一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子及应用
阅读说明：本技术 一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子及应用 (Nano antibody molecule of targeted dendritic cell and application ) 是由 徐海 李玲 李睿婷 郭子杰 洪伟鸣 朱善元 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子及应用。所述的靶向树突状细胞纳米抗体分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明构建羊驼源天然纳米抗体T7噬菌体展示文库,利用亲和筛选技术淘选出能够与鸡骨髓DCs高亲和力结合的纳米抗体分子。特异性检测显示筛选到的两个纳米抗体分子不仅跟鸡的DCs有结合能力,跟鸭、鹅等禽类DCs也能结合,而不跟DCs以外的骨髓单核细胞、鸡(鸭、鹅)成纤维细胞结合,具有较好DCs结合特异性。应用该纳米抗体分子作为亚单位抗原载体,能够显著提高抗原分子激发的免疫反应,提高抗体水平。因此,本发明筛选到纳米抗体分子可以作为抗原分子的靶向载体,提高抗原递呈效率,为新型禽类疫苗的开发提供支撑。(The invention provides a dendritic cell-targeted nano antibody molecule and application thereof. The amino acid sequence of the targeted dendritic cell nano antibody molecule is shown in SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO. 2. The method constructs an alpaca natural nano antibody T7 phage display library, and elutriates nano antibody molecules capable of being combined with chicken bone marrow DCs with high affinity by utilizing an affinity screening technology. The specificity detection shows that the two screened nano antibody molecules not only have the binding capacity with DCs of chickens, but also can be bound with DCs of poultry such as ducks, geese and the like, but also are not bound with bone marrow mononuclear cells and chicken (duck, goose) fibroblasts except the DCs, and have better DCs binding specificity. The nanometer antibody molecule is used as a subunit antigen carrier, so that the immune reaction excited by the antigen molecule can be obviously improved, and the antibody level is improved. Therefore, the nano antibody molecules screened by the method can be used as a targeting carrier of the antigen molecules, so that the antigen presentation efficiency is improved, and support is provided for the development of novel poultry vaccines.)
技术领域
本发明属于生物医药
技术领域
，涉及一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子及应用，具体涉及纳米抗体分子的筛选、纳米抗体分子作为抗原载体制备疫苗。背景技术
树突状细胞(Dendritic cell，DC)是哺乳动物先天性免疫系统中的一类抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，主要发挥抗原的捕获、加工、递呈功能。DC一旦被激活就会往淋巴结转移，并与此处的T细胞、B细胞结合，激活适应性免疫系统。同时，DC还可以与自然杀伤细胞，吞噬细胞和肥大细胞等先天免疫系统的细胞相互作用，是连接先天性免疫和适应性免疫的桥梁。DC被认为是能够激活初始和记忆免疫应答最有效的抗原递呈细胞，针对DC来改善疫苗的免疫原性已成为新型疫苗设计的重要策略之一。DC靶向疫苗就是通过识别DC表面特异性受体分子，将抗原、DNA分子或药物直接递送给DC，从而提高抗原递呈效率、快速启动相应的细胞和体液免疫应答。因此，发掘靶向DC的配体分子来提高抗原的免疫原性，在疫苗开发和免疫治疗等方面均有潜在的应用价值。
