具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。需要说明的是，本发明并不限制于以下的实施方式。

＜本发明的肽＞

本发明的肽为如下(1)～(3)的任一项所述的肽。需要说明的是，以下，氨基酸序列将N末端置于左端，从N末端至C末端进行记载。

(1)一种肽，由序列号1所记载的氨基酸序列(QAFEPIRSV)中的4个以上且9个以下的连续的氨基酸残基构成

(2)一种肽，由序列号2所记载的氨基酸序列(TNPWHSPRQGSF)中的4个以上且12个以下的连续的氨基酸残基构成

(3)一种肽，由与序列号2所记载的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列构成

在本发明中，“由序列号1(或2)所记载的氨基酸序列中的n个连续的氨基酸残基构成的肽”是指由从序列号1(或2)所记载的氨基酸序列维持该序列中的顺序而选择的n个氨基酸残基构成的肽。

例如，作为“由序列号1所记载的氨基酸序列中的4个连续的氨基酸残基构成的肽”，可举出由“QAFE”构成的肽、由“AFEP”构成的肽、由“FEPI”构成的肽等。

本发明人等基于各种肽混合物的同时分析信息、对食欲不振造成影响的已知的肽的结构-活性相关信息进行了研究，结果发现了对食欲不振的治疗等显示出效果的新型肽、即上述肽。

需要说明的是，序列号1及2所记载的氨基酸序列均是“枯草杆菌蛋白酶(ズブチリシン)(subtilisin)”(也称为サブチリシン、サチライシン。)对米胚乳蛋白质的酶消化物。

本发明的肽可以是由序列号1或2所记载的氨基酸序列构成的肽，也可以是其部分肽。

在本发明的肽为由序列号1所记载的氨基酸序列构成的肽的部分肽的情况下，较优选由序列号1所记载的氨基酸序列中的较优选4个以上8个以下、更优选4个以上5个以下的连续的氨基酸残基构成的肽。

在本发明的肽为由序列号2所记载的氨基酸序列构成的肽的部分肽的情况下，较优选由序列号2所记载的氨基酸序列中的较优选4个以上10个以下、更优选4个以上8个以下的连续的氨基酸残基构成的肽。

在本发明的肽为由序列号1所记载的氨基酸序列构成的肽的部分肽的情况下，作为较优选的序列，可举出以下序列：

由序列号3表示的氨基酸序列(QAFE)构成的肽

由序列号4表示的氨基酸序列(PIRSV)构成的肽

在本发明的肽为由序列号2所记载的氨基酸序列构成的肽的部分肽的情况下，作为较优选的序列，可举出以下序列：

由序列号5表示的氨基酸序列(TNPW)构成的肽

由序列号6表示的氨基酸序列(HSPR)构成的肽

由序列号7表示的氨基酸序列(QGSF)构成的肽

本发明的肽也可以由序列号1或2所记载的氨基酸序列构成且为枯草杆菌蛋白酶消化物。

本发明人等进一步研究的结果发现：本发明的肽通过促进饥饿素分泌而带来食欲提高效果，能够发挥食欲不振的治疗、预防的效果。

本发明的肽通过化学合成、或通过天然的蛋白质(米胚乳蛋白质)或多肽的水解而得到。

作为化学合成的方法，可举出公知的肽合成法。具体而言，可举出作为肽合成中通常使用的方法的液相法或固相法。更具体而言，可举出Fmoc法、Boc法等。合成后的肽也可以纯化。作为纯化方法，可举出例如利用了离子交换色谱法、反相液相色谱法、亲和色谱法等的方法。

作为水解的方法，可举出利用了水解酶的方法、利用了强酸或强碱的方法等。

在利用了水解酶的方法中，可以使用来自动物、植物或微生物的水解酶(枯草杆菌蛋白酶等)。作为水解酶，可以利用能够用作食品的微生物(例如面包酵母、啤酒酵母等食用酵母)等。

作为利用了水解酶的水解的条件，虽然没有特别限制，但是可以根据利用的酶来将pH调节为适当的值，并在30～40℃左右的温度下使它们反应30分钟～48小时。可以从所得到的反应液中将本发明的肽纯化后利用。在水解后的对象为食品原材料的情况下，也能够直接或添加到其他食品原材料中作为食品来提供。

在利用了强酸的方法中，可以利用例如盐酸、硝酸、硫酸等。在利用强碱的方法中，可以利用例如碱金属氢氧化物(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂等)、碱金属碳酸盐(碳酸钠、碳酸钾等)、碱金属碳酸氢盐(碳酸氢钠、碳酸氢钾等)。

作为利用了强酸或强碱的水解的条件，虽然没有特别限制，但是可以在强酸或强碱的存在下在水中在1℃～100℃的温度下使它们反应30分钟～48小时。水解的反应产物可以在调制了pH之后直接使用，也可以通过纯化分离出本发明的肽后使用。

