具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、分别用QRT-PCR检测了胶质瘤细胞系和原代胶质瘤干细胞：U87(胶质瘤细胞系)、GBM-1(原代胶质母细胞瘤细胞)、T98G(人脑胶质瘤细胞)、LN229(脑胶质瘤细胞)、GSC-2(原代胶质瘤干细胞)和GSC-3(原代胶质瘤干细胞)中HOXA5 mRNA表达水平。检测方法如下：

1)收集处于对数生长期的细胞，离心消化收集沉淀。

2)使用飞捷RNA提取试剂盒提取RNA。

3)测定RNA浓度后按照50μg/μl的RNA浓度设置逆转录反应体系(20μl)：RNA Xμl，5×Prime Script RT Master Mix 4μl，DEPC水(补充至20μl，即20-X-4μl)。逆转录反应条件设置为：37℃30min→85℃5sec→4℃forever。

4)RT-PCR：将步骤3)逆转录获得的cDNA进行实时荧光定量PCR检测，具体反应体系设置如下：cDNA 1μl，2×SYBR Premix Ex Taq 5μl，两者预混后按照每孔6μl加至8连管内；上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH₂O3μl，三者预混后按照每孔4μl加入8连管盖子内。将8连管与8连管盖合并后使用掌上离心机充分混匀，上机。

PCR反应体系设置为：

上机完成后使用软件对结果进行分析。

本实验所需引物序列如下表1：

表1

2、分别在胶质瘤干细胞和分化胶质瘤细胞中敲低和过表达HOXA5

在已经构建完成的HOXA5过表达质粒及shRNA序列基础上转染胶质瘤细胞，使用puro筛选及流式细胞分选GFP阳性表达细胞后进行下一步功能实验。

HOXA5过表达质粒构建

引物序列如下表2所示：

表2

过表达序列如SEQ No.9所示。

ATGAGCTCTTATTTTGTAAACTCATTTTGCGGTCGCTATCCAAATGGCCCGGACTACCAGTTGCATAATTATGGAGATCATAGTTCCGTGAGCGAGCAATTCAGGGACTCGGCGAGCATGCACTCCGGCAGGTACGGCTACGGCTACAATGGCATGGATCTCAGCGTCGGCCGCTCGGGCTCCGGCCACTTTGGCTCCGGAGAGCGCGCCCGCAGCTACGCTGCCAGCGCCAGCGCGGCGCCCGCCGAGCCCAGGTACAGCCAGCCGGCCACGTCCACGCACTCTCCTCAGCCCGATCCGCTGCCCTGCTCCGCCGTGGCCCCCTCGCCCGGCAGCGACAGCCACCACGGCGGGAAAAACTCCCTAAGCAACTCCAGCGGCGCCTCGGCCGACGCCGGCAGCACCCACATCAGCAGCAGAGAGGGGGTTGGCACGGCGTCCGGAGCCGAGGAGGACGCCCCTGCCAGCAGCGAGCAGGCGAGTGCGCAGAGCGAGCCGAGCCCGGCGCCGCCCGCCCAACCCCAGATCTACCCCTGGATGCGCAAGCTGCACATAAGTCATGACAACATAGGCGGCCCGGAAGGCAAAAGGGCCCGGACGGCCTACACGCGCTACCAGACCCTGGAGCTGGAGAAGGAGTTCCACTTCAACCGTTACCTGACCCGCAGAAGGAGGATTGAAATAGCACATGCTCTTTGCCTCTCCGAGAGACAAATTAAAATCTGGTTCCAAAACCGGAGAATGAAGTGGAAAAAAGATAATAAGCTGAAAAGCATGAGCATGGCCGCGGCAGGAGGGGCCTTCCGTCCCTGA

HOXA5 shRNA慢病毒载体图谱如图9所示。病毒载体构建框架如表2所示：

表2

测序结果分析：

HOXA5 ShRNA-1(如SEQ No.10所示)

nntggnatnaatttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggccggactaccagttgcataatctcgagattatgcaactggtagtccggttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccnngagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgacctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccntgccctggacccaccctcgtgaccacccnnacnacggcgtgcagtgcnttcagcngctnncnaccacatnngcagcacganntnnnagtcggcatgcccnnnntacgnnccannnnnnnacatcttcttnaaggacgaacggnnactncanagnnnn

HOXA5 ShRNA-2(如SEQ No.11所示)

nnnnngataanttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggctgagtatctgagcgtttaaactcgagtttaaacgctcagatactcagttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccncaagttcagcgtgtccggcgaggggcgaagggcgatgccaccttacggctagctgaccctgaagttcatctgcaccannggcagctgcccgtgcccttgnnncacccctcnnngaccaccctgaactacggcgtgcagtgnnnagccgcttacccgacnacatgnncagcacgaacttnncagntcgnnntnncnnaaggctacgtcaggagcncacnatctttcttcag

