一种两性离子聚合物基一氧化氮驱动纳米马达及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种两性离子聚合物基一氧化氮驱动纳米马达及其制备方法和应用 (Zwitterionic polymer-based nitric oxide-driven nano motor and preparation method and application thereof ) 是由 毛春 万密密 陈焕 陶莹芳 陈城龙 于 2021-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达的制备方法和应用,该纳米马达主要以L-精氨酸两性离子衍生物为单体,以具有活性氧(ROS)响应型的二硒化合物为交联剂,通过引发剂引发自由基聚合反应形成。本发明的纳米马达可响应ROS浓度梯度而产生趋化行为,并在肿瘤细胞环境下与其中的ROS反应产生NO驱动其运动并逐渐降解。本发明的两性离子聚合物基NO驱动纳米马达制备方法简单高效,具有优异的生物相容性、在ROS微环境具有主动运动能力,在生物医药领域具有广阔的应用前景。(The invention discloses a preparation method and application of a zwitterionic polymer-based Nitric Oxide (NO) driven nano motor. The nanomotor disclosed by the invention can respond to the ROS concentration gradient to generate chemotactic behavior, and reacts with ROS in the nanomotor under the environment of tumor cells to generate NO to drive the NO to move and gradually degrade. The preparation method of the zwitterionic polymer-based NO driving nano motor is simple and efficient, has excellent biocompatibility, has active movement capability in a ROS microenvironment, and has a wide application prospect in the field of biomedicine.)
技术领域
本发明属于新型生物医用纳米材料，具体涉及基于一种两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达及其制备方法和应用。
背景技术
NO是心血管、免疫和中枢神经系统中的关键信号分子，在生物医学应用中显示出多功能性，如在调节血管舒张、血管生成、化学敏化作用、杀菌作用和癌症相关方面的生理/病理生理活性方面发挥着突出的作用。然而，由于NO的生理特性，如半衰期短(<5s)、扩散距离短(20-160μm)、与氧物种的高度反应以及浓度依赖性治疗结果，NO运送技术仍然受到严重限制。为了解决这些问题，已经开发了多种基于NO供体的输送系统用于癌症治疗、抗微生物和心血管治疗的各种NO放纳米平台。目前小分子NO供体不能解决持续释放NO的问题。现有技术中有报道利用聚合物与L-精氨酸静电结合方式构建具有自主运动能力的后负载型的NO驱动纳米马达，试图解决NO的持续释放问题，但是其通过弱的静电作用结合的方法可能面临着L-精氨酸(燃料)的负载效率低和在纳米马达驱动过程中负载不稳定可能脱落的问题，这样就会导致落释放周期、释放量都不够令人满意。因此亟需开发新类型的具有更高、高持久NO释放能力的NO驱动纳米马达。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达，主要解决了现有NO驱动纳米马达燃料负载效率低和纳米马达驱动过程中负载不稳定可能脱落的问题，从而提高了NO的释放周期和释放量。
本发明还提供所述两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达以L-精氨酸衍生物为单体，二硒醚化合物为交联剂，通过引发剂引发自由基聚合反应形成；所述L-精氨酸衍生物为具有高密度活性胍基冠能团的链端带有碳碳双键的化合物；所述二硒醚化合物为具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物；所述纳米马达可响应ROS浓度梯度而产生趋化行为。
