具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

需要说明的是，本说明书中的抗体的氨基酸序列基于Kabat定义。

本发明为一种抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段，其为包含下述的氨基酸序列的、经分离的人源化抗体(包括全人源化抗体。)或小鼠-人嵌合抗体。

重链的CDR1的氨基酸序列为序列号1的氨基酸序列，

重链的CDR2的氨基酸序列为序列号2的氨基酸序列，

重链的CDR3的氨基酸序列为序列号3的氨基酸序列，

轻链的CDR1的氨基酸序列为序列号4的氨基酸序列，

轻链的CDR2的氨基酸序列为序列号5的氨基酸序列，及

轻链的CDR3的氨基酸序列为序列号6的氨基酸序列。

上述重链的CDR1～CDR3及轻链的CDR1～CDR3的氨基酸序列分别任选为与上述序列号1～6所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的氨基酸序列。

即，上述重链的CDR1～CDR3及轻链的CDR1～CDR3的氨基酸序列只要使它们所构成的抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的抗原结合活性与上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段实质上相同，则可以分别为与上述序列号1～6所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的氨基酸序列。

另外，上述重链的CDR1～CDR3及轻链的CDR1～CDR3的氨基酸序列只要使它们所构成的抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段具有抑制平足蛋白与存在于血小板上的CLEC-2的结合的活性，则可以分别为与上述序列号1～6所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的氨基酸序列。

与规定的氨基酸序列具有规定的同一性的氨基酸序列是指：在该规定的氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加而形成的氨基酸序列。

该置换优选为保守性置换。“保守性置换”是指：按照实质上不改变肽的活性的方式，将氨基酸残基用其它的化学性质类似的氨基酸残基进行置换。可列举例如：将某一疏水性残基用其它疏水性残基置换的情况；将某一极性残基用具有相同电荷的另一极性残基置换的情况；等。作为可以进行这样的置换的、功能类似的氨基酸的例子，就非极性(疏水性)氨基酸而言，可列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷的(碱性)氨基酸，可列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为具有负电荷的(酸性)氨基酸，可列举天冬氨酸、谷氨酸等。

本发明的“经分离的”是指：不是存在于生物体内。例如，不包括由某个体产生且存在于该个体内的状态的抗体。

本发明的“人源化抗体”是可变区由来自公知的小鼠PG4D2抗体的互补性决定区和来自人抗体的框架区构成、恒定区由来自人抗体的恒定区构成的抗体。关于上述人抗体的亚型，只要可发挥本发明的效果就没有特别限制，优选为IgG，更优选为IgG4。作为恒定区的氨基酸序列，为例如该IgG4抗体的恒定区的氨基酸序列，作为其重链的氨基酸序列可列举序列号25的氨基酸序列，作为轻链的氨基酸序列可列举序列号26的氨基酸序列。需要说明的是，本发明的“人源化抗体”可以是“全人源化抗体”。

本发明的“小鼠-人嵌合抗体”中，可变区为来自公知的小鼠PG4D2抗体的可变区，恒定区为来自人抗体的恒定区。关于上述人抗体的亚型，只要可发挥本发明的效果就没有特别限制，优选为IgG，更优选为IgG4。作为恒定区的氨基酸序列，为例如该IgG4抗体的恒定区的氨基酸序列，与上述同样地，作为重链的氨基酸序列，可列举序列号25的氨基酸序列，作为轻链的氨基酸序列，可列举序列号26的氨基酸序列。

本发明中“包含抗原结合区域的抗体片段”是指：包含抗体的一部分且能够与抗原结合的蛋白质。作为抗体片段的例子，可列举F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv(variable fragmentof antibody，抗体的可变区片段)、二硫键抗体(disulfide-bond Fv)、单链抗体(scFv)、及这些的聚合物等。该抗体片段可以通过化学方式或基因工程学方式结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子、白蛋白、酶、其它抗体等功能分子。

上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段只要可发挥本发明的效果则优选为人源化抗体，优选可变区包含下述(I)或(II)的氨基酸序列。

