发明内容

本发明的首要目的是提供3个从岷江瑞香中制备的愈创木烷倍半萜衍生物。

本发明还要提供所述3个愈创木烷倍半萜衍生物的制备方法及所述愈创木烷倍半萜衍生物在制备抗神经炎症药物中的用途。

本发明所述3个从瑞香科瑞香属植物岷江瑞香中提取分离得到的愈创木烷倍半萜衍生物，结构如下：

本发明的从岷江瑞香中提取分离所述3个愈创木烷倍半萜衍生物的方法，包括如下步骤：

(1)取干燥的岷江瑞香全草以乙醇提取，合并提取液浓缩得到浸膏；所得浸膏先后采用乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯部分和正丁醇部分分别经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/甲醇按体积比100:1～1:1进行梯度洗脱，共收集到4个馏分Fr.A～Fr.D；

(2)馏分Fr.A经聚酰胺柱色谱，以乙醇水梯度洗脱，共收集到2个馏分Fr.A1～Fr.A2；

(3)馏分Fr.A1先后经HP20柱色谱分离和ODS柱分离，以乙醇水梯度洗脱，收集得到5个馏分Fr.A1-I，Fr.A1-II，Fr.A1-III，Fr.A1-IV，Fr.A1-V；

(4)馏分Fr.A1-I经硅胶柱，以石油醚/乙酸乙酯按体积比100:1～5:1梯度洗脱，其中洗脱得到的第2个馏分Fr.A1-I-2经制备型HPLC，以甲醇/水洗脱，得到8个馏分Fr.A1-I-2-1～Fr.A1-I-2-8，Fr.A1-I-2-3再经过半制备型HPLC色谱，以乙腈/水洗脱，分离纯化得到化合物1，Fr.A1-I-2-7-5经过半制备型HPLC色谱，以甲醇/水洗脱，分离纯化得到化合物2和化合物3。

上述提取方法，其中：

步骤(1)中所述乙醇为70-80％工业乙醇，回流提取2-3次。

步骤(2)中所述乙醇/水的梯度浓度为：20％，70％。

步骤(3)中先后经HP20柱色谱分离和ODS柱分离的乙醇水的梯度浓度分别为：20％，50％，90％和40％，50％，60％，70％，80％，90％。

所得的化合物经过系统结构鉴定，结果如下，对应图谱如图2～26所示：

Daphnenoid A(1)：无色晶体(甲醇)，HRESIMS给出准分子离子峰[M+H]⁺峰m/z 291.1220(calcd for C₁₆H₁₉O₅,291.1227)，结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测其分子式为C₁₆H₁₈O₅，计算其不饱和度为8。UV图谱中在238nm波长下显示有吸收峰，UV(MeOH)λ_max(logε):238nm(0.81)。

¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)中，δ_H6.16(1H,d,J＝1.5Hz)为一个烯氢质子信号，δ_H3.93(1H,s)为一个羟基信号，δ_H2.11(1H,brd,J＝5.3Hz)为一个次甲基质子信号，δ_H3.63(3H,s)为甲氧基上质子信号，δ_H2.02(3H,d,J＝1.4Hz)，δ_H1.23(3H,s)为两个甲基碳上的氢信号。结合HSQC谱，对¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)谱进行分析显示出16个碳信号，其中有四个sp³杂化的季碳信号(δ_C84.7,68.2,60.5，59.0)，四个sp²杂化的季碳信号(δ_C212.6,198.0,171.0，158.9)，一个连有质子的双键碳信号(δ_C125.4)，一个次甲基碳信号(δ_C53.5)，三个亚甲基碳信号(δ_C38.6，33.0，32.2)和三个甲基碳信号(δ_C52.5，22.7，11.9，其中δ_C52.5的碳上连氧)。考虑到有一个双键，三个羰基以及八个不饱和度，根据以上信息推断化合物1可能是一个拥有四环系统的倍半萜类化合物。

