网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪
阅读说明：本技术 网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪 (Reticulocyte detection dye, detection reagent, preparation method of detection reagent, detection method of sample analyzer and sample analyzer ) 是由 周贤波 吕碧玉 郑剑通 吴忠芬 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪,提供的核酸染料可用于血液分析仪,以满足对网织红细胞计数准确和快速的检测要求。网织红细胞计数通过试剂处理,增加特异性的网织红细胞核酸染料以及网织红细胞细胞膜的处理试剂,采用核酸荧光染色及半导体激光流式细胞术在RET通道这单一通道中即可准确计数网织红细胞。即通过稀释液处理网织红细胞形态,将其球形化的同时,改变各类型细胞膜形态,便于网织红细胞的核酸与染料特异性地结合,从而实现网织红细胞的计数。(The invention provides a reticulocyte detection dye, a detection reagent, a preparation method of the detection reagent, a detection method of a sample analyzer and the sample analyzer. Reticulocyte counting is performed by reagent treatment, specific reticulocyte nucleic acid dye and a reagent for treating reticulocyte cell membranes are added, and reticulocytes can be accurately counted in a single channel of an RET channel by adopting nucleic acid fluorescent staining and semiconductor laser flow cytometry. That is, the reticulocyte morphology is treated with a diluent to change the cell membrane morphology of each type while spheroidizing the reticulocyte morphology, so that the nucleic acid of the reticulocyte is specifically combined with the dye, and the counting of the reticulocyte is realized.)
技术领域
本发明涉及血细胞分析
技术领域
，特别涉及一种网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪试剂。背景技术
网织红细胞计数(尤其是网织红细胞绝对值)是反映骨髓造血功能的重要指标。目前检测方法主要有手工法和流式细胞法。
手工法：用煌焦油蓝等活体染色方法显示红细胞内网状结构，并在显微镜下计数1000个红细胞中所占的网织红细胞数，以百分比或分数表示。这种方法虽然取血量少但是染色时混合血液中的水分容易蒸发，造成染色时间偏短，结果偏低且受主观因素影响较多，耗时费力。
流式细胞法：用荧光染料使含RNA的网织红细胞着色，用流式细胞仪（FCM）计数并计算出网织红细胞的百分比。流式细胞仪溶液管路设计复杂，成本高，需要重复使用，易造成样本之间交叉污染。常用的荧光染料噻唑橙，该染料常温需孵育30-60分钟，且需要机外人对样本进行预处理。因此无法满足自动化测试要求。
血液分析仪，采用流式细胞法也可对Ret作分类计数，并提供与网织红细胞相关的多个参数。因此需要开发新的核酸染料用于血液分析仪，以满足对网织红细胞计数准确和快速的检测要求。
