一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法
阅读说明：本技术 一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法 (Method for preparing hickory protein by using hickory cake meal ) 是由 何志平 吴峰华 刘兴泉 郭宜 何浙华 余琳 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法,包括山核桃饼粕预处理、酶辅助碱提取、糖化酶酶解纯化、乙醇水溶液洗脱除杂、蛋白质喷雾干燥。本发明利用物理方法对山核桃饼粕进行脱皮、脱壳,操作简单快捷,绿色环保,同时减少了山核桃饼粕蛋白损失。本发明利用酶辅助碱提取山核桃蛋白,不但可以提高碱提液中蛋白质的提取率还可以同时分离山核桃饼粕中残存的油脂。本发明利用糖化酶酶解结合乙醇溶液洗脱工艺纯化提取的山核桃蛋白,步骤简单,纯化周期短,成本低。本发明利用喷雾干燥方法将所得蛋白质进行干燥处理,延长蛋白产品的保存期,且与冷冻干燥相比干燥速率快,更适合工业化生产。(The invention discloses a method for preparing hickory protein by using hickory cake, which comprises the steps of hickory cake pretreatment, enzyme-assisted alkali extraction, saccharification enzyme enzymolysis purification, ethanol aqueous solution elution and impurity removal, and protein spray drying. The method for peeling the pecan cakes utilizes a physical method to peel and unshelling, is simple and rapid to operate, is green and environment-friendly, and reduces the protein loss of the pecan cakes. The method utilizes enzyme-assisted alkali to extract the hickory protein, can improve the extraction rate of the protein in the alkali extract and can separate the residual oil in the hickory cake pulp. The invention utilizes the saccharification enzymatic hydrolysis and ethanol solution elution processes to purify the extracted hickory nut protein, and has simple steps, short purification period and low cost. The invention utilizes the spray drying method to dry the obtained protein, prolongs the storage life of the protein product, has higher drying rate compared with freeze drying, and is more suitable for industrial production.)
技术领域
本发明涉及农副产品加工技术领域，具体涉及一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法。
背景技术
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是胡桃科、山核桃属植物，分布于中国浙江和安徽，主产区在浙皖边界的天目山周边地区。山核桃中山核桃仁为可食部分，其营养价值相对更加丰富，且油脂含量最高，占核桃仁干质量的65.8％-74.1％，蛋白质含量为7.8～9.6％，此外还含有丰富的矿物质元素和维生素。