随着DC生物学研究的不断深入，从外周血和骨髓中分离、培养DC的技术越来越成熟，这为DC靶向疫苗的研发奠定了良好的基础。优秀的疫苗能够同时产生保护性和治疗性的体液、细胞免疫应答，DC能够将靶向疫苗通过MHC限制方式递呈给CD4+和CD8+T淋巴细胞，从而诱导机体同时产生上述两种免疫反应。因此，将抗原蛋白与模式识别受体的配体结合以制备抗原-模式识别受体-配体模式的靶向疫苗，通过靶向DC来激发高效、持久的免疫反应成为新疫苗研发的主要策略之一。将HIV的Gag、Nef和Pol蛋白与抗CD40单克隆抗体融合，使其靶向CD40和树突状细胞的DCIR，该抗原能够特异性诱导CD4+T、CD8+T细胞反应。靶向鼠DC的单链抗体与腺病毒纤突节融合用来替换腺病毒原有纤突节，构建的嵌合病毒能够提高靶向DC的基因转导效率。尽管将抗原直接靶向DC开发疫苗存在诸多优势，但研究者仍面临许多困难和挑战。不同配体所靶向的受体有区别、靶向同一受体的配体，其结合部位、靶向性能、亲和力也存在差异，这就导致所激活的免疫反应强度存在差异。因此，进一步发掘有价值的配体分子，评价配体分子活性化DC的效率，以及配伍使用不同配体分子以诱导强烈和持久的免疫应答具有重要意义。
噬菌体展示文库是将上亿种不同氨基酸组成的多肽或抗体高变区以融合蛋白的形式呈现在噬菌体衣壳蛋白表面。用于构建文库的噬菌体包括丝状噬菌体、T7噬菌体、T4噬菌体、λ噬菌体以及MS噬菌体等，不同噬菌体在展示拷贝数、多肽长度、展示末端以及氨基酸偏好等方面各有差异。目前，以N端展示的丝状噬菌体和C端展示的T7噬菌体应用较为广泛，可以展示随机氨基酸多肽文库也可构建抗体高变区展示文库。通过生物淘选，即噬菌体文库与靶标分子孵育，洗去未与靶标结合的噬菌体，收集、扩增已结合噬菌体用于新一轮淘选，经过反复淘选最终获得与靶标分子特异性结合的噬菌体，测序分析所展示的氨基酸并用于进一步研究。噬菌体展示文库是探索受体与配体之间的相互作用结合位点、发掘高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗和药物研发领域有广泛运用。利用噬菌体展示文库对完整的DC细胞进行配体分子淘选，发掘有价值配体分子为靶向疫苗研发提供技术支持。
公开于该背景知识的信息旨在增加对该发明的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子及应用。
本发明提供一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子，所述纳米抗体分子的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。
MLGDPNSGGQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIAFGRAAVGWYRQAAGNERDMVATMTSGGRTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVENVDRVLTLEPYDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQ(SEQID NO.1)。
MLGDPNSGGQVQLVESGGGLVQEGGSLRLSCVVSGFRDSKYPMTWVRQAPGKGLEWVSTITSGGTTTYADSVKGRFTISRDNAKDTLYLQMNSLKPEDTAIYYCAELGRGSDRWLWAVTVSSEPKTPKPQ(SEQ ID NO.2)。
所述纳米抗体分子采用噬菌体展示文库进行亲和筛选获得，具体地，分离SPF鸡骨髓细胞，诱导分化树突状细胞，构建表面展示羊驼纳米抗体的T7噬菌体文库用于靶向分子的筛选，从T7噬菌体展示文库中筛选到两个高亲和力纳米抗体分子，分别命名为DC54、DC74，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
所述纳米抗体分子不仅能结合鸡树突状细胞，还能结合鸭树突状细胞、鹅树突状细胞，但不结合骨髓单核细胞、外周血淋巴细胞以及鸡、鸭、鹅源的胚成纤维细胞。
本发明的靶向鸡树突状细胞的纳米抗体分子在制备疫苗中的应用。
其中，所述纳米抗体分子作为抗原载体，可有效提高抗原递呈效率，提高抗体水平。所述疫苗为树突状细胞靶向疫苗。
本发明还提供一种树突状细胞靶向亚单位疫苗，由上述靶向树突状细胞的纳米抗体分子与亚单位蛋白融合表达得到。
相较于现有技术，本发明的有效效果是：
1、本发明构建了羊驼纳米抗体T7噬菌体展示文库，针对鸡树突状细胞进行亲和筛选，获得鸡树突状细胞高亲和力结合的纳米抗体分子，为研发树突状细胞靶向疫苗提高物质基础。本发明提供两个纳米抗体分子，不仅能够结合鸡源树突状细胞，同时也能结合鸭、鹅源树突细胞，兼具树突状细胞结合的细胞特异性和不同禽源树突状细胞的物种广谱性。
2、本发明从羊驼纳米抗体T7噬菌体展示文库筛选到的两个纳米抗体分子，相对分子量小、自身免疫原性低，但亲和力高，与树突细胞表面受体结合能力强，并可通过受体介导的内吞作用进入细胞。本发明的纳米抗体分子可与多种药物载体联合使用，达到靶向转运效果。