(I)：

重链的CDR1的氨基酸序列为序列号1的氨基酸序列，

重链的CDR2的氨基酸序列为序列号2的氨基酸序列，

重链的CDR3的氨基酸序列为序列号3的氨基酸序列，

轻链的CDR1的氨基酸序列为序列号4的氨基酸序列，

轻链的CDR2的氨基酸序列为序列号5的氨基酸序列，

轻链的CDR3的氨基酸序列为序列号6的氨基酸序列，

重链的FR1的氨基酸序列为序列号7的氨基酸序列，

重链的FR2的氨基酸序列为序列号8的氨基酸序列，

重链的FR3的氨基酸序列为序列号9的氨基酸序列，

重链的FR4的氨基酸序列为序列号10的氨基酸序列，

轻链的FR1的氨基酸序列为序列号11的氨基酸序列，

轻链的FR2的氨基酸序列为序列号12的氨基酸序列，

轻链的FR3的氨基酸序列为序列号13的氨基酸序列，及

轻链的FR4的氨基酸序列为序列号14的氨基酸序列；

(II)：

重链的CDR1的氨基酸序列为序列号1的氨基酸序列，

重链的CDR2的氨基酸序列为序列号2的氨基酸序列，

重链的CDR3的氨基酸序列为序列号3的氨基酸序列，

轻链的CDR1的氨基酸序列为序列号4的氨基酸序列，

轻链的CDR2的氨基酸序列为序列号5的氨基酸序列，

轻链的CDR3的氨基酸序列为序列号6的氨基酸序列，

重链的FR1的氨基酸序列为序列号7的氨基酸序列，

重链的FR2的氨基酸序列为序列号15的氨基酸序列，

重链的FR3的氨基酸序列为序列号16的氨基酸序列，

重链的FR4的氨基酸序列为序列号10的氨基酸序列，

轻链的FR1的氨基酸序列为序列号11的氨基酸序列，

轻链的FR2的氨基酸序列为序列号12的氨基酸序列，

轻链的FR3的氨基酸序列为序列号13的氨基酸序列，及

轻链的FR4的氨基酸序列为序列号14的氨基酸序列。

上述(I)中，上述重链的FR1～FR4及轻链的FR1～FR4的氨基酸序列分别任选为与上述序列号7～14所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的氨基酸序列，上述(II)中，上述重链的FR1～FR4及轻链的FR1～FR4的氨基酸序列分别任选为与上述序列号7、15、16、10～14所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的氨基酸序列。其详细情况与前述内容相同。

另外，上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段如前述那样只要可发挥本发明的效果则还优选为小鼠-人嵌合抗体，还优选可变区包含下述的氨基酸序列。

重链的CDR1的氨基酸序列为序列号1的氨基酸序列，

重链的CDR2的氨基酸序列为序列号2的氨基酸序列，

重链的CDR3的氨基酸序列为序列号3的氨基酸序列，

轻链的CDR1的氨基酸序列为序列号4的氨基酸序列，

轻链的CDR2的氨基酸序列为序列号5的氨基酸序列，

轻链的CDR3的氨基酸序列为序列号6的氨基酸序列，

重链的FR1的氨基酸序列为序列号17的氨基酸序列，

重链的FR2的氨基酸序列为序列号18的氨基酸序列，

重链的FR3的氨基酸序列为序列号19的氨基酸序列，

重链的FR4的氨基酸序列为序列号20的氨基酸序列，

轻链的FR1的氨基酸序列为序列号21的氨基酸序列，

轻链的FR2的氨基酸序列为序列号22的氨基酸序列，

轻链的FR3的氨基酸序列为序列号23的氨基酸序列，及

轻链的FR4的氨基酸序列为序列号24的氨基酸序列。

上述重链的FR1～FR4及轻链的FR1～FR4的氨基酸序列分别任选为与上述序列号17～24所示的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上的同一性的氨基酸序列。其详细情况与前述内容相同。

本发明的抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段可以基于构成该结构的氨基酸序列使用公知的基因工程学方法制造。