其中，所述L-精氨酸衍生物和二硒醚化合物其结构式分别如下所示：
作为优选，所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或者偶氮二异丁酸二甲酯中的一种。
本发明所述的两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达的制备方法，包括如下步骤：
(1)将L-精氨酸溶解在去离子水和1,4-二氧己环的混合溶剂中，加入三乙胺，并用冰水浴冷却溶液，搅拌下逐滴滴加甲基丙烯酸酐，然后移除冰水浴，搅拌反应，将产物在丙酮中沉淀，获得L-精氨酸衍生物；
(2)将2,2'-二硒烷二乙基双(1-乙胺)二盐酸盐、三乙胺加入至无水二氯甲烷溶液中缓慢添加甲基丙烯酰氯；接着反应混合物在氮气气氛下搅拌反应；将反应体系萃取干燥，去除有机相；纯化得到具有ROS响应型的二硒醚化合物交联剂；
(3)将步骤(1)获得的L-精氨酸衍生物与步骤(2)获得的具有ROS响应型的二硒醚化合物交联剂溶解在溶剂中，加入引发剂进行聚合反应，离心洗涤获得两性离子聚合物基NO驱动纳米马达。
其中，步骤(1)所述L-精氨酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为0.5-1，去离子水与1,4-二氧己环的体积比为1-5，1,4-二氧己环与三乙胺的体积比为1-5，搅拌反应温度为20-30℃，反应时间为10-48h。
作为优选，L-精氨酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为0.6；去离子水和1,4-二氧己环的体积比为2.4；1,4-二氧己环与三乙胺的体积比为1.9；反应温度为25℃，反应时间为12h。
其中，步骤(2)所述2,2'-二硒烷二乙基双(1-乙胺)二盐酸盐与甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.1-0.5，搅拌反应温度为0-30℃，反应时间为10-48h；
其中，无水二氯甲烷的体积为30-100mL，三乙胺的用量为1-5mL。
作为优选，2,2-二硒烷二乙基双(1-乙胺)二盐酸盐与甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.25；无水二氯甲烷的体积为60mL；三乙胺的用量为3.6mL；反应温度为25℃，反应时间为24h。
进一步地，步骤(2)反应体系用去离子水萃取除去杂质，无水Na2SO4干燥过夜，经减压蒸发去除有机相，以乙酸乙酯/石油醚为原料，经硅胶柱层析法纯化得到具有ROS响应型的二硒醚化合物交联剂。
作为优选，所述纯化的分离溶剂的比例为乙酸乙酯/石油醚体积比1:2、1:1、2:1。
其中，步骤(3)中L-精氨酸两性离子衍生物与二硒醚化合物交联剂的摩尔比为5-20，L-精氨酸两性离子衍生物与引发剂的摩尔比为1-20，反应的溶剂为乙腈或者二甲亚砜中的一种，溶剂用量一般为10-50mL，反应温度为80-100℃，反应时间为1-5h。
作为优选，L-精氨酸两性离子衍生物与二硒醚化合物交联剂摩尔比为10；L-精氨酸两性离子衍生物与引发剂的摩尔比为16.7；反应的溶剂为二甲亚砜；溶剂用量为20mL；引发剂为偶氮二异丁腈；反应温度为90℃，反应时间为4h。
其中，步骤(3)所述离心洗涤为通过超离心收集得到的纳米凝胶，并洗涤、冷冻干燥，获得两性离子聚合物基NO驱动纳米马达，所述超离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为10-30min。
作为优选，超离心的转速为12000rpm，离心时间为10min。
本发明所述的两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达，在心脑血管疾病和癌症治疗等生物医用领域中的应用。
本发明所述的两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达在制备靶向心血管疾病和肿瘤病灶的药物中的应用。本发明的纳米马达可响应微环境中的ROS浓度梯度并体现为趋化行为，有望通过微环境靶向实现对疾病的靶向目的，包括心血管疾病和肿瘤。