3、本发明将筛选到的两个纳米抗体分子与亚单位蛋白融合表达，制备鸡树突状细胞靶向亚单位疫苗，加快抗原的加工、递呈效率，提高疫苗免疫的抗体水平，促进机体较早激发免疫反应。
本发明的其它特征和优点将在随后
具体实施方式
部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了羊驼纳米抗体T7噬菌体展示文库构建中VHH基因扩增的相关电泳验证结果。
图2示出了T7噬菌体文库随机克隆序列测定结果。
图3示出了T7噬菌体文库中纳米抗体分子的检测结果。
图4示出了树突状细胞在显微观察下的细胞诱导分化情况。
图5示出了树突状细胞表面标识的流式检测。
图6示出了纳米抗体文库3轮筛选结果。
图7示出了第三轮筛选产物中单克隆噬菌体鉴定结果。
图8示出了纳米抗体分子结合亲和力、特异性检测结果。
图9示出了激光共聚焦检测纳米抗体分子细胞定位。
图10示出了树突状细胞靶向亚单位疫苗抗体水平检测结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1羊驼纳米抗体T7噬菌体展示文库的构建
1、羊驼外周血淋巴细胞的分离与总RNA提取
真空抗凝管采集6只羊驼外周血各5mL，轻轻摇匀，使血液与抗凝剂充分混合。新鲜血液带回实验室按照天津灏洋外周血淋巴细胞分离试剂盒操作说明书进行操作，获得的淋巴细胞用10mL细胞洗涤液洗涤，250×g，离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次，然后将细胞用2mL PBS缓冲液重悬备用。根据索莱宝总RNA提取试剂盒(R1200)操作说明，提取淋巴细胞细胞总RNA。以总RNA为模板，分别以Random 6、Oligo dT(宝生物)两种引物进行反转录成cDNA。反应程序为：40℃40min；70℃15min；12℃终止，-80℃保存备用。
2、总RNA提取及VHH基因扩增
以cDNA为模板，F1、R1为引物(表1)，PCR扩增羊驼重链抗体可变区编码基因，反应程序为：94℃3min；94℃30s；52℃30s；72℃1min，30个循环；72℃10min，切胶回收约700bp片段，如图1的A所示。以回收的片段为模板，再以F2、R2-1和R2-2为引物(表1)，反应程序为：94℃3min；94℃30s；50℃30s；72℃30s，30个循环；72℃10min，PCR扩增约400bp的VHH基因(图1的B)，胶回收目的条带，Nanodrop定量，-80℃保存备用。将回收的VHH基因以3:1摩尔比与pMD18-T simple连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化产物涂布在含有Amp+/IPTG/X-gal LB固体培养基的培养皿，37℃过夜。计算菌落总数和蓝色菌落数，计算质粒文库的容量和重组率。剔除蓝色菌落，收集培养皿中所有菌落，LB液体培养基重悬菌落，提取质粒，EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，回收400bp目的片段(图1的C)。
表1文库构建及鉴定引物
注：K＝G,T；Y＝C,T；N＝A,G,C,T；下划线为限制性酶切位点
3、T7噬菌体展示文库的构建与鉴定
用EcoRⅠ和HindⅢI双酶切处理VHH片段与同酶处理的T7 select EcoRⅠ/HindⅢ载体以摩尔比1:1.5连接，取5μl连接产物与25μl包装蛋白混合，25℃反应2h，反应体系中加入270μl LB液体培养基终止反应，即为拯救的噬菌体文库。取5μl包装产物10倍梯度稀释并与200μl过夜培养的T7噬菌体宿主细菌BLT5403混合，经双层琼脂夹心法测定噬菌体滴度，计算文库容量；挑取单噬斑，PCR检测目的基因插入情况，计算重组率。噬菌体库容量＝噬斑数×稀释倍数×300；重组率＝PCR阳性噬斑数/检测噬斑总数×100％。随机挑选20个噬斑PCR阳性产物进行序列测定，采用DNAStar序列分析软件对测序结果进行比对分析，测序结果如图2所示，随机挑取的噬菌体单克隆均正确插入VHH基因片段。将剩余的295μl包装产物转接100ml对数生长期BLT5403，37℃摇床培养3h至宿主菌完全裂解，PEG-NaCl沉淀法回收噬菌体，双层琼脂夹心法测定文库滴度，Western-blot检测噬菌体表面展示的纳米抗体，如图3所示检测到纳米抗体分子与T7噬菌体衣壳蛋白融合的p10b-VHH蛋白。
实施例2鸡骨髓源树突状细胞的分离培养及鉴定
1、鸡骨髓源细胞的分离培养
15日龄左右的SPF雏鸡注射空气针处死后浸泡在75％的乙醇中10min，无菌条件下取出鸡股骨、胫骨，用含2％双抗的PBS冲洗出骨髓，收集骨髓细胞，PBS缓冲液洗涤2次，每次150×g，离心10分钟，弃上清液。PBS重悬沉淀细胞，然后按照体积比1:1将骨髓细胞缓缓加入含有Histopaque-1119(Sigma)离心管中，150×g，离心30分钟，收集液面分层处的白色细胞层，PBS重悬并洗涤2次，每次150×g，离心10分钟。收集细胞沉淀，用2mL含10％FBS和1％双抗的1640培养液重悬细胞，并进行细胞计数。调整细胞浓度至1×106cells/mL，然后按3mL/孔加入六孔细胞培养板中，每孔添加工作浓度为30ng/mL的rGM-CSF和rIL-4，诱导细胞分化。分别在培养后第3天、第6天半量换液，去除杂细胞和悬浮死细胞，同时补足工作浓度的rGM-CSF和rIL-4，直至培养第8天收获成熟前的树突状细胞。