另外，在该制造中，可以包含回收所得到的上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的工序。该回收工序可以是纯化工序、浓缩工序等。在该纯化工序中，可以使用公知的纯化技术，可以纯化至本发明的抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段达到均一为止。

本发明的抗平足蛋白抗体包括多特异性抗体、功能修饰抗体及缀合抗体。作为其制造方法，可列举公知的方法。

本发明的另一方式为平足蛋白与CLEC-2的结合抑制剂(以下有时称为“本方式的结合抑制剂”等)，其包含上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段。

需要说明的是，本方式的结合抑制剂可以是结合抑制用组合物。另外，本方式的结合抑制剂及结合抑制用组合物可以是混合物，其成分可以均一也可以不均一。

本方式的结合抑制剂具有抑制平足蛋白与CLEC-2的结合的作用，因此具有通过抑制平足蛋白与CLEC-2的结合而得到的效果。

本方式的结合抑制剂可以含有上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段中的一种，也可以含有多种。

相对于本方式的结合抑制剂总量的、上述抗平足蛋白抗体或包含其抗原结合区域的抗体片段的含量只要可抑制平足蛋白与CLEC-2的结合就没有特别限定，以上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的总量计，通常为0.5mg/mL以上，优选为1mg/mL以上，更优选为10mg/mL以上，另外，通常为500mg/mL以下，优选为200mg/mL以下，更优选为100mg/mL以下。

关于本方式的结合抑制剂的其它详细情况，援引后述的“包含上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的药物组合物”中的记载。

本发明的另一方式为药物组合物(以下有时称为“本方式的药物组合物”等。)，其包含：上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段。

本方式的药物组合物具有抑制平足蛋白与CLEC-2的结合的作用，因此具有通过抑制平足蛋白与CLEC-2的结合而得到的效果。可列举例如癌细胞的增殖或转移的抑制效果、血小板聚集抑制效果、抗血栓效果、抗炎症效果等。因此，本方式的药物组合物可以作为用于抑制癌细胞的增殖或转移、抑制血小板聚集、用于抗血栓、或用于抗炎症的药物组合物等来利用。

上述癌细胞优选为平足蛋白阳性的肿瘤细胞。平足蛋白阳性的肿瘤细胞可列举例如间皮瘤、脑肿瘤、睾丸肿瘤、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、海绵状血管瘤、血管肉瘤、肺鳞状上皮癌、卵巢癌无性细胞瘤、神经胶质瘤、生殖细胞瘤、头颈部癌、肺癌、膀胱癌、骨骼和软组织肿瘤(原发性骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤)、软组织肉瘤))、食道癌的细胞等。

因此，本方式的药物组合物可以用于预防或治疗可通过抑制癌细胞的增殖或转移、抑制血小板聚集、抗血栓、抗炎症等来预防或治疗的疾病。“治疗”中包括改善。作为该疾病，可列举例如间皮瘤、脑肿瘤、睾丸肿瘤、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、海绵状血管瘤、血管肉瘤、肺鳞状上皮癌、卵巢癌无性细胞瘤、神经胶质瘤、生殖细胞瘤、头颈部癌、肺癌、膀胱癌、骨骼和软组织肿瘤(原发性骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤)、软组织肉瘤))、食道癌等。

本方式的药物组合物含有：上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段。即，本方式的药物组合物可以含有上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段中的一种，也可以含有多种。

本方式的药物组合物的给药方式没有特别限制，可以通过经口给药或非经口给药来进行给药。作为非经口给药，可列举例如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药、脑内给药、脊髓内给药、其它局部给药。

用于经口给药及非经口给药的剂型及其制备方法对于本领域技术人员而言是周知的，可以通过将上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段与药学上允许的载体等配合来制造药物组合物。

用于非经口给药的剂型，可列举注射用制剂、外用剂、栓剂、吸入剂、滴眼剂、眼软膏剂、滴鼻剂、滴耳剂、脂质体剂等。

作为注射用制剂，可列举例如点滴注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、脑内给药制剂、脊髓内给药制剂等。