通过各种方法得到的肽的氨基酸序列可以利用通过埃德曼降解法从C-末端读取氨基酸序列的蛋白测序仪、GC-MS等进行分析。

＜本发明的组合物＞

本发明的组合物至少包含本发明的肽。本发明的组合物可以由本发明的肽构成，也可以包含其他成分。本发明的组合物中所含的肽可以是含有本发明的肽作为氨基酸序列的一部分的蛋白质。

通过摄取本发明的肽，可以治疗、预防或改善食欲不振。因此，本发明的组合物可以较优选用于食欲不振的治疗、预防或改善。

在本发明中，“食欲不振”意味着食欲的减少或摄食量的减少。根据本发明，能够特别良好地治疗、预防或改善由于饥饿素分泌的降低而引起的食欲不振。

在本发明中，“治疗”意味着例如食欲不振的治愈等。“预防”意味着例如食欲不振的抑制或延迟等。“改善”意味着例如食欲不振的缓和、减轻等。

本发明的组合物可以制备成任意的形态，也可以制备为药品、饮料或食品。

当制备本发明的组合物作为药品时，可以制备为口服制剂或非口服制剂。本发明的组合物例如可以单独使用本发明的肽或与载体、稀释剂或赋形剂一起制备为以下的制剂：片剂(素片、糖衣片、发泡片、薄膜包衣片、咀嚼片等)、胶囊、含片剂、粉末、细粒剂、颗粒剂、液剂、悬浮液、乳浊液、糊剂、乳膏、注射剂(包括配合到氨基酸输液、电解质输液等输液中的情况)、肠溶性的片剂、胶囊剂、缓释性制剂等。

作为载体、稀释剂或赋形剂，可以利用在制剂领域中常用且不与本发明的肽反应的物质。例如，可举出以下物质：乳糖、葡萄糖、甘露醇、糊精、环糊精、淀粉、蔗糖、镁铝偏硅酸盐、合成硅酸铝、羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钙、离子交换树脂、甲基纤维素、明胶、阿拉伯胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、轻质无水硅酸、硬脂酸镁、滑石、黄蓍胶、膨润土、硅酸铝镁胶(VeeGum)、氧化钛、山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、甘油、脂肪酸甘油酯、精制羊毛脂、甘油明胶、聚山梨醇酯、聚乙二醇、植物油、蜡、液体石蜡、白色凡士林、碳氟化合物、非离子性表面活性剂、丙二醇、水等。

在将本发明的组合物制备为饮料或食品的情况下，可以制备成任意的形态，例如可举出以下的物质：饮料类(咖啡、可可粉、果汁、清凉饮料、矿物质饮料、茶饮料、绿茶、红茶、乌龙茶、乳饮料、乳酸菌饮料、酸奶饮料、碳酸饮料等)、口香糖、橡皮糖、果冻、糖果、曲奇、梳打饼、饼干、冰点心(冰淇淋、冰棒、果子露、刨冰等)、杀菌袋装食品、果冻状食品(果冻、琼脂、果冻状饮料等)等。

本发明的饮料或食品也可以制备为所谓的健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、特定保健用食品、功能性标示食品、病人用食品/病人用组合食品(厚生劳动省，特殊用途食品的一种)或老年人用食品(厚生劳动省，特殊用途食品的一种)。

本发明的组合物中的本发明的肽的量可以根据所要获得的效果等适当设定。例如，相对于组合物，可以较优选配合0.01质量％以上的本发明的肽，更优选配合1.00质量％以上的本发明的肽。另外，相对于组合物，较优选配合100质量％以下的本发明的肽，更优选配合90质量％以下的本发明的肽。需要说明的是，上述的值在本发明的组合物中含有除本发明的肽以外的肽的情况下换算成本发明的肽的量。

本发明的组合物中除本发明的肽以外的成分的量可根据该成分的种类、组合物的形态、想要得到的效果等适当设定。

本发明的组合物的给药方法没有特别限制，可以是口服给药或非口服给药(注射等)中的任一种。从容易发挥本发明的效果的观点出发，本发明的组合物较优选口服给药。

本发明的组合物的给药量根据给药方法、给药对象的状态、年龄等而不同，例如，换算成本发明的肽的量，成人每天较优选为0.01mg/kg～500mg/kg，更优选为0.05mg/kg～100mg/kg，进一步优选为0.1mg/kg～30mg/kg。在上述范围内，存在给药量越多则越更容易发挥本发明的效果的倾向。