发明内容
本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供一种可用于样本分析仪，以满足对网织红细胞计数准确和快速的检测要求的网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪试剂。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种网织红细胞检测染料，包括荧光染料和醇，所述荧光染料为聚次甲基染料，其结构通式如下式I所示，
式I：
其中，Y-为PF6 -、HSO3 -、X-（X为卤素）、BF4 -或CF3SO3 -；Z为、或；R1、R2和R3为不小于2个碳的烷基、酯基或醚基，R4为不小于2个碳的烷基。
所述醇为异丙醇和乙二醇中的至少一种。
所述R1为CH3CH2-或CH3CH2CH2-。
所述R2为CH3COOCH2CH2CH2-。
所述R3为C6H5OCH2-、C6HSOCH2CH2-或CH3OCH2CH2-。
优选地，所述荧光染料具有如下式II或式III所示的结构，式II；
式III。
本发明还公开了一种网织红细胞检测试剂，包括PH值为8~10的稀释液和如上所述的网织红细胞检测染料，所述稀释液包含用于保持所述PH值的缓冲体系、无机盐、表面活性剂和防腐剂。
所述缓冲体系为磷酸盐缓冲体系、氯化铵缓冲体系和氨基乙酸缓冲体系中的一种或多种。
所述无机盐为硫酸钠、氧化钠和氯化钾中的一种或多种。
所述表面活性剂为非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阳性表面活性剂和阴性表面活性剂中的至少一种。
所述表面活性剂为甜菜碱类、铵盐类、吡盐类和聚氧乙烯类中的一种或多种。
所述防腐剂为叠氮化钠、苯甲酸及其盐和异噻唑啉酮中的一种或多种。
本发明还公开了一种网织红细胞检测试剂的制备方法，所述方法包括：将如上所述的检测染料和所述稀释液按一定比例配置成预设容量后，在常温下搅拌均匀，使用0.22um滤膜进行过滤，过滤后的滤液对试样进行检测。
本发明还公开了一种样本分析仪检测方法，所述方法包括以下步骤：采用如上所述的网织红细胞检测试剂，用所述检测试剂处理试样，检测试剂将试样中的网织红细胞球形化，使得网织红细胞的核酸与所述荧光染料特异性地结合，实现网织红细胞的计数。
本发明还公开了一种采用所述样本分析仪检测方法的样本分析仪，所述样本分析仪包括：
样本制备部件，所述样本制备部件将所述检测染料和所述稀释液混制成测定试样；
光源，所述光源用光照射所述样本制备部件制备的所述测定试样；
受光部件，所述受光部件接受所述光源照射所述测定试样时所述测定试样中的细胞产生的荧光和散射光，并输出所接受的荧光的相关荧光信号和所接受的散射光的相关散射光信号；
细胞分析部件，所述细胞分析部件根据所述受光部件输出的荧光信号和散射光信号，将显示出一定范围的荧光强度和散射光强度的细胞作为网织红细胞检测出来；
输出部件，所述输出部件根据所述细胞分析部件的检测结果进行输出。
本发明还公开了一种如上所述的网织红细胞检测染料或所述的网织红细胞检测试剂在对生物样品进行染色中的应用。
综上所述，本发明提供了一种网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪试剂，提供的核酸染料可用于样本分析仪，以满足对网织红细胞计数准确和快速的检测要求。网织红细胞计数通过试剂处理，增加特异性的网织红细胞核酸染料以及网织红细胞细胞膜的处理试剂，采用核酸荧光染色及半导体激光流式细胞术在RET通道这单一通道中即可准确计数网织红细胞。即通过稀释液处理网织红细胞形态，将其球形化的同时，改变各类型细胞膜形态，便于网织红细胞的核酸与染料特异性地结合，从而实现网织红细胞的计数。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
血液中网织红细胞的检测在检验医学领域具有重要意义，本发明提供一种可快速准确地测定血液中网织红细胞的检测染料，可以应用于基于流式技术的血液分析仪器，对血液中的网织红细胞快速标记。