通过对HMBC谱分析，H-5(δ_H2.11)与C-3(δ_C212.6)相关，H-2(δ_H2.98,δ_H 2.57)与C-5(δ_C53.5)相关以及H₃-15(δ_H1.23)与C-3(δ_C212.6)，C-4(δ_C59.0)和C-5(δ_C 53.5)的相关证实了由C-1，C-2，C-3，C-4，C-5组成的五元碳环A的存在，并且其C-3位上酮的存在以及C-4位上甲基的存在。H₃-16(δ_H3.63)与C-13(δ_C171.0)的相关证实了甲氧酰基的存在。为了进一步确定化合物1的平面结构，我们利用计算机辅助结构解析系统(CASE)得到一系列符合化合物1的2D核磁数据可能的平面结构，接着基于经验NMR化学位移预测选出最可能的结构。如下内容所示的“化合物1的CASE结果和关键NOESY相关以及晶体结构”，在1.0s内生成4个结构并根据¹³C的平均偏差进行排列。根据最低标准偏差值确定化合物1匹配最好的结构。在MCD图中，C-12位上的亚甲基氢(δ_H2.31，1.82)与五个季碳(C-1，C-3，C-4，C-7，C-11)和一个叔碳(C-5)存在相关，确定了C-1和C-7通过C-11桥连在一起并且甲氧酰基连接在C-11位上，以及由C-1,C-4,C-5,C-12和C-11所组成的五元碳环B的存在。7位上的OH(δ_H3.93)与C-6(δ_C32.3)，C-8(δ_C198.0)，C-11(δ_C68.2)存在相关，说明了7-OH连接在C-7上，C-8位上存在酮羰基。根据以上信息，并结合¹H-¹H COSY谱中所显示的自旋偶合系统，说明了笼状结构的存在。最后，推断化合物1的平面结构是一个具有四环[5.3.2.0^1,6.0^4,11]十二烷骨架新颖的笼状倍半萜。

接下来通过NOESY谱确定了化合物1的相对构型，H-5(δ_H2.11)与H-15(δ_H1.23)的NOE相关，说明H-5与H-15在同一侧，归属为α朝向；H-2β/H-12β以及H-6β/H-12α的相关进一步证实上述推断。由于5/5/5/6笼状四环系统的空间位阻和五元碳环C以及环D的刚性连接，因此相对构型被归属为1R*,4R*,5R*,7S*,11S*。然后，利用NMR化学位移计算进一步确定化合物1的平面结构和相对构型。为了确定其绝对构型，在B3LYP/6-311++G(2d,p)水平下对化合物1进行计算ECD，其中(1R,4R,5R,7S,11S)-1的计算ECD谱图与化合物1的实验ECD谱图吻合。在经过多次尝试后，在二氯甲烷/甲醇(1:1)的混合溶剂中得到化合物1的单晶，之后X-ray衍射结果证实了绝对构型的归属以及立体结构的推测(图10,CCDC 1876453,Flackparameter＝-0.04(3))。经scifinder数据库检索，化合物1为未报道的新化合物，命名为Daphnenoid A。

Daphnenoid B和Daphnenoid C(2-3)：无色油状物，化合物2的旋光值为 化合物3的旋光值为HRESIMS给出化合物2的准分子离子峰m/z273.1464[M+Na]⁺(calcd for C₁₅H₂₂O₃Na,273.1461)，化合物3的准分子离子峰m/z273.1462[M+Na]⁺(calcd for C₁₅H₂₂O₃Na,273.1461)。结合¹H-NMR、¹³C-NMR推测化合物2和3的分子式都为C₁₅H₂₂O₃，计算不饱和度为5。对化合物2和3的¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)以及HSQC谱图的分析显示出15个碳信号，包括一个sp³杂化的季碳信号，三个sp²杂化的季碳信号，一个质子化的烯氢碳信号，三个次甲基碳信号，五个亚甲基碳信号以及两个甲基碳信号。在所有观察到的信号中，一个双键和两个羰基占据了三个不饱和度，剩余两个不饱和度可能组成两个碳环骨架，根据以上信息说明化合物2和3是一对具有相同双环系统骨架的倍半萜。