作为外用剂，可列举例如软膏剂、巴布剂、洗剂等。

特别地，在想要直接作用于中枢神经组织时，可以使用渗透压泵之类的医疗用微型泵持续地进行注入，也可以与纤维蛋白糊等混合而制成缓释制剂后使其留置于患部组织。

其中，例如注射用制剂通常将抗体溶解于注射用蒸馏水而制备，也可以根据需要添加溶解助剂、缓冲剂、pH调节剂、等渗剂、舒缓剂、保存剂、稳定剂等。另外，还可以制成临用前配置的冷冻干燥制剂。

用于经口给药的剂型可列举固体或液体的剂型，具体可列举片剂、包衣片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、注射剂、锭剂等。

本方式的药物组合物可以还含有治疗上有效的其它药剂，另外，也可以根据需要配合杀菌剂、消炎剂、维生素类、氨基酸等成分。

作为药理学上允许的载体，可列举例如固体制剂中的赋形剂、润滑剂、结合剂及崩解剂或液状制剂中的溶剂、溶解助剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂及舒缓剂等。还可以根据需要适当地使用适量的常见的防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、湿润剂等添加物。

关于本方式的药物组合物的给药量，例如可以由医师根据给药途径、疾病种类、症状的程度、患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度、药代动力学及毒理学特征等药理学表现、是否利用药物递送系统、以及是否作为与其它药物的组合中的一部分来给药等各种因素来决定。

本方式的药物组合物可以通过经口或非经口来进行给药。在非经口给药的情况下，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药及直肠内给药等来进行给药，但是不限于这些。给药量没有特别限制，通常为每天约0.01μg/kg至约1000mg/kg，优选为每天约0.01mg/kg至约100mg/kg，进一步优选为每天约0.1mg/kg至约20mg/kg。药物组合物可以以每天、每周1次、每月1～4次或每年1～7次等间隔来进行给药，但是不限于这些。

本方式的药物组合物可以单独给药，也可以与其它药物组合物或药品组合使用，例如可以与用于预防或治疗皮瘤、脑肿瘤、睾丸肿瘤、卡波西肉瘤、淋巴管瘤、海绵状血管瘤、血管肉瘤、肺鳞状上皮癌、卵巢癌无性细胞瘤、神经胶质瘤、生殖细胞瘤、头颈部癌、肺癌、膀胱癌、骨骼和软组织肿瘤(原发性骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤)、软组织肉瘤))、食道癌的药物组合物或药品等组合使用。

另外，本发明包含下述方式。

〔1〕上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的、用于制造平足蛋白与CLEC-2的结合抑制剂或用于抑制平足蛋白与CLEC-2的结合的组合物的应用。

〔2〕一种上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段，其用于预防或治疗可通过抑制平足蛋白与CLEC-2的结合来进行预防或治疗的疾病。

〔3〕一种可通过抑制平足蛋白与CLEC-2的结合来进行预防或治疗的疾病的预防方法或治疗方法，其包含：将预防上或治疗上的有效量的上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段给予至需要预防或治疗的人或患者。

〔4〕上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的、用于抑制平足蛋白与CLEC-2的结合的应用。

〔5〕上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段，其在平足蛋白与CLEC-2的结合抑制中使用。

〔6〕一种抑制平足蛋白与CLEC-2的结合的方法，其包含将(i)上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段、(ii)平足蛋白与CLEC-2的结合抑制剂、或(iii)用于抑制平足蛋白与CLEC-2的结合的组合物给予至人的阶段。

本发明的另一方式为一种DNA，其编码上述抗平足蛋白抗体、或包含其抗原结合区域的抗体片段的蛋白质部分。上述编码抗平足蛋白抗体的蛋白质部分的DNA的碱基序列可以由本领域技术人员基于该蛋白质的氨基酸序列容易地设计。作为具体例，可列举实施例中记载的核苷酸序列(序列号27～52)。

