一种结合冠状病毒的双功能融合蛋白、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种结合冠状病毒的双功能融合蛋白、其制备方法及应用 (Dual-function fusion protein combined with coronavirus, preparation method and application thereof ) 是由 王皓 钱卫珠 张大鹏 李晶 陶静 李伟 李继阳 张浔敏 李云峰 袁秀珍 焦树阁 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种结合冠状病毒的双功能融合蛋白,其两端结合区域分别结合冠状病毒S蛋白(Spike蛋白)的不同表位,同时具有抗SARS-CoV及抗SARS-CoV-2的功能,及结合ACE2的功能。本发明所提供的结合冠状病毒的双功能融合蛋白,具有治疗病毒感染细胞的能力,同时还具有抗病毒及降低肺部炎症、降低细胞因子风暴、治疗肺部损伤的作用。(The invention discloses a dual-function fusion protein combined with coronavirus, wherein the combining areas at two ends of the fusion protein are respectively combined with different epitopes of coronavirus S protein (Spike protein), and the fusion protein simultaneously has the functions of resisting SARS-CoV and SARS-CoV-2 and is combined with ACE 2. The difunctional fusion protein combined with coronavirus provided by the invention has the capability of treating virus infected cells, and also has the effects of resisting virus, reducing lung inflammation, reducing cytokine storm and treating lung injury.)
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，具体地，本发明公开了一种结合冠状病毒的双功能融合蛋白、其制备方法及应用。背景技术
2019-新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV， SARS-CoV-2），是一种有包膜的、带正电荷的单链RNA病毒，属于β冠状病毒属，Sarbecovirus亚属。人感染SARS-CoV-2（2019-nCoV， SARS-CoV-2）后，大部分患者会出现发热、咳嗽、呕吐和腹泻、轻症肺炎等症状，还有部分患者会出现重症肺炎，病情严重者可出现急性呼吸衰竭、休克、甚至死亡。
在SARS-CoV-2（2019-nCoV，SARS-CoV-2）感染及发病的整个过程中，人体内一种重要的金属蛋白酶-血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）发挥了重要作用（Lu R，Zhao X，Li j，et al. Genomic characterization and epidemiology of2019 novel coronavirus：implications for virus origins and receptor binding[J]. Lancet，2020.[Epub ahead of print]）。
ACE2是血管紧张素转换酶的一种同源物，是由805个氨基酸构成的Ⅰ型跨膜蛋白，有2个结构域，分别为氨基末端催化结构域和羧基末端结构域，催化结构含有1个活性位点-锌金属蛋白结构域，ACE2可在人体心脏、肾脏、肺脏、肝脏、睾丸和肠等多种组织中表达。
ACE2在新冠肺炎病程中的作用，除了作为病毒结合的受体外，ACE2还参与调解免疫过程。研究者发现的肺腺癌组织中ACE2表达上升，提示该类患者可能具有更大的新冠病毒易感性，并可能通过miR-125b-5p-ACE2-IL6轴，进一步可能引起细胞因子风暴和肺炎加重的现象。同时，在新冠病毒感染后可以进一步增加细胞ACE2的表达，从而更利于病毒的感染（ Wang, P. H. (2020). Increasing Host Cellular Receptor—Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2) Expression by Coronavirus may Facilitate 2019-nCoVInfection. bioRxiv.）。
血管紧张素转化酶2（ACE2）是一把双刃剑：在病毒感染过程中，它是新冠病毒的膜上结合受体，与病毒和宿主细胞的融合、入侵过程有关；在流感病毒、SARS引起炎症和急性肺损伤的情况下，ACE2促进血管紧张素II转化为血管紧张素1-7，抑制血管紧张素II介导的NF-κB信号，从而避免大量炎症信号引发的细胞因子风暴，减缓病程。
前期研究发现，一旦被SARS-CoV结合，宿主细胞表面的ACE2量、mRNA水平和酶活性均会发生显著下降。尽管这可以减少病毒入侵，但也可能加重炎症反应。
白介素-6（interleukin- 6；IL- 6）正是引起细胞因子风暴的主要因素，感染SARS-CoV-2（2019-nCoV）后，激活的病原性T细胞就会产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-6。GM-CSF可以激活CD14 + CD16 +炎性单核细胞，进一步产生更多的细胞因子，包括IL-6。IL-6在这个正反馈循环中扮演不可或缺的一份子，最终促成免疫系统的失控。
此时，肺中大量的免疫细胞和组织液会阻塞肺泡和毛细血管之间的气体交换，从而导致急性呼吸窘迫综合征。一旦形成细胞因子风暴，免疫系统在清除病毒的同时，会杀死肺中的许多正常细胞，从而严重破坏肺的通气功能，进而导致患者死亡
研究发现肺癌患者ACE2表达上调，新冠肺炎易感性上升；但ACE2在新冠肺炎病程不同阶段的角色不同，尽管其介导病毒的入侵，但维持ACE2的正常表达对避免细胞因子风暴有重要作用。（Long Chen, et al. Lung Adenocarcinoma Patients Own Higher Risk ofSARS-CoV-2 Infection. Preprints. 26 Feb, 2020.）