因山核桃是优质的油料作物，所以目前人们对山核桃深加工的利用仍集中在山核桃油上，目前市面上山核桃油的制备方式多为压榨法，因此在生产山核桃油的同时也产生了大量的山核桃饼粕副产物。而山核桃饼粕中仍含有大量的有机质，若不妥善处置将造成环境污染。目前对于山核桃饼粕的利用多为直接作饲料或肥料使用，但因在榨油前对山核桃脱壳不彻底，造成山核桃饼粕中残存大量山核桃果壳，这也增加了山核桃饼粕利用的困难性。而实际上山核桃饼粕中含有大量的优质蛋白质，如何能够更加高效地利用山核桃饼粕中的蛋白质是目前山核桃产业链中亟待解决的问题之一。
专利CN 104818312 A公开了一种核桃活性多肽提取物的制备方法，其步骤为核桃仁经碱液浸泡去皮后粉碎，利用碱提酸沉法制备核桃蛋白，随后将蛋白质加入蛋白酶酶解，酶解液利用凝胶层析分离，冻干分子量在3000-1000Da的作为多肽粉。此方法在给核桃仁脱皮的步骤中需要用到大量碱液，同时需要长时间浸泡，不但会产生大量的碱废液同时可能造成核桃蛋白资源的流失。
专利CN 110643661 A公开了一种从核桃中快速分离纯化核桃蛋白的方法，步骤为核桃原料利用球磨粉碎至颗粒，得到核桃粉末，采用石油醚脱脂，并挥干有机溶剂；采用醇类溶液作为提取溶剂，并加入蛋白水解酶酶解；旋蒸除去醇类溶剂，接着采用超临界流体萃取核桃中蛋白质，使用大孔树脂对萃取液进行吸附；采用不同浓度的醇溶液对吸附在大孔树脂上的滤液进行洗脱，得到洗脱液，合并洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥获得核桃蛋白固体。此方法利用石油醚对核桃粉进行脱脂，易造成有机溶剂的残留，不利于人体健康，且采用的超临界流体萃取技术与大孔树脂吸附技术虽能得到纯度更高的蛋白，但生产工艺较为复杂，制备成本高。
专利CN 106632583 A公布了一种从核桃粕中提取核桃粗蛋白的方法，其步骤为取核桃粕用乙醇浸泡脱去油脂，过滤，得脱脂核桃粕；将脱脂核桃粕干燥、粉碎，得核桃粕粉碎料；将核桃粕粉碎料与氢氧化钠水溶液混合浸提，得核桃粕浸提液；将核桃粕浸提液离心分离，取上层上清液，备用；将上清液用酸碱剂调节pH，静置，然后离心分离上清液，取下层沉淀，即得所述粗蛋白。此方法利用乙醇浸泡脱除饼粕残余油脂会造成核桃饼粕中，核桃醇溶蛋白的损失，并且未将所得蛋白进行干燥处理，大大减小了蛋白产品的保存时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法，包括如下步骤：
步骤一、山核桃饼粕预处理
将山核桃饼粕烘干，利用粉碎机将烘干的山核桃饼粕以30000～35000r/min粉碎4～7s，粉碎物料过40～60目筛，弃去筛下物，将筛上物以30000～35000r/min粉碎35～40s，将粉末过80～100目筛，弃去筛上物，筛下物作为制备山核桃蛋白的原料；
步骤二、酶辅助碱提取
将步骤一得到的山核桃蛋白原料按照料液比1g:15ml～1g:25ml的比例加水，调节溶液pH至10.0～10.5，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照1000～1500U/g的量添加碱性蛋白酶，在55～60℃条件下恒温搅拌提取1～6h，其中，在0.5～1h时再次调节溶液pH至10.0～10.5，提取完成后离心，弃去上层乳化层，收集中间水层；将下层沉淀残渣收集起来，以山核桃蛋白原料质量为基准，再次按照料液比1g:15ml～1g:25ml的比例向沉淀残渣中加水，调节溶液pH至10.0～10.5，在55～60℃条件下恒温搅拌洗渣15～30min，洗渣完成后离心，弃去上层乳化层和下层沉淀，收集中间水层；将第一次与第二次离心得到的中间水层合并，得到山核桃蛋白提取液；
步骤三、糖化酶酶解纯化
将步骤二得到的山核桃蛋白提取液pH调节至4.0～4.5，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照100～130U/g的量向山核桃蛋白提取液中添加糖化酶，在55～65℃条件下恒温搅拌酶解2～6h，酶解完成后，灭酶，冷却至室温后调节酶解液pH至3.5～4.0，静置60～120min后离心，弃去上清液，收集沉淀，得到山核桃提取蛋白粗提物；
步骤四、乙醇水溶液洗脱除杂
以山核桃蛋白原料质量为基准，按照料液比为1g:12ml～1g:15ml的比例向步骤三得到的山核桃提取蛋白粗提物中加入75％～85％v/v的乙醇水溶液，在50～60℃条件下恒温搅拌洗脱45～90min，洗脱完成后离心，弃去上清液，收集下层沉淀，加入5～8倍体积的水将沉淀复溶，调节溶液pH至7.0，得到山核桃蛋白溶液；
步骤五、蛋白质喷雾干燥
将步骤四得到的山核桃蛋白溶液喷雾干燥，得到山核桃蛋白粉即为所述山核桃蛋白。
进一步地，步骤一将山核桃饼粕在40～50℃烘箱中烘12～24h。
进一步地，步骤二利用35％～45％w/v氢氧化钠溶液调节pH，步骤三利用8％～12％v/v盐酸溶液调节pH，步骤四利用35％～45％w/v氢氧化钠溶液调节pH。
