能，其可以通过1:1和1:2的形式与铝离子和锌离子配位结合。分子内具有3个苄基结构，可以在荧光探针和锌离子以2:1的形式发生配位后，通过分子间π-π作用使荧光探针分子发生聚集。荧光探针在锌铝离子响应后产生荧光增强，且荧光增强与锌铝离子浓度呈现良好的线性关系，另外，荧光探针HL中的席夫碱结构只与锌铝离子发生配位结合，而不与其他金属离子发生配位关系。
本发明的优点在于，本发明提供的锌铝离子荧光探针HL具有双机制、双响应、高灵敏度性和高特异性、不受其他金属离子影响、易被细胞摄取、细胞毒性低等特点。将该探针应用于前列腺癌患者的外周血，可以对血清中的锌含量进行定量检测，为疑似前列腺癌患者的诊断提供宝贵信息。将其与前列腺癌血清PSA检测结合，可以有效提升前列腺癌的诊断准确性，避免血清PSA处于灰度区间内的患者的穿刺诊断需要，进而避免过度诊断和过度治疗的发生。
附图说明
图1为荧光探针合成示意图。
图2为荧光探针核磁表征。
图3a荧光探针HL和锌离子响应后紫外光谱的变化。
图3b荧光探针HL和锌离子响应后荧光光谱的变化。
图3c HL和锌离子响应后荧光强度和锌离子浓度间的线性关系。
图3d HL和铝离子响应后紫外光谱的变化。
图3e HL和铝离子响应后荧光光谱的变化。
图3f HL和铝离子响应后荧光强度和铝离子浓度间的线性关系。
图4a HL和锌离子识别特异性研究。
图4b非特异性离子对HL和锌离子之间荧光响应的影响。
图4c HL和锌离子配位的JOB曲线。
图4d HL和铝离子识别特异性研究。
图4e非特异性离子对HL和铝离子之间荧光响应的影响。
图4f HL和铝离子配位的JOB曲线。
图5为细胞中荧光探针和锌铝离子的响应，其中a：细胞直接和含有荧光探针的培养基孵育后的明场、锌响应荧光、铝响应荧光图像；b：细胞预先和含有锌、铝离子的培养基孵育后再和含有荧光探针的培养基孵育后的明场、锌响应荧光、铝响应荧光图像。
图6为前列腺癌患者、正常人和前列腺非癌性病变患者的前列腺癌血清锌测试结果。a为前列腺癌患者、b为正常人、c为前列腺非癌性病变、d为患者的前列腺癌血清锌测试结果。
图7位阴性对照分子的结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：荧光探针的合成和表征
配体荧光探针HL的合成如图1所示。其由3,4,5-三苄氧基苯甲酰肼和水杨醛通过简单的缩合反应得到。3,4,5-三苄氧基苯甲酰肼则是以没食子酸甲酯为初始原料分两步制备而成，首先没食子酸甲酯与苄基氯在碳酸钾作为缚酸剂条件下，通过取代反应得到3,4,5-三苄氧基苯甲酸甲酯，接着3,4,5-三苄氧基苯甲酸甲酯肼解得到3,4,5-三苄氧基苯甲酰肼，同时配体荧光探针经过核磁等手段表征证实我们得到了非常纯的产物，荧光探针核磁表征如图2所示。
3,4,5-三苄氧基苯甲酸乙酯的合成(对应a)
将3,4,5-三羟基苯甲酸乙酯(4.6g，0.025mole)和碳酸钾(12.42g，0.09mole)溶解在40ml无水DMF中，并在室温下搅拌0.5h。然后将苄基氯(10.4g，0.081摩尔)加入上述反应混合物中。将该溶液加热至90～100℃，同时搅拌20小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，并倒入250ml纯水中。过滤粗产物，并从乙醇中重结晶，得到最终产物，为白色固体。产率：55％，熔点：79-80℃。
3，4，5-三苄氧基苯甲酰肼的合成(对应b)
将水合肼(80％，12mL)加入到3,4,5-三苄氧基苯甲酸乙酯(0.00445mol，2g)的甲醇溶液(100mL)中。将反应混合物在70℃下搅拌24小时。观察到白色絮状沉淀，将沉淀过滤并用EtOH(30mL)洗涤3～5次即可得到目的产物。熔点：183-184℃。
3,4,5-三苄氧基-苯甲酸(2-羟基-亚苄基)-酰肼的合成(即荧光探针HL，对应c)
将3,4,5-三苄氧基苯甲酰肼(1mmol，0.451g)的乙醇溶液(30mL)添加到含有水杨醛(1mmol，0.122g)的乙醇(20mL)中。然后混合溶液搅拌回流12小时，出现一些白色沉淀物。冷却至室温后，将混合物过滤并从乙醇和DMF中重结晶即可得到目的产物。产率：83％。熔点：249-250℃。
实施例2：荧光探针HL与锌、铝离子响应的光谱行为及特异性研究