SARS-CoV-2（2019-nCoV）使用血管紧张素转化酶2（ACE2）作为进入的受体，这与SARS冠状病毒用于进入的受体相同，这两种冠状病毒都是通过病毒体上的S蛋白（SPIKE蛋白）（病毒spike糖蛋白）与ACE2结合，病毒膜和细胞膜融合，随后RNA病毒将在细胞内复制其基因，并最终产生新的病毒颗粒，这些病毒颗粒将被分泌，以感染其他细胞。（Zhou P，Yang XL，Wang XG，et al：Discovery of a novel coronavirus associated with the recentpneumonia outbreak in humans and its potential bat origin. BioRxiv.2020.01.22.914852）。
RBD（receptor-binding domain）SARS病毒S蛋白（Spike蛋白）的小受体结合域，该结合域已被证明是病毒进入细胞过程中结合ACE2受体的关键域，使用该结合域已被证明能有效阻止SARS进入细胞增殖。（Wong SK，Li W，Moore MJ，et al：A193-amino acidfragment of the SARS coronavirus S protein efficiently binds angiotensin-converting enzyme 2. J Biol Chem. 2004; 279(5):3197-3201）。
在冠状病毒治疗的方法中，若使用结合ACE2蛋白的抗体，会与人体内表达ACE2的正常细胞结合，引起正常组织的炎症反应。使用可以与冠状病毒S蛋白（Spike蛋白）相结合的ACE2-Fc，可以阻止冠状病毒与ACE2的结合，进一步阻止冠状病毒进入细胞。
但是，ACE2-Fc策略的一个潜在局限性是细胞外ACE2水平的增加可能对人体产生未知的影响，已发现人体可分泌少量的细胞外ACE2，因此该细胞外结构域进入血液循环并非是前所未有的。（Shao Z，Shrestha K，Borowski AG，et al：Increasing serum solubleangiotensin-converting enzyme2 activity after intensive medical therapy isassociated with better prognosis in acute decompensated heart failure. J Card Fail. 2013; 19(9):605-610）。将具有活性的重组人ACE2（rhACE2）蛋白应用到酸损伤ACE2基因敲除小鼠和野生型小鼠后，急性肺损伤症状如肺水肿等得到改善（Imai, Y., Kuba,K., Rao, S., Huan, Y., Guo, F., Guan, B., ... & Crackower, M. A. (2005).Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure.Nature, 436(7047), 112-116.）。在动物体内以及Ⅱ期临床研究对确诊的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者应用rhACE2注射治疗后发现，AngⅡ水平快速下降，Ang1-7水平回升，初步显示在人体补充ACE2能够重塑ACE2/ACE平衡（Khan, A., Benthin, C., Zeno, B.,Albertson, T. E., Boyd, J., Christie, J. D., ... & Hardes, K. (2017). A pilotclinical trial of recombinant human angiotensin-converting enzyme 2 in acuterespiratory distress syndrome. Critical Care, 21(1), 234. Treml, B., Neu, N.,Kleinsasser, A., Gritsch, C., Finsterwalder, T., Geiger, R..& Loeckinger, A.(2010). Recombinant angiotensin-converting enzyme 2 improves pulmonary bloodflow and oxygenation in lipopolysaccharide-induced lung injury in piglets.Critical care medicine, 38(2), 596-601.），ACE2具有降低肺部炎症的潜力，同时具有可以耐受的安全性。
在急性SARS-CoV感染过程中抗病毒S糖蛋白IgG扰乱巨噬细胞反应而导致严重的急性肺损伤。使用S-IgG尽管可以明显降低病毒滴度，却在感染的早期阶段引起肺损伤，主要是通过消除伤口愈合的巨噬细胞反应和TGF-β产生，同时促进炎性细胞因子IL-8，和MCP1的产生和炎性巨噬细胞的积累。（Anti-spike IgG causes severe acute lung injury byskewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection.[J]. JCIinsight, 2019, 4(4):e123158.）。
在SARS（Severe Acute Respiratory Syndrome ，严重急性呼吸综合征）爆发后，出现多种治疗方法，同时也有针对SARS的药物生产，其中也包含抗体类药物。在专利US11667640中公开了一种能够中和SARS冠状病毒（SARS-CoV）的结合分子的组合物，该组合组中包含至少两种能够结合SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）并具有SARS-CoV中和活性的免疫球蛋白。
在专利US11667640中，公开了可以与ASRS冠状病毒相结合的抗体，并且公开了所述的抗体是结合SARS-CoV的S蛋白（Spike蛋白）的第318-510位的氨基酸。虽然该件专利中所述的药物是一种组合物，但是组成该组合的抗体，都是针对结合SARS-CoV的S蛋白（Spike蛋白）的第318-510位的氨基酸的抗体，即使每一种抗体的具体结合位点是第318-510位中的不同氨基酸，均会存在彼此间相互影响的弊端。
由于抗体属于大分子蛋白质，并且由于其空间结构的特点，在抗体与抗原相互结合时，会存在抗体间的相互影响，该件专利所提供的组合物，均是结合在SARS-CoV的S蛋白（Spike蛋白）的第318-510位的氨基酸，在与病毒相结合时，会影响抗体中和SARS-CoV冠状病毒的作用效果。
至2019-新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV， SARS-CoV-2）爆发以来，多方科学家在研究SARS-CoV-2的感染途径，中国科学家陈志南及其团队，经研究发现SARS-CoV-2可以通过CD147的新途径侵入宿主细胞：S蛋白（Spike蛋白）与宿主细胞上的受体CD147结合，从而介导病毒入侵（Zhinan. Chen，Ping.Zhu，et al：SARS-CoV-2 invadeshost cells via a novel route: CD147-spike protein，BioRxiv）。