作为本发明的组合物的制造方法，根据想要得到的形态，能够采用公知的方法。

<治疗、预防或改善食欲不振的方法>

通过向对象给予本发明的组合物，可以治疗、预防或改善食欲不振。

给药方法可以根据组合物的形态适当选择。

给药次数、给药间隔、给药量能够根据给药对象的状态(症状、年龄、体重等)适当选择。

作为给药对象没有特别限制，可举出人、除人以外的哺乳类(狗、猫、家畜(牛、猪、绵羊、山羊等)等)等。

＜饥饿素分泌促进剂＞

如上所述，本发明的肽具有饥饿素分泌促进效果。因此，本发明的肽作为饥饿素分泌促进剂是有效的。

本发明的饥饿素分泌促进剂至少包含本发明的肽，可以由本发明的肽构成，也可以包含其他成分。在包含其他成分的情况下，只要不阻碍本发明的肽的作用，就可以配合任意的成分，例如，可以配合在上述＜本发明的组合物＞项中所列举的成分。

实施例

下面，示出实施例更具体地说明本发明，但本发明并非限制于这些实施例。

＜试验1＞

(肽的制作-1)

把纯化后的米胚乳蛋白质和各种消化酶溶解于水中，按照质量比为米胚乳蛋白质：酶＝100：1、且米胚乳蛋白质的终浓度为20mg/ml的方式混合，使进行酶反应，以各种酶消化物的形式得到肽。

所使用的消化酶和反应条件如下。在经过下述反应时间后，将各试样煮沸(100℃，10分钟)，停止酶反应。

(1)枯草杆菌蛋白酶(商品名“T1426”，Sigma-Aldrich公司制造)：反应温度37℃，反应时间5小时，反应pH7.5。

(2)Sumizyme(商品名“Sumizyme FP”，新日本化学公司制造)：反应温度：50℃，反应时间：5小时，反应pH7.5。

(3)嗜热菌蛋白酶(商品名“Thermolysin”，Seikagaku公司制造)：反应温度37℃，反应时间5小时，反应pH7.0～7.5。

(饥饿素分泌活性的评价-1)

将在上述(肽的制作-1)中得到的肽供于以下的试验，评价各肽对饥饿素分泌带来的影响。通过给予肽越促进饥饿素分泌，意味着该肽具有越高的食欲促进效果。

将饥饿素分泌细胞(MGN3-1)按1×10⁵cells/well接种于96孔板中，在辛酸钠/DMEM培养基中，在37℃下培养24小时。培养后，用DPBS清洗细胞。向细胞中添加作为缓冲溶液配制的各肽100μL(肽浓度1mg/mL或10mg/mL)，进一步在37℃下培养4小时。需要说明的是，作为缓冲液，利用了DMEM中50μM辛酸钠。

另外，在以下的全部的试验中，只要没有特别的记载，将除了仅添加缓冲液代替肽这一点以外均与上述同样地培养的试样作为对照而准备。

培养后，回收培养基试样，通过离心分离处理得到上清。向上清中添加10μL的1NHC1，保存在-80℃下直至实施下述饥饿素浓度测定为止。

使用ELISA试剂盒(商品名“Ghrelin(Acylated)EIAKit A05117”，Bertin Pharma公司制造)测定各培养基试样中的饥饿素浓度。将其结果示于图1。需要说明的是，图1的结果示出为相对于对照的测定值的相对值。

如图1所示，可知枯草杆菌蛋白酶消化物、Sumizyme消化物和嗜热菌蛋白酶消化物分别具有饥饿素分泌促进效果。

特别地，可知枯草杆菌蛋白酶消化物和Sumizyme消化物具有呈浓度依赖性地显著的饥饿素分泌促进效果。

＜试验2＞

(肽的制作-2)

基于上述(饥饿素分泌的评价-1)的结果，筛选出带来饥饿素分泌促进效果的枯草杆菌蛋白酶消化物中的肽，将以下两种肽确定为候选。在这里，通过基于Fmoc法的合成、接着通过基于反相HPLC的纯化制作这些肽。需要说明的是，以下，将“由序列号n表示的氨基酸序列构成的肽”也简称为“序列号n的肽”。

(1)由序列号1表示的氨基酸序列(QAFEPIRSV)构成的肽

(2)由序列号2表示的氨基酸序列(TNPWHSPRQGSF)构成的肽

(饥饿素分泌活性的评价-2)

利用上述两种肽，通过与上述(饥饿素分泌活性的评价-1)同样的方法，评价各肽对饥饿素分泌带来的影响。将其结果示于图2(n＝4)。需要说明的是，在本例中，使用了肽浓度为0.01mM、0.1mM或1mM的肽溶液。

如图2所示，可知序列号1或2的肽均具有饥饿素分泌促进效果。特别是当肽浓度为1mM以上时，该效果显著。

＜试验3＞

利用在上述(肽的制作-2)中制作的序列号1的肽，验证了饥饿素分泌促进效果的作用。具体而言，验证了序列号1的肽的给予对细胞内外的饥饿素浓度带来的影响、以及对饥饿素合成相关基因表达带来的影响。