另外，本方式的DNA中也可以添加有编码信号肽的序列、Kozak序列。

本方式的DNA可以使用公知的基因工程学方法制造。

本发明的另一方式为一种重组载体，其包含上述DNA。

作为本方式的重组载体，可以是公知的载体，可列举质粒载体、病毒载体。可以是能够在大肠杆菌之类的原核细胞中表达的载体，优选为能够在真核细胞中表达的载体，更优选为能够在来自哺乳动物的细胞中表达的载体。

本发明的另一方式为一种宿主细胞(转化体)，其包含上述DNA或上述重组载体。

本方式的宿主细胞是被导入上述DNA或上述重组载体而被转化的细胞。作为本方式的宿主细胞，可以是公知的细胞，例如可以是大肠杆菌、枯草杆菌之类的原核细胞，但优选真核细胞，更优选来自哺乳动物的细胞。

作为上述宿主细胞，可列举例如CHO细胞(作为其品系，为CHO-S细胞等)等，作为在该细胞中表达的载体，可列举例如Freedom(注册商标)pCHO1.0(Thermo FisherScientific)等。

实施例

以下使用实施例来具体说明本发明，但本发明不受这些实施例限定。

〔实施例1〕

(作为抗平足蛋白抗体的人源化抗体的氨基酸序列的确定)

为了改造小鼠PG4D2抗体而制作人源化抗体，使用抗体数据库IMGT及Abysisdatabase，并利用Kabat编码确定小鼠PG4D2抗体的重链及轻链的各CDR区及各FR区。然后，使用IMGT数据库，根据重链及轻链的FR区的序列来分别选择与该氨基酸序列同一性高的人种系(germline,GL)的FR区。使用FR改组(Shuffling)方法，针对FR1～4分别选择氨基酸同一性最高的FR序列，确定FR1～4的组合。对于重链及轻链，分别向所选择的人种系的FR区中移植小鼠PG4D2抗体的互补性决定区，从而设计人源化抗体的候选序列。进而，基于对下述的研究而确定了2种人源化抗体K4、K5的氨基酸序列，所述研究有：规定的氨基酸残基是否全部完全保守；FR区的等电点(pI)是否不显著高；所选择的GL的FR序列的使用频度是否不显著低；有没有化学修饰部位；针对与小鼠PG4D2抗体相比较非保守的氨基酸残基，从氨基酸侧链的疏水性、体积及物理化学性质这3个观点出发，是否具有2种以上性质不同的残基；氨基酸序列的同一性是否大；等。即，人源化抗体K4、K5并不是对小鼠PG4D2抗体的重链及轻链的各FR区的氨基酸序列进行单纯置换而得到的。

〔制造例1〕作为抗平足蛋白抗体的人源化抗体的制造

将制造的人源化抗体K4、K5的各氨基酸序列示于以下。

人源化抗体K4的氨基酸序列的可变区为：重链的CDR1：序列号1的氨基酸序列、重链的CDR2：序列号2的氨基酸序列、重链的CDR3：序列号3的氨基酸序列、轻链的CDR1：序列号4的氨基酸序列、轻链的CDR2：序列号5的氨基酸序列、轻链的CDR3：序列号6的氨基酸序列、重链的FR1：序列号7的氨基酸序列、重链的FR2：序列号8的氨基酸序列、重链的FR3：序列号9的氨基酸序列、重链的FR4：序列号10的氨基酸序列、轻链的FR1：序列号11的氨基酸序列、轻链的FR2：序列号12的氨基酸序列、轻链的FR3：序列号13的氨基酸序列、轻链的FR4：序列号14的氨基酸序列，恒定区为人IgG4抗体的氨基酸序列，其重链的氨基酸序列为序列号25的氨基酸序列，其轻链的氨基酸序列为序列号26的氨基酸序列。

