藁本内酯及含其的植物精油在防治花生白绢病方面的应用
阅读说明：本技术 藁本内酯及含其的植物精油在防治花生白绢病方面的应用 (Application of ligustilide and plant essential oil containing ligustilide in prevention and treatment of peanut southern blight ) 是由 周琳 何磊鸣 杜鹏强 崔凯娣 赵特 高飞 汪梅子 何亚 韩志远 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及藁本内酯在防治花生白绢病方面的应用,尤其是含藁本内酯的植物精油(如川芎精油或当归精油等)在防治花生白绢病方面的应用。本发明研究了藁本内酯及含其的植物精油对花生白绢病菌菌丝生长、菌核萌发的毒力以及花生白绢病的盆栽防治效果,结果发现：藁本内酯及含其的植物精油对花生白绢病菌的菌丝生长、菌核萌发具有良好的抑制活性,随着藁本内酯浓度的升高,其抑制活性增强,EC-(50)值为7.0 mg/L,抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素。同时,盆栽防效试验与室内毒力试验结果一致。此外,与空白对照和对照药剂多抗霉素相比,藁本内酯也能够显著降低死棵率,表明藁本内酯以及含其的植物精油在防治白绢病上有很大的应用前景。(The invention relates to application of ligustilide in preventing and treating peanut southern blight, in particular to application of ligustilide-containing plant essential oil (such as ligusticum wallichii essential oil or angelica sinensis essential oil and the like) in preventing and treating peanut southern blight. The invention researches the toxicity of ligustilide and plant essential oil containing ligustilide on the growth and sclerotium germination of sclerotium of peanut and the pot culture control effect of sclerotium of peanut, and finds that: ligustilide and plant essential oil containing the same have good inhibitory activity on hypha growth and sclerotium germination of southern blight fungus, and with the increase of ligustilide concentration, the inhibitory activity is enhanced, and EC is increased 50 The value is 7.0 mg/L, and the inhibitory activity is obviously superior to that of a control medicament polyoxin. Meanwhile, the results of the potted plant control effect test are consistent with the results of the indoor toxicity test. In addition, polyoxins were compared to placebo and control agentsCompared with the traditional Chinese medicine, the ligustilide can also obviously reduce the death rate, and shows that the ligustilide and the plant essential oil containing the ligustilide have great application prospect in preventing and treating southern blight.)
技术领域
本发明属于植物病虫防害技术领域，具体涉及一种藁本内酯及含其的植物精油在防治花生白绢病方面的应用。
背景技术
藁本内酯，天然存在于中药伞形科植物如川芎、当归中，也是川芎精油、当归精油的主要活性成分。陶静仪等研究发现，藁本内酯具有平喘解痉作用。之后，在中医药、食品、运动健康领域关于藁本内酯的药理学研究也越来越多。刘蒙研究发现，补充藁本内酯可促进疲劳恢复，对身体素质产生积极影响。荔淑楠等综述表明，藁本内酯可通过抗神经氧化损伤、抗神经炎症、促进脑蛋白合成等方式来发挥抗老年痴呆作用。杨志军等综述表明，藁本内酯在心血管的药理学作用主要表现为抗心肌缺血、舒张血管、抗动脉粥样硬化、改善微循环四个方面。目前，还未发现有关藁本内酯对植物病原真菌生物活性的报道。