本发明制备的两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达是以L-精氨酸衍生物为单体聚合的聚合物具有高密度的活性胍基位点，可以高效地与肿瘤微环境中ROS反应产生NO作为驱动马达运动的燃料及发挥治疗作用的治疗剂；并且可以响应ROS浓度梯度而产生趋化行为，即该纳米马达可以朝着ROS浓度较高的肿瘤部位或炎症部位发生自扩散泳运动。纳米马达因其结构中具有二硒醚键可在ROS存在下发生断裂而降解，纳米马达可裂解为低分子片段，可通过各器官的代谢作用被人体清除。
本发明中通过将纳米马达加入至癌细胞的培养环境中，使用激光共聚焦和荧光显微镜追踪纳米马达的运动情况；有效证明：本发明的纳米马达可响应ROS浓度梯度而产生趋化行为，并在肿瘤细胞环境下与其中的ROS反应产生NO驱动其运动并逐渐降解，具有优异的生物相容性、在ROS微环境具有主动运动能力，在生物医药领域具有广阔的应用前景。
本发明以自由基聚合、共价接枝的方法合成了一种新型的具有高密度胍基活性位点的NO驱动纳米马达。其中，单体是两性离子聚合物基的L-精氨酸衍生物所以具有良好的生物相容性；交联剂是具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物，所以具有响应降解性能，本发明首次以L-精氨酸衍生物和二硒醚化合物合成了一种全新的NO驱动纳米马达。本发明采用共价结合方式制备的纳米马达相对于静电结合具有更丰富的能够释放NO的活性胍基位点，所以具有更持久更大量的释放NO的性能。最终就给纳米马达提供出更快的运动速度。
本发明采用的是共价接枝的方法制备的是一个表面具有丰富活性胍基位点的纳米粒子，而不是小分子的NO供体，所以会比供体具有更持久的NO释放能力。另外，合成此类纳米马达使用的单体是两性离子聚合物基的L-精氨酸衍生物所以具有两性离子独特的良好生物相容性，也就可能避免了体内的迅速清除、降解、甚至急性中毒的风险。由于合成的纳米马达是以自由聚合的方式、共价键结合制备出的具有高密度的胍基活性位点(产生NO的位点)的纳米马达，其产生NO的性能更加稳定和持久，这为其在肿瘤微环境中与ROS反应持续释放NO提供理论基础，也解决了NO半衰期短和释放时间短的问题。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明的基于两性离子聚合物基的NO驱动纳米马达，纳米马达的材料主体是L-精氨酸衍生物所以具有良好的生物相容性和密集的胍基活性位点；具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物为交联剂，所以具有响应降解性能。由于高密度的胍基活性位点这为其在肿瘤微环境中与ROS反应持续释放NO提供理论基础，也解决了NO半衰期短和释放时间短的问题。另外，NO除了作为驱动纳米马达运动的推动力外，还可以作为治疗肿瘤的治疗剂。
2、本发明制备方法简单高效，合成条件温和，材料分散性能良好，合成的纳米马达具有：(1)优异的生物相容性，两性离子聚合物基体材料具有免疫原性低，这有助于在长期给药过程中维持材料的生物利用度和治疗效果，通过减少蛋白质内吞、干扰蛋白质水解、物理阻断MHCII-表位结合等方式抑制吞噬细胞的激活，从而减弱免疫应答；(2)按需降解纳米马达的性能，Se-Se键键能低，即使在温和的刺激下也反应，尤其对还原性或氧化性刺激敏感，它可以在活性氧的存在下被裂解，进而触发纳米凝胶的解体。小分子的片段可以被人体器官代谢排出体外，具有良好的生物安全性。
3、本发明制备的两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达具有NO释放时间长、释放量大等优势，并且具有自发的趋化性能，可以朝着ROS浓度较高的肿瘤部位或炎症部位发生自扩散泳运动以及肿瘤杀伤性能。
附图说明
图1为实施例1L-精氨酸的衍生物的核磁谱图；
图2为实施例2二硒醚交联剂的核磁谱图；
图3为实施例3得到的两性离子基NO驱动纳米马达的透射电镜图(标尺：500nm)；
图4为实施例4中PAMSe在0.002％的过氧化氢溶液中37℃下孵育12h、24h和48h后的透射电镜图；
图5为实施例5中纳米马达在癌细胞环境下NO的释放量；
图6为实施例6中在癌细胞环境下纳米马达的运动轨迹；
图7为实施例6中在癌细胞环境下纳米马达运动轨迹的均方位移(MSD)二次项拟合曲线；
图8为实施例6中在癌细胞环境下纳米马达运动轨迹的均方位移(MSD)线性拟合曲线；
图9为实施例7中纳米马达ROS浓度趋化性实验模型；
图10为实施例7中纳米马达在有/无ROS梯度下在趋化性模型中b端的荧光强度
图11为实施例8中不同浓度纳米马达与内皮细胞孵化不同时间后的细胞活性以评估纳米马达的生物相容性；
图12为实施例8中降解后的纳米马达与癌细胞孵化不同时间后的细胞活性以评估纳米马达的生物相容性；