图1为各胶质瘤细胞中HOXA5表达水平以及敲低和过表达HOXA5的各项实验结果，其中检测的胶质瘤细胞系和原代胶质瘤干细胞U87、GBM-1、T98G、LN229、GSC-2和GSC-3中HOXA5 mRNA表达水平结构如图1中A所示，以及反映替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)杀伤肿瘤细胞效果的IC50值如图1中B所示，并进行了相关性分析，图1中C结果显示HOXA5表达与TMZ的IC50值呈显著正相关，表明HOXA5表达高低可能直接影响TMZ杀伤效果。接下来我们又分别在胶质瘤干细胞和分化胶质瘤细胞中敲低和过表达HOXA5，通过对凋亡信号通路相关标志物的蛋白表达进行检测后发现敲低HOXA5表达后BAX、Cleavage-caspase3、Cleavage-PARP的表达均显著升高，而过表达HOXA5后这些蛋白的表达也随之降低(图1中D)，以上结果提示我们HOXA5表达变化会显著影响TMZ对胶质瘤细胞的杀伤作用，并直接反映在凋亡信号通路标记物的表达变化情况上。为了更直观地反应改变HOXA5表达后TMZ杀伤肿瘤细胞的情况，我们使用流式细胞检测凋亡细胞的比例，结果发现过表达HOXA5后AnnexinV阳性表达的细胞比例明显降低(图1中E)，敲低HOXA5后阳性细胞比例则显著升高(图1中F)。最后，我们在已经构建好的T98G耐药细胞株中检测发现HOXA5表达显著高于非耐药细胞(图1中G)，而在此基础上敲低HOXA5表达后，IC50值又显著下降，提示这些细胞又部分恢复了对TMZ杀伤的敏感性(图1中H)。

实施例2

验证HOXA5表达在经TMZ治疗胶质母细胞瘤样本中的临床病理学意义

在实施例1中通过体外功能实验明确了HOXA5表达与TMZ IC50值的关系，接下来首先在数据库中验证HOXA5表达与TMZ疗效的关系，发现在使用TMZ治疗组，HOXA5表达高低可以有效区分患者预后(图2中A)，而在未治疗组HOXA5表达与TMZ疗效则无相关性(图2中B)，提示TMZ疗效与HOXA5表达高低密切相关。接下来我们将HOXA5表达与TMZ疗效评价常用指标MGMT启动子甲基化联合分析，结果显示在MGMT甲基化组HOXA5表达高低可以有效区分患者预后，而在MGMT非甲基化组HOXA5表达则与患者预后没有相关性(图2中C)，说明MGMT非依赖性的耐药的产生可能与HOXA5表达相关，提示基于MGMT甲基化基础上评价HOXA5表达与TMZ疗效的重要性。

实施例3 HOXA5与TMZ联用能有效抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期

继续在小鼠原位移植瘤中检测了HOXA5表达与TMZ疗效的关系：

1)收集处于对数生长期的敲低HOXA5表达胶质瘤干细胞及对照组细胞，离心重悬计数后将细胞密度调整为2×10⁶个/ml。

2)使用已配制好的戊巴比妥钠通过腹腔注射将4-6周龄的雌性NOD/SCID小鼠麻醉后，使用蛋白微量进样器将5μl细胞悬液在小鼠脑前正中线与双眼外眦连线交点处往右后0.5cm位置垂直缓慢进针注射，进针深度为0.5cm，注射完成后注意轻柔缓慢拔出。

3)移植瘤注射7天后，开始使用替莫唑胺治疗5天，其中对照组(Ctr)注射不含替莫唑胺的溶液，实验组(TMZ)按照10mg/kg进行治疗；同时，HOXA5敲低组(TMZ+sh HOXA5)持续饲喂添加多西环素的水溶液诱导HOXA5敲低表达。

4)每天观察小鼠的生存情况并在其出现症状后及时收取脑组织后进行冰冻切片和制备石蜡组织样本。

4)在移植瘤模型建立后第5天、12天、19天、26天进行活体成像实验检测。具体步骤为每只小鼠通过腹腔注射200ul luciferin底物，10min后将麻醉后的小鼠用活体成像系统进行检测。

5)待小鼠自然死亡后，及时记录时间并分析生存期。

图3为小鼠原位移植瘤实验结果，首先通过活体动物成像实验显示，与对照组相比单独使用TMZ能够有效抑制胶质瘤细胞的生长速度，但是在后期TMZ单独治疗组肿瘤持续缓慢生长的情况下，敲低HOXA5联合TMZ治疗组的肿瘤生长会更加缓慢(图3中A、B)，提示HOXA5敲低可能会增加TMZ杀伤效果。此外，对荷瘤小鼠的生存期进行统计分析后发现敲低HOXA5联合TMZ治疗也能有效延长小鼠的生存期(图3中C)。