花生白绢病是由齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）侵染引起的真菌性土传病害。该病原菌寄主广泛，可侵染谷类、薯类、豆类等500多种植物。目前，白绢病已成为制约我国花生产量和品质的重要因素。花生白绢病多在花生成株期发生，病菌主要从植株茎基部侵入，菌丝可沿茎杆向上、向下扩展，最终导致植株茎部、果针、根部和荚果均可受害。受害初期叶片萎蔫，近地面和茎基部覆盖有白色绢丝状菌丝，拔出后根部和荚果上也附着有白色菌丝；后期整株枯死，根茎部和荚果变褐腐烂，甚至种仁也会变色，呈湿腐状腐烂。后期菌丝开始聚集形成菌核，初期为白色小颗粒，后逐渐增大变成黄褐色，最后变成油菜籽状黑褐色或茶褐色的坚硬菌核，随后这些菌核会随着浇灌、雨水或一些农事操作等方式进行传播，进而加大病情。目前，在我国河南、山东、安徽、辽宁、江西省等花生种植区均有花生白绢病爆发成灾的报道，一般发病率为10%-40%，可造成花生20%-30%产量损失，严重时可减产50%以上。2020年，河南省农业农村厅将花生白绢病列为河南省二类病虫害名录。由于国内外对花生白绢病的研究较少，缺乏抗病品种，深耕土地、合理轮作等农业措施因其寄主广泛和菌核存活时间长而防控作用有限。目前，防治花生白绢病主要依靠化学杀菌剂。但是，中国农药信息网上登记防治花生白绢病的化学杀菌剂品种较少，并且化学杀菌剂的长期使用不仅使有害生物产生抗药性，还会造成农药残留超标、环境污染以及危害人类健康等问题。因此，急需寻找安全、高效、无公害的新药剂。
在新农药创制周期长、成本高等的背景下，人们开始从天然产物中寻找高活性的化合物，并且以天然产物为先导化合物进行结构优化和改造可开发出更为高效的农药品种，如金色链霉菌产生的代谢产物-多抗霉素对白绢病具有较好的防治效果，并已进行了农药登记。此外，来源于植物体内的丁香酚、大蒜素、苦参碱等杀菌物质均已登记防治多种植物病害。本研究发现，藁本内酯以及含藁本内酯的植物精油对花生白绢病菌具有强烈的抑制活性。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种藁本内酯及含其的植物精油在防治花生白绢病方面的应用。经试验验证：藁本内酯对花生白绢病具有极好的防治效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
藁本内酯在防治花生白绢病方面的应用。
进一步的，本发明提供了含藁本内酯的植物精油在防治花生白绢病方面的应用。
上述的应用，进一步优选的，所述植物精油为川芎精油或当归精油等，可以直接购买普通市售产品，或者采用本领域常规方法提取获得。
本发明还提供了一种藁本内酯与本领域常规辅料复配制备成的混合药剂。
进一步的，所述混合药剂可以为悬浮剂、水分散粒剂、可湿性粉剂、颗粒剂、水乳剂、乳油或微胶囊剂等。
川芎精油是从伞形科植物川芎（Ligusticum sinense cv. Chuanxiong）根茎中提取出来的挥发油。川芎精油具有活血化瘀、润肤美白、防止脱发、白发等功效，日本已将其用于洗浴剂中。缪应林研究表明：川芎精油对水果有一定的保鲜作用，在防腐方面对细菌也有一定抑制作用。但目前鲜有关于川芎精油防治植物病原真菌病害的研究报道。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1）本发明通过研究藁本内酯对花生白绢病菌菌丝生长的毒力以及花生白绢病的盆栽防治效果发现：藁本内酯对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着藁本内酯浓度的升高，其抑制活性增强，EC50值为7.0 mg/L，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（EC50值为204.7 mg/L）。盆栽防效试验与室内毒力试验结果一致，藁本内酯的防效明显高于登记药剂多抗霉素的防效，且与空白对照和对照药剂多抗霉素相比，也能够显著降低死棵率。表明藁本内酯在防治白绢病上有很大的应用前景；
2）本发明通过研究川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的毒力、对花生白绢病菌菌丝生长、菌核萌发的抑制作用以及花生白绢病的盆栽防治发现：在1000 mg/L和500 mg/L的处理浓度下，川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率分别为96.0%和89.6%，均明显优于对照药剂多抗霉素（64.9%和61.7%）。川芎精油对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着精油浓度的升高，其抑制活性增强，EC50值为104.2 mg/L，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（EC50值为204.7 mg/L）。川芎精油对花生白绢病菌的菌核萌发也有较好的抑制作用，在400 mg/L处理浓度下，川芎精油对菌核萌发的抑制率为80%；当精油浓度升高至500 mg/L浓度时，其对菌核萌发的抑制率高达90%。川芎精油对花生白绢病具有良好的防治效果，1000 mg/L川芎精油对花生白绢病的防治效果为53.51%，与对照药剂1000 mg/L多抗霉素的防效（44.82%）没有显著性差异。。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