2、鸡树突状细胞形态观察
细胞培养期间，应用光学显微镜观察细胞诱导分化情况，结果如图4所示。细胞接种到六孔板中，培养2-3小时开始逐渐贴壁，细胞色泽明亮、体积较小。培养24小时后，轻轻晃动细胞板，可见贴壁细胞数量略有增加，细胞集落数量仍较少。培养第3天，轻轻晃动细胞板，去除悬浮细胞，更换培养液，此时贴壁细胞数量进一步增加，细胞集落增多。培养至第6天，细胞集落增多，且呈松散贴壁状态，诱导分化的细胞可以明显的触手，此时为成熟前的树突状细胞，加入LPS刺激可以进一步促进细胞。
3、鸡树突状细胞流式检测
收集培养至第8天的树突状细细胞，150×g，离心10分钟，弃上清液，用PBS重悬细胞并调整浓度至1×106cells/mL。分别加入工作浓度的PE标记的人抗CD11c、FITC标记的鸡抗CD86以及FITC标记的鸡抗MHCⅡ抗体，室温避光孵育30分钟，PBS洗涤3次，每次150×g，离心10分钟，最后用200μl PBS重悬，流式细胞仪加测。从图5可以看出，诱导分化的树突细胞表面CD11c分子表达量为71.26％，MHCⅡ分子的表达量为78.88％，CD86分子的表达量为73.78％，所培养的树突状细胞纯度较高，能够满足纳米抗体文库差减筛选的需求。
实施例3羊驼纳米抗体T7噬菌体展示文库的亲和淘选
1、差减筛选鸡树突状细胞靶向纳米抗体分子
利用实施例1构建的羊驼纳米抗体T7噬菌体展示文库对实施例2中制备鸡树突状细胞进行3轮亲和淘选。将纳米抗体文库调整浓度到1×1011PFU/mL，与2mL含有10％FBS的1640培养液重悬的鸡骨髓细胞(5×105cells/mL)混合，37℃孵育30分钟，150×g离心10分钟，收集上清，标记为Input。用收集的上清重悬实施例2中培养至第8天的鸡树突状细胞(1×106cells)，37℃孵育30分钟。150×g离心10分钟，去除上清，标记为Unbound。含0.05％吐温-20和10％FBS的1640培养液重悬细胞，150×g离心10分钟，去除上清，标记为Wash 1，重复洗涤操作5次。第5次洗涤后，用200μl洗脱液(1％SDS)重悬细胞，彻底释放细胞结合的噬菌体，标记为R1。从洗脱产物中取10μl用于双层琼脂法测定产物滴度，剩余产物接种200mLOD600nm＝1.0的BL5405大肠杆菌宿主，37℃摇床培养直至宿主完全裂解，采用PEG-NaCl方法回收纯化扩增产物，标记为R1A。按照上述筛选流程，用第一轮筛洗脱液的扩增产物进行第2轮筛选、第2轮洗脱液的扩增产物进行第3轮筛选。图6可以看出，每轮筛选漂洗掉未结合以及低亲和力结合的噬菌体，洗脱产物中高亲和力结合的噬菌体随着筛选次数的增加而增加，通过亲和筛选跟鸡树突细胞结合的噬菌体不断富集，提高了从第3轮洗脱液中分选单克隆噬菌体的效率。
2、筛选产物中单克隆噬菌体鉴定
从第3轮筛选产物中挑选200个噬菌体单克隆进行VHH纳米抗体基因序列分析，统计并合并重复序列。从中挑选50个重复出现噬菌体克隆进行单克隆培养，并调整噬菌体浓度到1×1010PFU/mL。在96孔板中分别接入1×105cells骨髓细胞(Bone marrow cell)、树突状细胞(Dendritic cell)，另设培养液(Serum)对照孔。分别接入调整滴度后的单克隆噬菌体100μl，每个噬菌体单克隆接3个孔重复，在37℃温箱孵育30分钟，150×g离心细胞板10分钟，小心去除每个孔中的上清液。含0.05％吐温-20和10％FBS的1640培养液200μl/孔重复洗涤5次，去除上清液，50μl/孔加入1％SDS洗脱液，回收每个孔中的噬菌体，双层琼脂夹心法测定回收液中噬菌体滴度。根据公式回收率＝回收噬菌体(PFU)/投入噬菌体(PFU)×％，计算不同噬菌体单克隆与树突状细胞结合的亲和力及特异性。如图7所示，噬菌体单克隆16、54、74号与树突状细胞具有较高的亲和力，而不跟骨髓细胞以及细胞培养体系中的血清或细胞板结合，具体较好的特异性。挑选54、74号噬菌体单克隆，采用上述检测方法，分别比较所选噬菌体单克隆与鸡骨髓细胞(C.BMC)、鸡树突状细胞(C、DC)、鸡胚层纤维细胞(CEF)、鸭骨髓细胞(D.BMC)、鸭树突状细胞(D、DC)、鸭胚层纤维细胞(DEF)、鹅骨髓细胞(G.BMC)、鹅树突状细胞(G、DC)、鹅胚层纤维细胞(GEF)结合能力。从图8可以看出，54、74号噬菌体单克隆能够特异性结合鸡、鸭、鹅树突状细胞，而不结合骨髓细胞、层纤维细胞。
3、纳米抗体分子在树突状细胞上的定位