对HMBC谱分析，H₂-2与C-1，C-4和C-5的相关以及H₂-3与C-1和C-5的相关说明了五元碳环A的存在，并且其C-1位上存在酮羰基而C-4位上存在甲基。H₂-13与C-7，C-11和C-12的HMBC相关也说明了末端双键的存在。由H-4与C-6和C-12，H-12与C-1和C-6以及H-6与C-1和C-12的HMBC相关说明了双环系统由一个螺碳原子C-5连接在一起。由于H-7的关键HMBC相关缺失以及H-8和H-3的化学位移值的重叠使得环B的归属遇到困难，尽管H-6α与C-11存在相关，但是没有其他足够的证据证明五元碳环B的存在。此外，在自然界中奇特的5/5螺环倍半萜还没有被发现，甚至5/6螺环系统的倍半萜在植物中和海洋微生物中也很稀少。为了进一步准确证实环B的结构，采用计算机辅助结构解析系统(CASE)来生成所有可能的结构，相比其他候选结构，具有5/5骈合螺环系统的结构具有最低¹³C平均偏差，被认为是最合理的结构。之后又进一步通过NMR化学位移计算得到证实。最后，Daphnenoid B和DaphnenoidC(2-3)平面结构得到确定，并且其螺[4.4]壬烷骨架也得到确定。

通过对化合物2和3的NOESY谱进行分析，H-6β与H-9和H₃-15的相关证明了CH₃-15和H-7都为α-朝向；在化合物2中发现了H-7与H-12的相关，说明了H-7与H-12在同一侧，为α-朝向，而在化合物3中没有发现H-7与H-12的相关，却发现了H-4与H-12的相关，说明在化合物3中H-12为β-朝向，这说明化合物2和3是非对映异构体。此外，为了进一步确证化合物2和3这对非对映异构体的区别，之后在PCM溶剂模型的氯仿中并在mPW1PW91/6-311+G(d,p)//ωB97XD/6-31G(d)水平下，对两个候选结构(A和B)的NMR化学位移进行计算，首先使用基于量子机制化学位移分析得到的R²值来区别化合物2和3，但是R²值的区别很小，无法用来确证化合物2和3的H-12的相对构型；之后，采用MAE_ΔΔδ来归属H-12的构型，最低的MAE_ΔΔδ值指示化合物2与结构A和化合物3与结构B的组合匹配最好；最后又采用另一个高可信度的用于非对映异构体结构归属的参数CP3，CP3计算结果显示4R*,5R*,7S*,12R*的构型(即结构B)属于化合物3，并基于实验和计算¹H和¹³C化学位移比较的结果，确定其可能性为100％。据此，NOESY分析，R²值，MAE_ΔΔδ以及CP3结果都一致，因此化合物2和3的相对构型分别为4R*,5R*,7S*,12S*和4R*,5R*,7S*,12R*。但是由于2-丁酮部分的柔性，对化合物2和3的单晶没有培养成功；最后采用实验与计算ECD谱图比较来确定化合物2和3的绝对构型，化合物2和3的绝对构型分别确定为4S,5S,7R,12R和4S,5S,7R,12S。

经scifinder数据库检索，化合物2和3为未报道的新化合物，命名为Daphnenoid B(2)和Daphnenoid C(3)。

化合物1-3的¹H NMR数据和¹³C NMR数据

化合物1-2的HMBC和¹H-¹H COSY相关

化合物1的CASE结果和关键NOESY相关以及晶体结构

化合物2-3的关键NOESY相关

本发明还提供一种药物组合物，包括所述的愈创木烷倍半萜衍生物、该化合物在药学上可接受的盐、药学上可接受的赋形剂或/和载体。

本发明还提供岷江瑞香提取物在治疗抗神经炎症的药物中的应用。

本发明还提供所述3个愈创木烷倍半萜衍生物在治疗抗神经炎症的药物中的应用。

对本发明涉及的3个愈创木烷倍半萜衍生物进行抗神经炎症活性评价。结果化合物1-3显示出与阳性药Dex相当的对LPS诱导的BV-2小鼠小胶质细胞抗神经炎症活性。因此，本发明所述的愈创木烷倍半萜衍生物具有临床治疗抗神经炎症药物的潜力。

本发明的优点在于，所述愈创木烷倍半萜衍生物均为新化合物，结构新颖，且均为立体构型确定的光学纯化合物，同时有较好的抗神经炎症活性，具有进一步开发的价值。