下述实施例中，所用藁本内酯为普通市售产品，川芎精油为购买自江西雪松天然药用油有限公司生产的川芎油，外观呈浅棕色油状液体，性温，味辛具有浓烈药草香气，藁本内酯含量≥50%。
试验方法与结果
1. 藁本内酯对花生白绢病菌菌丝生长的毒力
采用抑制菌丝生长速率法测定。取藁本内酯0.02 g 溶于0.4 mL DMSO和吐温-80中，加入19.58 mL 无菌水定容至20 mL，并配置成1000 mg/L的母液，其中DMSO和吐温-80的体积比均为1%；再用无菌水梯度稀释成500、100、50、10、5 mg/L 5个系列浓度的药液。分别取1 mL不同浓度的药液加入到9 mL PDA培养基中，制成终浓度为100、50、10、5、1、0.5 mg/L含药培养基。对照药剂多抗霉素的最终浓度为6000、1000、500、100、50、10 mg/L，以含0.1%DMSO和0.1% 吐温-80的无药培养基为对照。每个浓度重复三次。于25℃光照培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测定菌落直径。
根据菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）]/（对照菌落直径-菌饼直径）×100，计算藁本内酯和多抗霉素对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率，并根据机率值分析法求得毒力回归方程、有效中浓度（EC50）以及抑制率为90%的浓度（EC90）。结果见表1。
表1 藁本内酯对花生白绢病菌菌丝的毒力
由表1可知，藁本内酯对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着藁本内酯浓度的升高，其抑制活性增强，EC50值为7.0 mg/L，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（EC50值为204.7 mg/L）。
藁本内酯对花生白绢病的盆栽防治效果
采用喷淋法测试藁本内酯对花生白绢病的盆栽防治效果。
试验花生品种为豫花9326，选取颗粒饱满大小一致的花生种子置于盆中，加入无菌水淹没种子的三分之一，并放于培养箱中浸种半天。然后将基质土与蛭石以3:1的体积比例混合，加入无菌水调整土壤持水量为70%后置于盆钵中，将发芽的种子胚根朝下播种。
人工接种病菌：待播种一周后，选取健康、长势、大小一致的花生植株，每株在茎基部接种1个菌饼，并用土掩埋。当观察到花生植株和土壤上出现白色菌丝后，分别以50、100mg/L藁本内酯和500 mg/L多抗霉素药液喷淋植株根茎部及周围土壤，每株喷药液10 mL。以含0.1% DMSO和0.1% 吐温-80的无菌水作为对照。每个处理15株，重复3次。施药3 d后，按照以下分级标准鉴定病情：
0级：无病斑；
1级：病斑小于1/3根茎部；
3级：病斑大于2/3根茎部，地面有少量菌丝；
5级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝；
7级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝，且地上部分出现萎蔫；
9级：植株枯死。
根据病情指数=∑（各级病株×相对级数值）/（总株数×9）×100、
防治效果（%）= （对照处理病情指数-药剂处理病情指数）/对照处理病情指数×100，计算不同处理的病情指数和防效，并统计不同处理的死棵率。结果见表2。
表2 藁本内酯对花生白绢病的盆栽防效
注：表中数据为平均值 ± 标准误差。同列的不同字母表示经最小显著差异法检验在 P < 0.05 水平差异显著。
从表2可知，盆栽防效试验与室内毒力试验结果一致，藁本内酯在50 mg/L和100mg/L剂量下的防效分别为34.98%和60.07%，明显高于登记药剂500 mg/L多抗霉素的防效（23.1%），且与空白对照和对照药剂相比，藁本内酯也能够显著降低死棵率。这表明藁本内酯在防治白绢病上具有很大的应用前景。
川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制作用
采用抑制菌丝生长速率法测定川芎精油对白绢病菌的抑制活性。取川芎精油0.1g 溶于0.2 mL DMSO和吐温-80中，加入9.7 mL无菌水并定容至10 mL配置成10000 mg/L的母液，其中DMSO和吐温-80的体积比均为1%。然后再用无菌水稀释成5000 mg/L的药液。分别取1 mL两种浓度的药液加入到9 mL PDA培养基中，制成终浓度为1000 mg/L和500 mg/L的含药培养基，且对照药剂多抗霉素的最终浓度也为1000 mg/L和500 mg/L，以含0.1% DMSO和0.1% 吐温-80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。于25℃光照培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测定菌落直径，并计算各处理的抑制率。
菌丝生长抑制率计算公式如下：菌丝生长抑制率=[（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）]/（对照菌落直径-菌饼直径）×100。结果见表3。