人源化抗体K5的氨基酸序列的可变区为：重链的CDR1：序列号1的氨基酸序列、重链的CDR2：序列号2的氨基酸序列、重链的CDR3：序列号3的氨基酸序列、轻链的CDR1：序列号4的氨基酸序列、轻链的CDR2：序列号5的氨基酸序列、轻链的CDR3：序列号6的氨基酸序列、重链的FR1：序列号7的氨基酸序列、重链的FR2：序列号15的氨基酸序列、重链的FR3：序列号16的氨基酸序列、重链的FR4：序列号10的氨基酸序列、轻链的FR1：序列号11的氨基酸序列、轻链的FR2：序列号12的氨基酸序列、轻链的FR3：序列号13的氨基酸序列、轻链的FR4：序列号14的氨基酸序列，恒定区与上述人源化抗体K4的恒定区的氨基酸序列相同。

另外，作为编码上述各氨基酸序列的核苷酸序列，使用下述序列的核苷酸序列。

作为编码序列号1～16的氨基酸序列的核苷酸序列，分别使用序列号27～42的核苷酸序列。

作为编码序列号25(重链的恒定区)的氨基酸序列的核苷酸序列，使用序列号43的核苷酸序列，及

作为编码序列号26(轻链的恒定区)的氨基酸序列的核苷酸序列，使用序列号44的核苷酸序列。

为了在CHO细胞(Thermo Fisher Scientific)中表达，作为表达载体，使用Freedom(注册商标)pCHO 1.0(Thermo Fisher Scientific)。

将表达人源化抗体K4及K5的CHO细胞分别融解后，进行扩大培养，在搅拌型细胞培养槽中进行10L规模的补料分批培养。培养条件设为搅拌速度100rpm、培养温度37℃、pH7.0，在培养6～8天后，回收培养液。

对回收的培养液进行纯化，得到人源化抗体K4及K5。需要说明的是，回收的培养液的上清用于后述的实施例2、实施例3的测定中。

〔制造例2〕作为抗平足蛋白抗体的小鼠-人嵌合抗体的制造

将小鼠-人嵌合抗体chPG4D2的各氨基酸序列示于以下。

小鼠-人嵌合抗体chPG4D2的氨基酸序列的可变区为：重链的CDR1：序列号1的氨基酸序列、重链的CDR2：序列号2的氨基酸序列、重链的CDR3：序列号3的氨基酸序列、轻链的CDR1：序列号4的氨基酸序列、轻链的CDR2：序列号5的氨基酸序列、轻链的CDR3：序列号6的氨基酸序列、重链的FR1：序列号17的氨基酸序列、重链的FR2：序列号18的氨基酸序列、重链的FR3：序列号19的氨基酸序列、重链的FR4：序列号20的氨基酸序列、轻链的FR1：序列号21的氨基酸序列、轻链的FR2：序列号22的氨基酸序列、轻链的FR3：序列号23的氨基酸序列、轻链的FR4：序列号24的氨基酸序列，恒定区与上述人源化抗体K4的恒定区的氨基酸序列相同。

本领域技术人员可以容易地理解，若设计出编码上述序列号1～6及17～24的各氨基酸序列及上述人源化抗体K1的恒定区的各氨基酸序列的各核苷酸，则可以与制造例1同样地制造小鼠-人嵌合抗体chPG4D2。

此时，作为编码上述各氨基酸序列的核苷酸序列，例如可以使用下述序列的核苷酸序列。

作为编码序列号1～6、17～24的氨基酸序列的核苷酸序列，可以分别使用序列号27～32、45～52的核苷酸序列。

需要说明的是，编码恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列可以使用与制造例1中记载的编码恒定区的氨基酸序列相同的序列。

为了在CHO细胞(Thermo Fisher Scientific)中表达，作为表达载体，使用Freedom(注册商标)pCHO 1.0(Thermo Fisher Scientific)。

使表达小鼠-人嵌合抗体chPG4D2的CHO细胞融解后，进行扩大培养，用搅拌型细胞培养槽进行5L规模的分批培养。培养条件设为：搅拌速度100rpm、培养温度37℃、pH7.0，培养7天后回收培养液。