实施例4

上述研究结果表明HOXA5表达可以影响胶质瘤细胞TMZ耐药性，接下来我们利用生物信息学分析与HOXA5相互作用的分子，进一步明确HOXA5的调控机制。在胶质瘤数据库中进行了筛选，综合4个数据库分析得到了与HOXA5表达相关的39个分子(图4中A)，接下来我们又通过在线数据库分析了与HOXA5可能相互作用的网络(图4中B)，将上述两组数据交叉合并后我们发现包括PBX1、MEIS1、EZH2在内的13个为可能与HOXA5相互作用的分子，并进一步逐一实验。

分别对TMZ处理的胶质瘤干细胞进行免疫荧光双染和对胶质母细胞瘤样本进行免疫组织化学染色，来检测HOXA5与其可能相互作用分子的表达关系。结果在对TMZ处理的胶质瘤干细胞进行免疫荧光双染后发现HOXA5与EZH2表达存在共定位现象(图5中A)。在胶质母细胞瘤样本中通过免疫组织化学染色对两者的表达进行检测后也发现HOXA5表达与EZH2表达呈正相关(图5中B)。

HOXA5作为转录因子，既可能结合在EZH2启动子区域调控其表达，也可能通过蛋白相互作用的关系进行调控。为了明确两者的调控模式，分别用实验验证其调控模式，在HOXA5过表达后，EZH2 mRNA水平没有明显变化(图6中A)，以上结果提示HOXA5调控EZH2可能是通过其蛋白-蛋白相互作用来实现的。接下来我们在胶质瘤干细胞中进行了Co-IP实验，发现HOXA5或者EZH2抗体都能将对方蛋白捕获(图6中B)，说明HOXA5与EZH2的作用模式是通过在体内蛋白相互结合而实现的。为了进一步明确两者的结合与HOXA5影响TMZ耐药性的关系，我们首先在TMZ处理的胶质瘤干细胞中敲低HOXA5表达后检测了EZH2及其下游效应分子H3k27me3的表达情况，发现两者的表达也均下降(图6中C)。在检测凋亡细胞比例的功能回复实验中我们发现过表达HOXA5的基础上对EZH2表达进行敲低，结果显示可以部分回复过表达HOXA5造成的凋亡细胞比例降低的情况(图6中D),而在对凋亡信号通路和EZH2下游信号通路蛋白表达进行检测时也发现了这种回复效应(图6中E)，提示HOXA5-EZH2通路影响TMZ耐药的重要性。

实施例5

最后，我们使用了EZH2抑制剂GSK343(浓度1mg/ml,培养基中按1:100比例稀释，作用24hr)对上述实验进行了重复。我们发现在过表达HOXA5的基础上，加入GSK343处理细胞后，EZH2及下游信号通路H3k27me3蛋白的表达均表现为激活后的抑制状态(图7中A)。而在通过流式细胞染色对凋亡细胞进行检测中也发现GSK343的处理可以部分回复由于过表达HOXA5引起的对细胞杀伤效应的保护作用(图7中B和C)。

EZH2抑制剂可以提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性

前面已经证明使用EZH2抑制剂GSK343可以部分回复由HOXA5过表达所引起的肿瘤细胞抵抗TMZ的杀伤作用。进一步就单独使用GSK343的效应进行初步探讨。我们首先比较了TMZ单独处理以及联合GSK343处理后胶质瘤细胞的凋亡情况，发现凋亡信号通路标志物蛋白表达的水平(图8中A)和凋亡细胞的比例(图8中B)均呈现上升的状态。接下来分别在T98G耐药细胞中加入GSK343，发现凋亡信号通路标志物的蛋白水平(图8中C)和IC50值(图8中D)以及凋亡细胞的比例(图8中E)均回复至非耐药细胞水平。而在使用GSK343抑制剂后再过表达HOXA5则会使胶质瘤细胞再次产生对TMZ的耐药抵抗(图8中F)。此外，在单独敲低EZH2表达后，凋亡信号通路标志物的蛋白水平也出现上升的情况(图8中G)。以上结果提示EZH2抑制剂GSK343在TMZ治疗耐药中应用的价值及相关机制。HOXA5下游的EZH2抑制剂GSK343可以联合替莫唑胺作为替莫唑胺耐药患者的用药选择。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> EZH2抑制剂在制备抵抗替莫唑胺耐药性药物中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aactcatttt gcggtcgcta t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

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<210> 5

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<210> 7

<211> 29

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<210> 8

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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