本发明还提供一种网织红细胞检测试剂，该检测试剂主要含有两种功能试剂组分，一种为标记网织红细胞内残留RNA物质的检测染料，另一种为能够快速使血液中红细胞系成为等体积球状的球形化试剂。本发明所采用的荧光染料能够被半导体激光器激发，这样标记了荧光染料的网织红细胞能够被廉价的半导体激光器所激发发光，发射的荧光信号被收集分析后，能够快速准确地计数血液样本中的网织红细胞。
本发明提供一种网织红细胞检测染料，该检测染料包括荧光染料和醇，所述荧光染料为聚次甲基染料，其结构通式如下式I所示，
式I：
其中，Y-为PF6 -、HSO3 -、X-（X为卤素）、BF4 -或CF3SO3 -；Z为、或；R1、R2和R3为不小于2个碳的烷基、酯基或醚基，R4为不小于2个碳的烷基。所述醇为异丙醇和乙二醇中的至少一种；所述R1为CH3CH2-或CH3CH2CH2-；所述R2为CH3COOCH2CH2CH2-；所述R3为C6H5OCH2-、C6HSOCH2CH2-或CH3OCH2CH2-。
优选地，所述荧光染料具有如下式II或式III所示的结构，
式II；
式III。
本发明还提供一种网织红细胞检测试剂，包括稀释液和如上所述的网织红细胞检测染料，所述稀释液的PH值范围控制在8~10为宜。PH值低于上述范围太多，红细胞就易于脆化、溶血，杂质破碎红细胞量也可能增加。而PH值过高，则红细胞膜上的酸性官能基易离解与阳离子型色素结合，从而增加破碎红细胞非特异性染色的机会。
为了保证所述稀释液的PH值范围稳定在8~10，可使用缓冲剂调整。因此，所述稀释液可包含用于保持所述PH值的缓冲体系，所述缓冲体系例如为磷酸盐缓冲体系、氯化铵缓冲体系和氨基乙酸缓冲体系等中的一种或多种。
为了使本发明的检测试剂的渗透压在适于红细胞溶血的范围内，所述稀释液还可以包含无机盐，所述无机盐例如为硫酸钠、氧化钠和氯化钾等中的一种或多种。
为了使检测试剂的表面张力显著下降，所述稀释液还包含表面活性剂，所述表面活性剂可以为非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阳性表面活性剂和阴性表面活性剂中的至少一种。
优选地，所述表面活性剂为甜菜碱类、铵盐类、吡盐类或聚氧乙烯类等。
所述稀释液还包含防腐剂，防腐剂可以有效地控制试剂中微生物的生长，所述防腐剂为叠氮化钠、苯甲酸及其盐和异噻唑啉酮等中的一种或多种。
本发明还提供一种网织红细胞检测试剂的制备方法，所述方法包括：将如上所述的检测染料和所述稀释液按一定比例配置成预设容量后，在常温下搅拌均匀，使用0.22um滤膜进行过滤，过滤后的滤液对试样进行检测。
本发明还提供一种样本分析仪检测方法，所述方法包括以下步骤：采用如上所述的网织红细胞检测试剂，用所述检测试剂处理试样，检测试剂将试样中的网织红细胞球形化，使得网织红细胞的核酸与所述荧光染料特异性地结合，实现网织红细胞的计数。
本发明还提供一种采用所述样本分析仪检测方法的样本分析仪，所述样本分析仪包括：样本制备部件，所述样本制备部件将所述检测染料和所述稀释液混制成测定试样；光源，所述光源用光照射所述样本制备部件制备的所述测定试样；受光部件，所述受光部件接受所述光源照射所述测定试样时所述测定试样中的细胞产生的荧光和散射光，并输出所接受的荧光的相关荧光信号和所接受的散射光的相关散射光信号；细胞分析部件，所述细胞分析部件根据所述受光部件输出的荧光信号和散射光信号，将显示出一定范围的荧光强度和散射光强度的细胞作为网织红细胞检测出来；输出部件，所述输出部件根据所述细胞分析部件的检测结果进行输出。
本发明还提供一种采用如上所述的网织红细胞检测染料或所述的网织红细胞检测试剂在对生物样品进行染色中的应用。
下面以具体的实施例对本发明进行详细说明。
实施案例一：
试剂名称
浓度
磷酸盐缓冲对
3.6 g/L
氢氧化钠
2.1 g/L
硫酸钠
0.8 g/L
十烷基磺基甜菜碱
1.1 g/L
八烷基三甲基氯化铵
1.6 g/L
异噻唑啉酮
0.04 g/L
纯水
定容至1000mL
试剂名称
浓度
染料1
0.0035 g
异丙醇
3.0 g
乙二醇
定量至100g
按照上述表格所示配制稀释液和检测染料并定容至规定量后，在常温搅拌均匀后，使用0.22um滤膜进行过滤。利用希森美康XN1000仪器将配套试剂与自制试剂机型对比。结果详情见表1。