图13为实施例9中纳米马达对癌细胞的杀伤性能评估；
图14为对比例1制备的纳米马达的透射电镜图(右下角标尺：500nm)；
图15为对比例1的负载型PMSe/A纳米马达在细胞环境下的NO释放量；
图16为对比例1的负载型PMSe/A纳米马达在细胞环境中的运动；
图17为对比例1的负载型PMSe/A纳米马达在癌细胞环境下运动轨迹的MSD二次项拟合曲线。
具体实施方式
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
L-精氨酸衍生物的制备：
(1)称取L-精氨酸11.5mmol溶于溶解在去离子水(20mL)和1,4-二氧己环(8.5mL)的混合溶剂中，超声分散，于室温下磁力搅拌；
(2)向(1)中反应体系中加入三乙胺4.5mL，并用冰水浴冷却溶液至0℃；
(3)在搅拌下滴加甲基丙烯酸酐18.9mmol，然后移除冰水浴，搅拌反应，反应体系为25℃，反应时间为12h。
(4)将步骤(3)得到的溶液滴加至400mL丙酮中沉淀，然后将沉淀物重新溶解在水中，并再次在丙酮中沉淀，沉淀步骤重复两次溶解在水中。
(5)将(4)中溶液以8000rpm离心15min，弃去上层液体取下层沉淀，并在60℃下真空干燥，得到L-精氨酸衍生物：N-(2-甲基-1-OXO-2-丙烯-1-基)-L-精氨酸。
图1是N-(2-甲基-1-OXO-2-丙烯-1-基)-L-精氨酸的核磁谱图，1H NMR(400MHz,D2O)δ5.61(s,1H),5.35(s,1H),4.13(dd,J＝8.0,5.1Hz,1H),3.09(t,J＝6.8Hz,2H),1.83(s,3H),1.81–1.59(m,2H),1.56–1.46(m,2H)。结果证实成功制备了L-精氨酸衍生物。
实施例2
具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物交联剂的合成：
(1)称取2,2'-二硒烷二乙基双(1-乙胺)二盐酸盐(CAS号:3542-13-0)1.0g，三乙胺3.6mL，加入至60mL二氯甲烷中，将混合物冷却至0℃。
(2)向步骤(1)中所得的溶液中缓慢添加甲基丙烯酰氯1.3g，接着反应在氮气气氛中反应温度为25℃，反应时间为24h。
(3)将步骤(2)反应后的溶液，用大量去离子水萃取除去杂质，收集有机溶剂相。
(4)将步骤(3)中收集的机相用无水硫酸钠干燥过夜得到粗产物，经减压蒸发去除有机相。
(5)将步骤(4)中得到的粗产物分别以不同比例乙酸乙酯/石油醚(体积比为1:2、1:1、2:1)为原料，通过硅胶柱分离纯化得到产物，淡黄色固体粉末，具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物。
图2是合成的具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物的核磁谱图。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.54(s,2H),5.77(s,2H),5.43-5.34(m,2H),3.70(q,J＝6.5Hz,4H),3.16-3.04(m,4H),2.03-1.94(m,6H),1.68(s,4H)。图2中可以看出成功合成了具有活性氧(ROS)响应型的二硒醚化合物。
实施例3
基于两性离子聚合物基的NO驱动纳米马达的制备：
(1)称取L-精氨酸衍生物0.5mmol、具有活性氧响应型的二硒醚交联剂0.05mmol于三颈烧瓶中；
(2)使用真空泵除尽步骤(1)中烧瓶中的空气，并持续通入氮气；
(3)向步骤(2)中加入20mL干燥二甲亚砜溶液，并超声分散溶解；
(4)称取偶氮二异丁腈0.03mmol，加入500μL干燥二甲亚砜溶液，并超声分散溶解，注射器注入步骤的(3)中的反应体系；
(5)将三颈烧瓶转移至油浴锅中，300rpm磁力搅拌，氮气气氛中反应温度为90℃，反应时间为4h进行聚合，得到乳白色均匀分散的两性离子一氧化氮纳米马达溶液；
(6)得到的两性离子基NO驱动纳米马达溶液置于高速离心机内以12000rpm离心10min，弃去上层液体，沉淀用去离子水重复洗涤3次。将最后所得沉淀置于冷冻干燥机内冻干，得到最终的两性离子基一氧化氮纳米马达(PAMSe)。如图3所示，合成的纳米马达粒径约为230nm，呈现为均匀分散且不规则的类球形纳米粒子。
实施例4
两性离子基NO驱动纳米马达的降解：