配置2mM的荧光探针甲醇溶液，而后稀释100倍得到浓度为20μM的HL甲醇溶液。利用不同的金属硝酸盐配置得到浓度为20μM的各类金属离子水溶液。将金属离子的水溶液逐滴滴加到上述20μM的HL甲醇溶液中，记录荧光探针甲醇溶液紫外吸收光谱和荧光发射光谱的变化。在滴定完成后，继续在上述混合溶液中滴加20μM的锌、铝离子水溶液，进一步记录荧光发生光谱的变化。同时，在浓度为20μM的HL溶液中加入不停浓度的锌、铝离子水溶液，测定不同锌、铝离子浓度下混合溶液整体的荧光强度，构建锌、铝离子浓度-荧光强度标准曲线。此外，将1mL，20μM的荧光探针甲醇溶液至于样品瓶中，缓慢滴加20μM的锌、铝离子溶液，在添加过程中不断测定体系的荧光强度，勾画JOB曲线，确定荧光强度最强处锌、铝离子的量和荧光探针量的比值，即为荧光探针HL和锌铝离子配位时的配位比。荧光探针HL与锌、铝离子配位后紫外光谱和荧光光谱的变化及荧光强度和离子浓度的线性标准曲线如图3a-图3f所示，结果表明，荧光探针HL响应锌、铝离子后，300nm处的紫外吸收峰消失，而在400nm/385nm产生新的吸收峰。以该波长作为响应后探针的激发波长，配位相应后荧光探针-Zn2+的最大荧光发射波长在509nm处，通过AIE效应产生绿色荧光，荧光探针HL-Al3+的最大荧光激发波长在450nm处，通过PET效应产生蓝色荧光。荧光探针HL和锌、铝离子配位识别特异性、JOB配位曲线如图4a-图4f所示，除锌、铝离子外，其他的非特异性离子与荧光探针HL之间基本不发生配位作用，荧光探针荧光不发生明显变化，而锌、铝离子则可以分别通过AIE机制和PET机制开启HL荧光，并且荧光强度和离子浓度存在良好的线性关系。而JOB曲线则揭示荧光探针和锌、铝离子的配位比分别为2:1和1:1。
实施例3：细胞中的锌铝离子响应成像与监控
PC-3前列腺癌分2组均以8万个每孔的细胞密度铺于12孔细胞培养板中，过夜贴壁。细胞贴壁后将旧培养基移除，其中1组加入纯新鲜培养基培养，另1组分别加入20μM锌离子、铝离子的新鲜培养基，而后继续孵育30分钟。孵育完成后，移除培养基，利用新鲜培养基洗涤细胞2次后，2组细胞再次加入20μM的荧光探针培养基溶液(DMSO最为助溶剂，浓度低于千分之一)，细胞再次孵育30分钟，而后移除培养基，PBS洗涤细胞两次后，利用荧光显微镜对细胞进行观察，其结果如图5所示。由于细胞自身及培养基本身含有锌，细胞在和HL孵育后产生明显的绿色荧光，同时外加锌离子可以使荧光有略有增加。而铝离子作为细胞毒性物质，本身在细胞内含量极低，未能被检测到，而外加铝离子后，细胞呈现明显的蓝色荧光，表明荧光探针HL可以对细胞内铝含量的变化做出有效的动态监控。
实施例4：前列腺癌外周血血清锌含量测定
搜集13位前列腺癌患者、10位前列腺癌非癌性病变患者以及15位正常患者的外周血各20mL。高速离心取后分离得到血清各3mL。而后在血清中加入2mL的DMF，涡旋3min沉淀血清中的生物大分子后离心，取200μL上清液和20μM的荧光探针溶液(溶于DMF:水体积比2:3)混合后，测得其荧光强度，确定血清中的锌含量，同时前列腺癌和非癌性病变患者血清中的PSA含量也同时利用平行样本所确定。各样本中血清锌含量的测试结果如图6所示，患者的临床信息如表1所示。实验结果表明。根据单纯的血清PSA水平难以实验前列腺癌的准确诊断，在PSA位于4—10ng/mL甚至＞10ng/mL的区间内仍然存在前列腺非癌性病变的可能。同时，单一的锌含量也不能完全的指征前列腺癌的发生，在部分前列腺癌患者中存在和正常血清相近的血清锌含量(例如案例x和y所示)。因此，将前列腺癌疑似患者的血清PSA含量和锌含量进行同步测定，用于前列腺癌的联合诊断，可以有效提高前列腺癌的诊断准确性，一方面可以防止假阳性的出现而延误治疗时间，另一方面可以防止假阳性的出现以避免过度诊断和过度治疗。
表1：患者及健康志愿者的临床信息
实施例5：荧光探针HL分子结构中三苄基结构在锌识别的AIE荧光产生过程中的作用研究
为了确定HL中的三个苄基结构在其锌离子识别及AIE荧光产生过程中的作用，将苄基结构替换为乙基，其余结构及对应合成方式不变，得到阴性控制对照分子，其结构如下图7所示。将去与锌离子混合，发现其不具有响应锌离子后产生绿色AIE荧光的功能。因此有理由推定，HL中的三个苄基结构在识别锌离子产生AIE荧光的过程中发挥着重要作用。在锌离子和HL配位过程中，与锌配位的两个HL由于相互接近且构象受限，分子中的3个苄基位于同一平面，促使两分子HL分子之间产生π-π堆积作用，形成最小聚集单位。而后多个聚集单元之间再次通过分子间的π-π堆积作用发生进一步聚集，最终产生聚集诱导发光荧光(AIE)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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