将无菌爬片置于24孔板中，每孔加入200μl多聚赖氨酸(0.03mg/mL)，室温作用30分钟，甩去溶液，用PBS洗涤两次。每孔加入1×106cells(鸡树突状细胞)培养至第6天，继续培养36小时。每孔接种1×1010PFU噬菌体单克隆(54、74号)，并设置T7-wt空白对照，37℃孵育30分钟，含0.05％吐温-20和10％FBS的1640培养液洗涤5次。每孔加入100μl 1％多聚甲醛固定液，室温作用15分钟，PBS洗涤一次。然后每孔加入100μl0.2％Trition-100对细胞膜进行透化，PBS洗涤一次。加入工作浓度的DyLight标记T7 tag单抗(Abcam)和Phalloidin-iFluor 594Conjugate(Absin)染料，37℃避光孵育30分钟，PBST洗涤爬片4次。在爬片上滴加抗荧光淬灭封片剂(含DAPI)，盖上盖玻片，通过激光共聚焦显微镜观察筛选到的靶向噬菌体在树突状细胞中的定位。从图9可以看出，树突状细胞表面及胞质内有大量的绿色荧光信号点，而对照的野生T7噬菌体与细胞不结合，说明筛选到的54、74号噬菌体表面所展示的纳米抗体分子能够高效的结合树突状细胞，并且介导噬菌体进入细胞。
实施例4靶向树突状细胞亚单位疫苗效率评价
以T7-wt和54、74号T7噬菌体为模板，PCR扩增出p10B、p10B-VHH融合基因，分别插入pET-28a表达载体，诱导表达p10B、p10B-VHH54、p10B-VHH74三个亚单位蛋白。调整三个蛋白至同一浓度，并与ISA206佐剂混合，制备亚单位疫苗，抗原含量50μg/0.1mL。分组免疫20日龄SPF鸡，免疫2周后开始采血分离血清。包被p10B蛋白，建立间接ELISA方法，检测免疫鸡抗p10B抗体水平。从图10抗体水平监测结果可以看出，融合鸡树突状细胞靶向纳米抗体分子的融合蛋白组比单纯p10B组，能更早地激发抗体水平的产生，且抗体水平滴度明显增高。结果表明靶向鸡树突状细胞的纳米抗体分能够促进亚单位蛋白的抗原递呈，促进机体更快更好的产生免疫应答。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 江苏农牧科技职业学院
<120> 一种靶向树突状细胞的纳米抗体分子及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
20 25 30
Ala Ser Gly Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala Val Gly Trp Tyr Arg Gln
35 40 45
Ala Ala Gly Asn Glu Arg Asp Met Val Ala Thr Met Thr Ser Gly Gly
50 55 60
Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
85 90 95
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Glu Asn Val Asp Arg Val
100 105 110
Leu Thr Leu Glu Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln
130 135
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Leu Gly Asp Pro Asn Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val
20 25 30
Val Ser Gly Phe Arg Asp Ser Lys Tyr Pro Met Thr Trp Val Arg Gln
35 40 45
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Thr Ser Gly Gly
50 55 60
Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80
Asp Asn Ala Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
85 90 95
Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Glu Leu Gly Arg Gly Ser Asp
100 105 110
Arg Trp Leu Trp Ala Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys
115 120 125
Pro Gln
130
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgggtggtc ctggctgctc tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggtacgtg tgttgaactg tt 22
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattcgggt ggtcagktgc agcycgtgga gnc 33
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagcttttat tgtggttttg gtgtcttggg 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagcttttag gggtcttcgc tgtggtgcg 29
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