进一步地，步骤二提取完成后在3800～4000r/min条件下离心15～20min，洗渣完成后在3800～4000r/min条件下离心15～20min；步骤三静置60～120min后，以1500～2000r/min条件离心5～10min；步骤四洗脱完成后以1500～2000r/min条件离心5～10min。
进一步地，步骤三85～90℃灭酶10～15min。
进一步地，步骤五将喷雾干燥机进口温度调至150～180℃，蠕动泵转速调至2～5r/min，在此条件下将步骤四得到的山核桃蛋白溶液喷雾干燥。
上述制备的山核桃蛋白在作为制备活性肽原料中的应用。
上述制备的山核桃蛋白在作为食品加工用植物蛋白添加剂中的应用。
上述制备的山核桃蛋白在作为功能性食品配料中的应用。
上述制备的山核桃蛋白在作为畜牧业蛋白补充饲料中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明利用物理过筛的方法除去山核桃饼粕中的果皮与残留的果壳，解决了碱液浸泡脱皮法在浸泡过程中山核桃饼粕蛋白的损失问题，以及浸泡后产生的大量碱性废液对环境的污染问题，且节约了原料预处理的时间，操作简单快捷，绿色环保。
2、本发明利用碱性蛋白酶辅助碱提取山核桃蛋白，碱性蛋白酶可以将不溶的山核桃蛋白酶解为可溶性肽段，增加山核桃蛋白的提取率，同时碱性蛋白酶可以酶解山核桃蛋白中存在的脂蛋白复合体，可在一定程度上降低提取蛋白的脂肪含量，使提取的山核桃蛋白粗脂肪含量小于5％，低于一般同类产品8％～10％的粗脂肪含量。因此，利用碱性蛋白酶辅助碱提取山核桃蛋白，不但可以提高碱提液中蛋白质的提取率还可以同时分离山核桃饼粕中残存的油脂，解决了利用有机溶剂萃取山核桃饼粕残油带来的溶剂残留问题以及山核桃饼粕蛋白的损失问题。
3、本发明通过糖化酶纯化步骤，可将提取的山核桃蛋白中的不溶性淀粉水解成可溶性糖，使之溶解在水中进而除去，以此达到纯化的效果；乙醇水溶液洗脱步骤可将提取的山核桃蛋白中的色素、酚类聚合物以及可溶性糖溶解在乙醇溶液中，进而达到纯化的效果，最终得到纯度50％以上颜色为浅棕色的山核桃蛋白(以GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定，以干基计、蛋白质折算系数6.25)，且符合GB 20371-2016食品加工用植物蛋白中对植物水解蛋白的纯度要求。本发明利用糖化酶酶解结合乙醇水溶液洗脱工艺纯化提取的山核桃蛋白，与现有技术相比工艺步骤简单，纯化周期短、成本低，可以快速、节能地纯化提取的山核桃蛋白。
4、本发明利用喷雾干燥方法将所得蛋白质进行干燥处理，延长蛋白产品的保存期，且与冷冻干燥相比干燥速率快，更适合工业化生产。
5、本发明通过对酶辅助碱提取步骤中第一次离心操作后得到的沉淀残渣进一步进行清洗，可让离心过程中残存在沉淀残渣中的蛋白溶解在水中，进而降低离心过程中蛋白提取液的损失，提高本发明对山核桃蛋白原料中蛋白质的利用率。
附图说明
图1为本发明方法流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
一种利用山核桃饼粕制备山核桃蛋白的方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、山核桃饼粕预处理
将山核桃饼粕在40～50℃烘箱中烘12～24h，利用粉碎机将烘干的山核桃饼粕以30000～35000r/min粉碎4～7s，粉碎物料过40～60目筛，弃去筛下物(主要为山核桃仁的果肉上覆盖的一层红褐色的薄皮)，将筛上物以30000～35000r/min粉碎35～40s，将粉末过80～100目筛，弃去筛上物(主要为山核桃木质果壳)，筛下物作为制备山核桃蛋白的原料；
步骤二、酶辅助碱提取
将步骤一得到的山核桃蛋白原料按照料液比1g:15ml～1g:25ml的比例加水，利用35％～45％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0～10.5，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照1000～1500U/g的量添加碱性蛋白酶，在55～60℃、400～600r/min条件下恒温搅拌提取1～6h，其中，在0.5～1h时再次利用35％～45％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0～10.5，提取完成后在3800～4000r/min条件下离心15～20min，弃去上层乳化层，收集中间水层；将下层沉淀残渣收集起来，以山核桃蛋白原料质量为基准，再次按照料液比1g:15ml～1g:25ml的比例向沉淀残渣中加水，利用35％～45％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0～10.5，在55～60℃、400～600r/min条件下恒温搅拌洗渣15～30min，洗渣完成后在3800～4000r/min条件下离心15～20min，弃去上层乳化层和下层沉淀，收集中间水层；将第一次与第二次离心得到的中间水层合并，得到山核桃蛋白提取液；