表1：
RET%本发明
RET%XN-1000
绝对偏差(不超过±0.3)
LFR 本发明
LFRXN-1000
相对偏差(不超过±30%)
MFR 本发明
MFR XN-1000
相对偏差(不超过±50)
HFR 本发明
HFR XN-1000
绝对偏差(不超过±2)
1.88
1.75
0.13
97.81
98.49
-0.69%
2.11
1.51
39.74%
0.08
0
0.08
3.97
3.84
0.13
90.85
90.84
0.01%
8.84
8.63
2.43%
0.31
0.53
-0.22
1.97
2.03
-0.06
94.32
92.49
1.98%
5.51
6.16
-10.55%
0.17
0.35
-0.18
5.11
5.11
0
97.32
97.2
0.12%
2.53
2.51
0.80%
0.15
0.29
-0.14
1.48
1.49
-0.01
95.77
95.74
0.03%
4.14
4.17
-0.72%
0.09
0.09
0
表1中的结果表明，本实施例中的检测试剂在配套的血细胞分析仪上RET%（网织红细胞百分比）的测定结果与XN1000仪器的测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
实施案例二：
试剂名称
浓度
磷酸盐缓冲对
3.6 g/L
氢氧化钠
2.1 g/L
硫酸钠
0.8 g/L
十烷基磺基甜菜碱
1.1 g/L
八烷基三甲基氯化铵
1.6 g/L
异噻唑啉酮
0.04 g/L
纯水
定容至1000mL
试剂名称
浓度
染料2
0.003 g
异丙醇
3.0 g
乙二醇
定量至100g
按照上述表格所示配制稀释液和检测染料并定容至规定量后，在常温搅拌均匀后，使用0.22um滤膜进行过滤。利用希森美康XN1000仪器将配套试剂与自制试剂机型对比。结果详情见表2。
表2：
RET%本发明
RET% XN-1000
绝对偏差(不超过±0.3)
LFR 本发明
LFRXN-1000
相对偏差(不超过±30%)
MFR 本发明
MFR XN-1000
相对偏差(不超过±50)
HFR 本发明
HFR XN-1000
绝对偏差(不超过±2)
0.81
1.02
-0.21
95.91
93.82
2.23%
4.09
6.03
-32.17%
0
0.15
-0.15
0.97
1.03
-0.06
95.8
95.58
0.23%
4.03
4.26
-5.40%
0.17
0.16
0.01
1.66
1.73
-0.07
92.1
88.82
3.69%
7.73
10.6
-27.08%
0.17
0.58
-0.41
2.12
2.03
0.09
95.08
92
3.35%
4.84
7.75
-37.55%
0.08
0.25
-0.17
1.48
1.7
-0.22
95.99
94.72
1.34%
3.91
5.28
-25.95%
0.1
0
0.1
表2中的结果表明，本实施例中的检测试剂在配套的血细胞分析仪上RET%（网织红细胞百分比）的测定结果与XN1000仪器的测定结果偏差在允许范围内，测定结果准确。
综上所述，本发明提供了一种网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪试剂，提供的核酸染料可用于样本分析仪，以满足对网织红细胞计数准确和快速的检测要求。网织红细胞计数通过试剂处理，增加特异性的网织红细胞核酸染料以及网织红细胞细胞膜的处理试剂，采用核酸荧光染色及半导体激光流式细胞术在RET通道这单一通道中即可准确计数网织红细胞。即通过稀释液处理网织红细胞形态，将其球形化的同时，改变各类型细胞膜形态，便于网织红细胞的核酸与染料特异性地结合，从而实现网织红细胞的计数。
本文所描述的概念在不偏离其精神和特性的情况下可以实施成其它形式。所公开的具体实施例应被视为例示性而不是限制性的。因此，本发明的范围是由所附的权利要求，而不是根据之前的这些描述进行确定。在权利要求的字面意义及等同范围内的任何改变都应属于这些权利要求的范围。
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