对回收的培养液进行纯化，得到小鼠-人嵌合抗体chPG4D2。需要说明的是，回收的培养液的上清用于后述的实施例2、实施例3的测定。

〔实施例2〕各抗体的平足蛋白结合活性

使用制造例1及制造例2中回收的培养液的上清，利用基于专利文献1所记载的ELISA法的方法测定对平足蛋白PLAG4结构域的结合活性。作为抗原肽，将人平足蛋白PLAG4结构域肽(WT-hPLAG4(Genscript,788349-1))固相化，在检测中使用预吸收的羊抗人IgGFc(生物素)(Goat Anti-Human IgG Fc(Biotin)preadsorbed)(Abcam,ab98618)和链霉亲和素β-半乳糖苷酶复合物(Streptavidinβ-Gal conjugate)(Roche Diagnostics、11112481001)。

将结果示于表1。需要说明的是，将小鼠-人嵌合抗体chPG4D2的情况设为100％，来示出结合活性(抗体效价)。

[表1]

表1

〔实施例3〕各抗体的抑制CLEC-2与平足蛋白结合的活性

使用制造例1及制造例2中所得到的各培养上清，利用基于专利文献1所记载的ELISA法的方法测定抑制CLEC-2与平足蛋白结合的活性。作为抗原肽，将重组人CLEC-2(R&D，1718-CL-050)固相化，作为与其结合的蛋白质，使用重组人平足蛋白Fc嵌合体(Recombinant Human Podoplanin Fc Chimera)(R&D，3670-PL)，在检测时，使用预吸收的羊抗人IgG Fc(生物素))(Goat Anti-Human IgG Fc(Biotin)preadsorbed)(Abcam，ab98618)和链霉亲和素β-半乳糖苷酶复合物(Streptavidin-β-galactosidaseconjugate)(SIGMA，S3887，Roche，11112481001)。

需要说明的是，作为阳性对照，使用小鼠PG4D2抗体(PG4D2)。小鼠PG4D2抗体为由NITE P-02071(PG4D2)的杂交瘤得到的单克隆抗体。

将结果示于表2。

[表2]

表2

〔实施例4〕各抗体在体内抑制血小板聚集的效果

已知若向尚未引起血小板聚集的细胞株CHO细胞中导入人平足蛋白基因，则会引起血小板聚集(J.Biol.Chem.，Dec 19；278(51)：51599-605(2003))。

将人平足蛋白阳性的骨肉瘤细胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)添加到人全血中，使用全血血小板聚集测定装置WBA CARNA(TAIYO)分析各抗体是否抑制所诱导的血小板聚集。骨肉瘤细胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)可以由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(地址：12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,UnitedStates of America)获得。

需要说明的是，作为使用了人源化抗体K4及K5的体系中的阴性对照，使用人IgG4抗体(CrownBio，C0004)。

另外，该体外分析系统是如下计算聚集率的：通过微型网式过滤器抽吸包含细胞所诱导的聚集块的全血，测定至聚集块引起堵塞为止时升高的抽吸压力，从而计算聚集率。

作为阳性对照，使用小鼠PG4D2抗体(PG4D2)。另外，作为使用小鼠PG4D2抗体的体系的阴性对照，使用小鼠IgG2a抗体(Sigma，M9144)。

将结果示于图1～图3。人源化抗体K4及K5与阳性对照同样地浓度依赖性地抑制血小板聚集。

〔实施例5〕各抗体的向肺血行性转移抑制效果

使用血行性转移模型分析各抗体的血行性转移抑制效果，所述血行性转移模型是通过重度复合免疫缺陷小鼠SCID-Beige(CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/CrlCrlj)(日本Charles River、雌性、6周龄)的尾静脉注射人平足蛋白阳性的骨肉瘤细胞株SJSA-1(ATCCCRL-2098)、并且在20天后测量肺表面所形成的转移结节数的模型。

在SJSA-1细胞注射的前一天，将对照抗体(人IgG4抗体(CrownBio))、人源化抗体K4或K5从尾静脉途径给予至各组的6只小鼠，研究对平足蛋白依赖性实验的肺转移的影响。