步骤三、糖化酶酶解纯化
将步骤二得到的山核桃蛋白提取液利用8％～12％v/v盐酸溶液调节pH至4.0～4.5，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照100～130U/g的量向山核桃蛋白提取液中添加糖化酶，在55～65℃、400～600r/min条件下恒温搅拌酶解2～6h，酶解完成后，85～90℃灭酶10～15min，冷却至室温后利用8％～12％v/v盐酸溶液调节酶解液pH至3.5～4.0，静置60～120min后以1500～2000r/min条件离心5～10min，弃去上清液，收集沉淀，得到山核桃提取蛋白粗提物；
步骤四、乙醇水溶液洗脱除杂
以山核桃蛋白原料质量为基准，按照料液比为1g:12ml～1g:15ml的比例向步骤三得到的山核桃提取蛋白粗提物中加入75％～85％v/v的乙醇水溶液，在50～60℃、400～600r/min条件下恒温搅拌洗脱45～90min，洗脱完成后以1500～2000r/min条件离心5～10min，弃去上清液，收集下层沉淀，加入5～8倍体积的水将沉淀复溶，利用35％～45％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，得到山核桃蛋白溶液；
步骤五、蛋白质喷雾干燥
步骤五将喷雾干燥机进口温度调至150～180℃，蠕动泵转速调至2～5r/min，在此条件下将步骤四得到的山核桃蛋白溶液喷雾干燥，得到山核桃蛋白粉即为所述山核桃蛋白。
上述制备的山核桃蛋白可作为活性肽原料，或者作为食品加工用植物蛋白添加剂，或者作为功能性食品配料，或者作为畜牧业蛋白补充饲料。
以下实施例涉及的山核桃饼粕由如下步骤制备得到：山核桃脱壳后，利用常温压榨的方式除去油脂，压榨后的山核桃饼粕中残留部分果壳，饼粕残油量在34％左右(以GB5009.6-2016中索氏抽提法测定)，粗蛋白含量为14％左右(以GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定、结果以干基计、氮折算系数为6.25)，水分含量5wt％左右(以GB 5009.3-2016中直接干燥法测定)。
实施例1
1、将山核桃饼粕在45℃烘箱中烘24h，利用摇摆式多功能粉碎机(铂欧五金厂，400Y)将烘干的山核桃饼粕以32000r/min粉碎5s，粉碎物料过40目筛，弃去筛下物，将筛上物以32000r/min粉碎35s，将粉末过80目筛，弃去筛上物，筛下物作为制备山核桃蛋白的原料。
2、将步骤1得到的山核桃蛋白原料按照料液比1g:16ml的比例加水，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照1000U/g的量添加碱性蛋白酶(Solarbio，B8360)，在60℃、500r/min条件下恒温搅拌提取1.5h，其中，在0.5h时再次利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0，提取完成后在3800r/min条件下离心15min，弃去上层乳化层，收集中间水层；将下层沉淀残渣收集起来，以山核桃蛋白原料质量为基准，再次按照料液比1g:16ml的比例向沉淀残渣中加水，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.0，在60℃、500r/min条件下恒温搅拌洗渣30min，洗渣完成后在3800r/min条件下离心15min，弃去上层乳化层和下层沉淀，收集中间水层；将第一次与第二次离心得到的中间水层合并，得到山核桃蛋白提取液，此时提取液中对山核桃蛋白原料的提取率达89.7％(以GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定，氮折算系数为6.25)。同时做对照组，将步骤2中碱性蛋白酶添加量改为0U/g，其余操作相同，此时提取液中对山核桃蛋白原料的提取率为59.0％(以GB5009.5-2016中凯氏定氮法测定，氮折算系数为6.25)。将本实施例步骤2得到的山核桃蛋白提取液与对照组得到的山核桃蛋白提取液分别浓缩至原体积的1/5后，按照步骤5所示条件喷雾干燥后，测定所得粉体粗脂肪含量(以GB5009.6-2016中索氏抽提法测定)，其中由本实施例步骤2提取液得到的粉体粗脂肪含量为4.9％，对照组提取液得到的粉体粗脂肪含量为26.8％，由此可判断碱性蛋白酶辅助碱提取比一般碱提效果好，并且能够在一定程度上降低提取蛋白的脂肪含量。