(1)称取实施例3中制备的PAMSe纳米马达分散在1mL 0.002％的氧化氢溶液中，最终浓度为200μg mL-1，在37℃水浴环境中反应，分别在12h，24h和48h使用透射电镜观察纳米马达的形貌变化。如图4所示，由图中可以看出随着PAMSe纳米马达与H2O2(0.002％)孵化时间的延长，纳米粒子的尺寸会逐渐增大至最后类球形粒子结构完全坍塌发生降解，说明本发明的PAMSe纳米马达能够在ROS环境中发生响应性降解。
实施例5
两性离子基NO驱动纳米马达的NO的释放：
(1)将实施例3制备的3mg两性离子基NO纳米马达分别加入接种于24孔板中的MCF-7细胞中。细胞接种密度为5*106cell/孔，完全培养基体积为1mL，细胞37℃培育24h后加入纳米马达。
(2)细胞分别与两性离子基一氧化氮纳米马达共同孵育(0、1h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、72h、96h和108h)。反应结束后以12000rpm离心10min，取上清液待用。
(3)将得到的上清液分别使用一氧化氮试剂盒(碧云天)检测NO的产生量。如图5所示，在实验设置的时间范围内，随着时间的延长纳米马达NO的释放量持续增加，即该纳米马达可以持续释放NO 96h，释放量为4.7μM。证明本发明的纳米马达NO释放时间长、释放量高。
实施例6
两性离子基NO驱动纳米马达在癌细胞环境中的运动性能研究：
(1)称取实施例3制备的纳米马达1mg，加入5mL去离子水，超声20min充分分散，得到200μg/mL均匀分散的纳米马达溶液；
(2)将乳腺癌细胞MCF-7以5*105cell/mL接种于14mm细胞培养皿中，完全培养基体积为1mL，置于37℃恒温培养箱内，使细胞贴壁过夜；
(3)取200μg/mL均匀分散的纳米马达溶液10μL，直接加入上述的贴壁细胞培养皿中，即刻使用荧光显微镜在观测并记录纳米马达在的运动状况。
(4)图6为的纳米马达的运动轨迹，证明该纳米马达在细胞环境中可以运动。并根据运动轨迹计算出其运动速度约为3.48μm/s，并对均方位移分别进行抛物线拟合和线性拟合(图7和图8)，如图7和8所示，结果与抛物线呈现高度相关性，证明该纳米马达在细胞环境内的运动方式为自驱动而非布朗运动。
实施例7
两性离子基NO驱动纳米马达趋化性研究：
(1)称取实施例3制备的纳米马达1mg，加入1mL去离子水，超声充分分散，得到1mgmL-1均匀分散的纳米马达溶液。将乳腺癌细胞MCF-7以5*105cell/mL接种于如图9所示的趋化性模型装置的右侧室中，置于37℃恒温培养箱内，使细胞贴壁过夜，构建装置内由右至左的ROS浓度由高至低的ROS浓度梯度。作为对照不在右侧室种植细胞，以提供一个无ROS浓度梯度的环境。
(2)分别向有ROS浓度梯度和无ROS浓度梯度的两个装置的左侧室中加入250μL浓度为1mg mL-1的两性离子基NO驱动纳米马达溶液。20min后，将模型右侧室中的溶液吸取100μL检测其荧光强度。如图10所示，在有ROS浓度梯度的模型右室中检测纳米马达的荧光强度比对照组(无ROS浓度梯度)的荧光强度高出约8倍，证明了该两性离子基NO驱动纳米马达趋化性具有高ROS浓度趋化性。
实施例8
两性离子衍生物的NO驱动纳米马达的生物相容性评估；
(1)将内皮细胞(HUVECs)以5*104cell/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁后，然后将实施例3制备的纳米马达分散于培养基中，配制不同浓度的纳米马达(20,50，100,150,200μg mL-1)与HUVECs孵育不同时间(12h,24h,48h)后使用MTT试剂检测细胞活性；
(2)由图11可以看出在上述纳米马达浓度下分别与HUVECs孵化不同时间(12h、24h和48h)，HUVECs的细胞活性无明显变化，初步证明了纳米马达的生物相容性；
(3)接着，将5mg纳米马达加入至5mL氧化氢溶液(0.002％)在37℃水浴环境中充分反应48h，离心取出下层降解后的产物，此时认为该产物在癌细胞环境中不会继续产生NO。将MCF-7以5*105cell/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁后，将降解后的材料以不同浓度的产物(20,50，100,150,200μg mL-1)与癌细胞在37℃的培养箱中孵育不同时间(12h、24h和48h)检查细胞活性；
(4)由图12可以看出材料浓度的增加(降解后)和孵育时间的延长，癌细胞活性几乎不受影响，从而证明该两性离子基材具有良好的生物相容性。
实施例9
两性离子衍生物的NO驱动纳米马达的抗癌性能评估