将结果示于图4。通过事先给予人源化抗体K4或K5，显著地抑制了SJSA-1细胞株的肺转移。

〔实施例6〕各抗体的抗肿瘤效果

将5×10⁶个人平足蛋白阳性骨肉瘤细胞株SJSA-1(ATCC CRL-2098)移植到重度复合免疫缺陷小鼠SCID-Beige(CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/CrlCrlj)(日本Charles River、雌性、5周龄)的皮下，制作异种移植小鼠，评价人源化抗体K4、K5的体内抗肿瘤效果。

对于K4给药组、K5给药组，分别从移植第一天起以每周2次(第1天、第4天、第8天、第11天、第15天)、5mg/kg给予人源化抗体K4、K5。每周2次测定肿瘤尺寸(1/2长径×(短径)²)和体重(n＝6)。在结束时(经过20天后)进行照片拍摄和摘出的肿瘤的重量测定。

需要说明的是，作为阴性对照，使用人IgG4抗体(Sino Biological,HG4K)。

将结果(移植后的天数与肿瘤平均尺寸的关系)示于图5(利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)，*p<0.05,**p<0.01)。在K4给药组、K5给药组中，确认到肿瘤增殖抑制效果。需要说明的是，在该试验时，均未见小鼠体重的显著减轻。

序列表

<110> 公益财团法人癌研究会(Japanese Foundation For Cancer Research)

亚碧株式会社(API Co., Ltd.)

<120> 抗平足蛋白抗体

<130> C4701-19231

<150> JP 2019-048861

<151> 2019-03-15

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe Gly Met Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Tyr Ile Ser Ser Val Ser Ser Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Glu Ser Tyr Gly Pro Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Arg Ser Ser Gln His Ile Val His Ile Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 32

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 17

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 32

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln

1 5 10 15

Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 23

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

Trp Tyr Leu Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 23

<211> 32

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

1 5 10

<210> 25

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 27

ggattcactt tcagtggctt tggaatgctc 30

<210> 28

<211> 51

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 28

tacattagta gtgtcagtag tagaatctac tatgcagaca cagtgaaggg t 51

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 29

gaatcctacg gccccgcctg gtttgcttac 30

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 30

agatctagtc agcacattgt acatattgat ggaaacacct atttagaa 48

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 31

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 32

tttcaaggtt cacatgttcc gtacacg 27

<210> 33

<211> 75

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 33

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctct 75

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 34

tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtgg cc 42

<210> 35

<211> 96

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactcactgt atctgcaaat gaacagcctg 60

agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgaga 96

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc tca 33

<210> 37

<211> 69

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 37

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgc 69

<210> 38

<211> 45

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 38

tggtacctgc agaagccagg gcagtctcca cagctcctga tctat 45

<210> 39

<211> 96

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

ggagtcccag acaggttcag tggcagtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 60

agggtggagg ctgaggatgt tggagtttat tactgc 96

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 30

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggtct ca 42

<210> 42

<211> 96

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

agattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atcttcaaat gaacagcctg 60

agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgaga 96

<210> 43

<211> 981

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

gcttccacca agggaccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctcc 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300

aaatatggtc ccccatgccc accatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360

ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420

tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600

tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660

gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900

aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960

ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 44

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 44

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210> 45

<211> 75

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 45

gatgtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctct 75

<210> 46

<211> 42

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 46

tgggttcgtc aggctccaga gaaggggctg gagtgggtcg ca 42

<210> 47

<211> 96

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 47

cgattcacca tctccagaga caatcccaag aacaccctgt tcctgcaaat gaccagtctg 60

aggtctgagg acacggccat gtattactgt gcaaga 96

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 48

tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33

<210> 49

<211> 69

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 49

gatgtcttga tgacccaaac tccactctcc ctgccggtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgc 69

<210> 50

<211> 45

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 50

tggtacctgc agcaaccagg ccagtctcca aagctcctga tctac 45

<210> 51

<211> 96

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 51

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caggatcagc 60

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgc 96

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 52

ttcggagggg ggaccaagct ggaaatgaaa 30