3、将步骤2得到的山核桃蛋白提取液用10％v/v盐酸溶液调节pH调至4.0，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照100U/g的量向山核桃蛋白提取液中添加糖化酶(Solarbio，T8500)，在60℃、500r/min条件下恒温搅拌酶解2.5h，酶解完成后，90℃灭酶15min，冷却至室温后用10％v/v盐酸溶液调节酶解液pH至3.7，静置60min后以2000r/min条件离心5min，弃去上清液，收集沉淀，得到山核桃提取蛋白粗提物。
4、以山核桃蛋白原料质量为基准，按照料液比为1g:12ml的比例向步骤3得到的山核桃提取蛋白粗提物中加入80％v/v的乙醇水溶液，在50℃、500r/min条件下恒温搅拌洗脱45min，洗脱完成后以2000r/min条件离心5min，弃去上清液，收集下层沉淀，加入5倍体积的水将沉淀复溶，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，得到山核桃蛋白溶液。
5、将喷雾干燥机进口温度调至150℃，蠕动泵转速调至2r/min，在此条件下将步骤4得到的山核桃蛋白溶液喷雾干燥，最终得到的山核桃蛋白粉中粗蛋白含量为53.8％(以GB5009.5-2016中凯氏定氮法测定、结果以干基计、氮折算系数为6.25)，水分含量为9.5wt％(以GB 5009.3-2016中直接干燥法测定)，粗脂肪含量为4.6％(以GB 5009.6-2016中索氏抽提法测定)，灰分含量为1.0％(以GB 5009.4-2016直接灼烧法测定)，对山核桃蛋白原料中蛋白质利用率为66.4％。同时做对照组，将本实施例步骤2得到的山核桃蛋白提取液用10％v/v盐酸溶液调节pH至3.7，静置60min后以2000r/min条件离心5min，弃去上清液收集下层沉淀，加入5倍体积的水将沉淀复溶，用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，得到未经纯化的山核桃蛋白液，而后按照步骤5所给条件喷雾干燥得到未经纯化的山核桃蛋白粉，未经纯化的山核桃蛋白粉粗蛋白含量仅为35.2％(以GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定、结果以干基计、氮折算系数为6.25)，由此可判断糖化酶结合乙醇水溶液洗脱纯化的方法有一定纯化效果。
实施例2
1、将山核桃饼粕在50℃烘箱中烘12h，利用摇摆式多功能粉碎机(铂欧五金厂，400Y)将烘干的山核桃饼粕以32000r/min粉碎7s，粉碎物料过60目筛，弃去筛下物，将筛上物以32000r/min粉碎40s，将粉末过100目筛，弃去筛上物，筛下物作为制备山核桃蛋白的原料。
2、将步骤1得到的山核桃蛋白原料按照料液比1g:18ml的比例加水，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.3，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照1100U/g的量添加碱性蛋白酶(Solarbio，B8360)，在58℃、500r/min条件下恒温搅拌提取2.5h，其中，在1h时再次利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.3，提取完成后在4000r/min条件下离心16min，弃去上层乳化层，收集中间水层；将下层沉淀残渣收集起来，以山核桃蛋白原料质量为基准，再次按照料液比1g:18ml的比例向沉淀残渣中加水，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.3，在58℃、500r/min条件下恒温搅拌洗渣20min，洗渣完成后在4000r/min条件下离心16min，弃去上层乳化层和下层沉淀，收集中间水层；将第一次与第二次离心得到的中间水层合并，得到山核桃蛋白提取液，此时提取液中对山核桃蛋白原料的提取率达89.1％(以GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定、氮折算系数为6.25)。
3、将步骤2得到的山核桃蛋白提取液用10％v/v盐酸溶液调节pH调至4.5，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照130U/g的量向山核桃蛋白提取液中添加糖化酶(Solarbio，T8500)，在58℃、500r/min条件下恒温搅拌酶解3h，酶解完成后，85℃灭酶13min，冷却至室温后用10％v/v盐酸溶液调节酶解液pH至4.0，静置120min后以1800r/min条件离心8min，弃去上清液，收集沉淀，得到山核桃提取蛋白粗提物。