表3 不同浓度川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率（%）
由表3可以看出，在1000 mg/L和500 mg/L的处理浓度下，川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率分别为96.0%和89.6%，均明显高于对照药剂多抗霉素的抑制率（64.9%和61.7%）。
川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的毒力
采用抑制菌丝生长速率法测定。取川芎精油0.1 g 溶于0.4 mL DMSO和吐温-80中，加入19.5 mL 无菌水定容至20mL并配置成5000 mg/L的母液，其中DMSO和吐温-80的体积比均为1%。再用无菌水梯度稀释成2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 mg/L 6个系列浓度的药液。分别取1 mL不同浓度的药液加入到9 mL PDA培养基中，制成终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 mg/L共7种含药培养基，对照药剂多抗霉素的最终浓度为6000、1000、500、100、50、10 mg/L，以含0.1% DMSO和0.1% 吐温-80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。于25℃光照培养箱中黑暗培养，3 d后用十字交叉法测定菌落直径。计算川芎精油对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率，并根据机率值分析法求得毒力回归方程、有效中浓度（EC50）以及抑制率高达90%的浓度（EC90）。结果见表4。
表4川芎精油对花生白绢病菌菌丝的毒力
由表4可知，川芎精油对花生白绢病菌的菌丝生长具有良好的抑制活性，随着精油浓度的升高，其抑制活性增强，EC50值为104.2 mg/L，抑制活性显著优于对照药剂多抗霉素（EC50值为204.7 mg/L）。
川芎精油对花生白绢病菌菌核萌发的抑制作用
取川芎精油0.1 g溶于1 mL DMSO和吐温-80中，加入18.9 mL 无菌水并定容至20mL配置成5000 mg/L的母液，其中DMSO和吐温-80的体积分数分别为3%和2%。然后再梯度稀释成4000、3000、2000、1000、500 mg/L 5个系列浓度的药液。分别取1 mL药液加入到9 mLPDA培养基中，制成终浓度为500、400、300、200、100、50 mg/L 的含药培养基。分别选取形状相同、大小一致的菌核，放于含药培养基上，每个处理放20个菌核，以含0.3% DMSO和0.2%吐温-80的无药培养基为对照，每个浓度重复三次。在含药培养基上培养2 d后，观察菌核的萌发情况，当菌核产生的菌丝 ≥ 2 mm 时为萌发。菌核萌发抑制率=（对照菌核萌发数量-处理菌核萌发数量）/（对照菌核萌发数量）×100%。结果见表5。
表5 川芎精油对花生白绢病菌菌核萌发的抑制作用（2 d）
表5表明，川芎精油对花生白绢病菌的菌核萌发也有较好的抑制作用。在400 mg/L处理浓度下，川芎精油对菌核萌发的抑制率为80%；当精油浓度升高至500 mg/L浓度时，其对菌核萌发的抑制率高达90%。
川芎精油对花生白绢病的盆栽防治效果
采用喷淋法测试川芎精油对花生白绢病的盆栽防治效果。
试验花生品种为豫花9326，选取颗粒饱满大小一致的花生种子置于盆中，加入无菌水淹没种子的三分之一，并放于培养箱中浸种半天。然后将基质土与蛭石以3:1的体积比例混合，加入无菌水调整土壤到70%的湿度后置于盆钵中，将发芽的种子胚根朝下播种。
人工接种病菌：待播种一周后，选取健康、长势、大小一致的花生植株，每株在茎基部接种1个菌饼，并用土掩埋。当观察到花生植株和土壤上出现白色菌丝后，分别以500、1000 mg/L川芎精油和1000 mg/L多抗霉素药液喷淋花生植株根茎部和周围土壤，每株喷药液10 mL。以含0.1% DMSO和0.1% 吐温-80的无菌水作为空白对照。每个处理15株植株，重复三次。在施药3 d后，按照以下分级标准鉴定病情：
0级：无病斑；
1级：病斑小于1/3根茎部；
3级：病斑大于2/3根茎部，地面有少量菌丝；
5级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝；
7级：病斑大于2/3根茎部，地面有大量菌丝，且地上部分出现萎蔫；
9级：植株枯死。
根据病情指数=∑（各级病株×相对级数值）/（总株数×9）×100、
防治效果（%）= （对照处理病情指数-药剂处理病情指数）/对照处理病情指数×100，计算不同处理的病情指数和防效，并统计不同处理的死棵率。盆栽试验结果见表6。
表6 川芎精油对花生白绢病的防治效果
注：表中数据为平均值 ± 标准误差。同列的不同字母表示经最小显著差异法检验在 P < 0.05 水平差异显著。
由表6可以看出，川芎精油对花生白绢病具有良好的防治效果。1000 mg/L川芎精油对花生白绢病的防治效果为53.51%，与对照药剂1000 mg/L多抗霉素的防效（44.82%）没有显著性差异。
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