(1)将MCF-7以5*105cell/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁后，将实施例3制备的纳米马达用完全培养基配制成分散液，按不同终浓度(20、50、100、150、200μg mL-1)与癌细胞孵化不同时间(12h、24h和48h)后检测细胞的细胞活性；
(2)由图13可以看出纳米马达对癌细胞的杀伤性能是呈浓度和时间依赖的。具体来说，同一时间下随着与细胞孵化的材料浓度的增大癌细胞的细胞活性逐渐降低，在48h的时间点下，材料浓度由20μg mL-1上升至200μg mL-1时，细胞活性由87.4％降低至49.7％；且当纳米马达的浓度一定时，随着纳米马达与细胞孵化时间的延长细胞活性逐渐下降。造成以上结果的原因可能是纳米马达在细胞环境下产生的NO具有浓度和时间依赖性，随着纳米马达浓度的增大及与细胞孵化时间的延长NO的产生量逐渐增大，对细胞的杀伤能力逐渐增强。
对比例1
采用选用端基具有双键的甲基丙烯酸为单体与二硒醚化合物为交联剂制备纳米粒子PMSe，接着使用弱静电结合的方式将其与L-精氨酸静电结合制备出后负载类型的纳米马达PMSe/A纳米马达。
具体实验步骤：将甲基丙烯酸(500mg，5.81mmol)、AIBN(11.10mg，0.07mmol)和二硒交联剂(55.60mg，0.15mmol，本发明实施例2制备)溶解在三颈烧瓶中的40mL乙腈中，并保持在氮气气氛下，回流1h。离心(5000rpm，10min)收集得到的纳米凝胶，并用去离子水洗涤至少三次后冷冻干燥。接着，称取50mg上述制备的产物并将其分散在5mL的水溶液中，接着加入5mg L-精氨酸在室温下搅拌24h后，蒸馏水洗涤3次，离心得到产物后干燥即得到负载型NO驱动纳米马达，负载型NO驱动纳米马达的TEM图如图14所示，其粒径与实施例3制备纳米马达接近。
采用实施例5的方法分别检测其NO的释放量和运动速度，如图15-17所示，结果发现与PAMSe(4.71μM)相比负载型PMSe/A纳米马达NO的释放量为1.57μM。由负载型PMSe/A纳米马达在细胞环境中的运动轨迹和MSD二次项拟合曲线得出的运动速度约为1.8±0.4μm/s，远小于本发明提出的共价接枝型纳米马达的运动速度(3.48±0.9μm/s)。由此可以看出，本发明提出的PAMSe纳米马达具有更高的燃料负载效率从而提高了NO的释放周期和释放量，同时也提高了该纳米马达的运动速度。
实施例10
实施例10中两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达的制备方法。其中采用实施例1的方法制备L-精氨酸衍生物，不同之处在于：L-精氨酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为0.5，去离子水与1,4-二氧己环的体积比为1，1,4-二氧己环与三乙胺的体积比为1，搅拌反应温度为20℃，反应时间为48h；
其中采用实施例2的方法制备二硒醚化合物交联剂，不同之处在于：2,2-二硒烷二乙基双(1-乙胺)二盐酸盐与甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.1，搅拌反应温度为0℃，反应时间为48h。
其中采用实施例3的方法制备纳米马达，不同之处在于：L-精氨酸两性离子衍生物与二硒醚化合物交联剂的摩尔比为5，L-精氨酸两性离子衍生物与引发剂的摩尔比为1，引发剂为偶氮二异庚腈，反应的溶剂为乙腈，反应温度为80℃，反应时间为5h，超离心的转速为10000rpm，离心时间为30min。
实施例11
实施例11中两性离子聚合物基一氧化氮(NO)驱动纳米马达的制备方法。其中采用实施例1的方法制备L-精氨酸衍生物，不同之处在于：L-精氨酸与甲基丙烯酸酐的摩尔比为1，去离子水与1,4-二氧己环的体积比为5，1,4-二氧己环与三乙胺的体积比为5，搅拌反应温度为30℃，反应时间为10h；
其中采用实施例2的方法制备二硒醚化合物交联剂，不同之处在于：2,2-二硒烷二乙基双(1-乙胺)二盐酸盐与甲基丙烯酰氯的摩尔比为0.5，搅拌反应温度为30℃，反应时间为10h。
其中采用实施例3的方法制备纳米马达，不同之处在于：L-精氨酸两性离子衍生物与二硒醚化合物交联剂的摩尔比为20，L-精氨酸两性离子衍生物与引发剂的摩尔比为20，引发剂为偶氮二异丁酸二甲酯中的一种，反应温度为100℃，反应时间为1h，超离心的转速为12000rpm，离心时间为10min。
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