4、以山核桃蛋白原料质量为基准，按照料液比为1g:15ml的比例向步骤3得到的山核桃提取蛋白粗提物中加入75％v/v的乙醇水溶液，在60℃、500r/min条件下恒温搅拌洗脱90min，洗脱完成后以1800r/min条件离心8min，弃去上清液，收集下层沉淀，加入6倍体积的水将沉淀复溶，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，得到山核桃蛋白溶液。
5、将喷雾干燥机进口温度调至180℃，蠕动泵转速调至3r/min，在此条件下将步骤4得到的山核桃蛋白溶液喷雾干燥，最终得到的山核桃蛋白粉中粗蛋白含量为52.9％(以GB5009.5-2016中凯氏定氮法测定、结果以干基计、氮折算系数为6.25)，水分含量为7.2wt％(以GB 5009.3-2016中直接干燥法测定)，粗脂肪含量为4.3％(以GB 5009.6-2016中索氏抽提法测定)，灰分含量为1.6％(以GB 5009.4-2016直接灼烧法测定)，对山核桃蛋白原料中蛋白质利用率为66.1％。
实施例3
1、将山核桃饼粕在40℃烘箱中烘24h，利用摇摆式多功能粉碎机(铂欧五金厂，400Y)将烘干的山核桃饼粕以32000r/min粉碎4s，粉碎物料过40目筛，弃去筛下物，将筛上物以32000r/min粉碎38s，将粉末过80目筛，弃去筛上物，筛下物作为制备山核桃蛋白的原料。
2、将步骤1得到的山核桃蛋白原料按照料液比1g:17ml的比例加水，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.1，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照1500U/g的量添加碱性蛋白酶(Solarbio，B8360)，在57℃、500r/min条件下恒温搅拌提取2h，其中，在0.8h时再次利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.1，提取完成后在3900r/min条件下离心17min，弃去上层乳化层，收集中间水层；将下层沉淀残渣收集起来，以山核桃蛋白原料质量为基准，再次按照料液比1g:17ml的比例向沉淀残渣中加水，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至10.1，在57℃、500r/min条件下恒温搅拌洗渣25min，洗渣完成后在3900r/min条件下离心17min，弃去上层乳化层和下层沉淀，收集中间水层；将第一次与第二次离心得到的中间水层合并，得到山核桃蛋白提取液，此时提取液中对山核桃蛋白的提取率达89.5％(以GB 5009.5-2016中凯氏定氮法测定、氮折算系数为6.25)。
3、将步骤2得到的山核桃蛋白提取液用10％v/v盐酸溶液调节pH调至4.2，以山核桃蛋白原料质量为基准，按照110U/g的量向山核桃蛋白提取液中添加糖化酶(Solarbio，T8500)，在62℃、500r/min条件下恒温搅拌酶解2.7h，酶解完成后，88℃灭酶14min，冷却至室温后用10％v/v盐酸溶液调节酶解液pH至3.5，静置100min后以1900r/min条件离心7min，弃去上清液，收集沉淀，得到山核桃提取蛋白粗提物。
4、以山核桃蛋白原料质量为基准，按照料液比为1g:13ml的比例向步骤3得到的山核桃提取蛋白粗提物中加入85％v/v的乙醇水溶液，在55℃、500r/min条件下恒温搅拌洗脱60min，洗脱完成后以1900r/min条件离心7min，弃去上清液，收集下层沉淀，加入7倍体积的水将沉淀复溶，利用40％w/v氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，得到山核桃蛋白溶液。
5、将喷雾干燥机进口温度调至160℃，蠕动泵转速调至3r/min，在此条件下将步骤4得到的山核桃蛋白溶液喷雾干燥，最终得到的山核桃蛋白粉中粗蛋白含量为52.5％(以GB5009.5-2016中凯氏定氮法测定、结果以干基计、氮折算系数为6.25)，水分含量为8.5wt％(以GB 5009.3-2016中直接干燥法测定)，粗脂肪含量为4.0％(以GB 5009.6-2016中索氏抽提法测定)，灰分含量为1.3％(以GB 5009.4-2016直接灼烧法测定)，对山核桃蛋白原料中蛋白质利用率为65.8％。
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