(饥饿素分泌活性的评价-3)

利用序列号1的肽，通过与上述(饥饿素分泌活性的评价-1)同样的方法，评价肽对饥饿素分泌(细胞内的饥饿素浓度)带来的影响。将其结果示于图3A(n＝4～5)。

(饥饿素合成相关基因表达的评价)

通过以下方法对上述(饥饿素分泌活性的评价-1)中的培养结束后的细胞中的、与饥饿素合成相关联的三种基因(前饥饿素原(Preproghrelin)、GOAT和PC3)的表达量进行测定。首先，利用“RNeasy Mini Kit”(QIA-GEN公司制)、及“Takara Prime Script RTMasterMix”(Takara生物公司制)从细胞提取mRNA。接着，利用"Light Cycler 96System"(RocheDiagnostic公司制)及“THUNDERBIRD qPCR Mix”(东洋纺公司制)使cDNA扩增，测定mRNA表达量。其结果示于图3B(前饥饿素原)、图3C(GOAT)、图3D(PC3)(分别是n＝4～5)。

如图3A所示，由于给予了序列号1的肽，细胞内的饥饿素浓度具有减少的倾向。需要说明的是，由于给予了序列号1的肽，细胞外的饥饿素浓度增加了(数据未示出)。

如图3B～D所示，饥饿素合成相关基因的表达量均未发现由于序列号1的肽的给予引起的变化。

由以上的结果可知，序列号1的肽通过促进饥饿素向细胞外的分泌并非通过促进饥饿素合成而带来饥饿素分泌促进效果。

＜试验4＞

基于上述＜试验3＞的结果，验证了由序列号1的肽所产生的饥饿素分泌促进效果的作用。具体而言，验证了序列号1的肽的给予对细胞内cAMP浓度及细胞内钙离子(Ca²⁺)浓度带来的影响。

需要说明的是，已知去甲肾上腺素通过细胞内的cAMP浓度及细胞内钙离子浓度的增加而促进饥饿素的分泌。因此，在以下的试验中，也准备了利用去甲肾上腺素的试样作为阳性对照。

(细胞内cAMP浓度的评价)

使饥饿素分泌细胞(MGN3-1)溶解于含有0.5mM IBMX的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液中，在37℃下孵育30分钟后，利用“HitHunter cAMP Assay for small molecules”(DiscoveRx公司制造)对细胞内的cAMP进行定量。其结果示于图4。

(细胞内钙离子浓度的评价)

使用“Calcium Kit II-Fluo4”(同仁化学研究所)，并使用多功能酶标仪(BMGLABTECH GmbH公司制，λex＝485nm，λem＝520nm)进行测定。

如图4所示，序列号1的肽对细胞内cAMP浓度没有影响。另外，序列号1的肽对细胞内钙离子浓度也没有影响(数据未示出)。这表明序列号1的肽经由与去甲肾上腺素不同的路径促进饥饿素的分泌。

＜试验5＞

向小鼠给予序列号1的肽，验证了在活体内的效果。具体而言，验证了序列号1的肽的给予对小鼠的摄食行为和血清中饥饿素浓度带来的影响。

(小鼠摄食行为的评价-1)

对小鼠(ddY小鼠，11周龄的雄性)单次经口给予溶解于生理盐水的序列号1的肽(1mg/kg)。接着，使该小鼠摄食预先称量好的饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA公司制造)，测定了在摄食4小时后残留的饲料重量。

另外，除了单次经口给予生理盐水代替序列号1的肽这一点以外，进行与上述同样的试验作为对照试验。

将已饲喂给小鼠的饲料重量与摄食4小时后残留的饲料重量之差确定为摄食量(g/4小时)。其结果示于图5A(n＝10～11)。

(小鼠血清中饥饿素浓度的评价)

对小鼠(ddY小鼠，11周龄雄性)给予溶解于生理盐水中的序列号1的肽(0.3mg/kg)。接着，在给药1小时后从小鼠的眼窝静脉采血，在4℃下以1120×g离心分离10分钟，将上清用1N HCl进行酸化，然后利用酰化饥饿素酶免疫测定试剂盒测定血清中饥饿素浓度(pg/ml)。其结果示于图5B(n＝5～7)。

如图5A所示，序列号1的肽使小鼠的摄食量增加，显示出食欲促进效果。另外，如图5B所示，通过给予序列号1的肽，使血清中饥饿素浓度增加了。

＜试验6＞

通过基于Fmoc法的合成、接着通过基于反相HPLC的纯化来制作在上述(肽的制作-2)中制作的序列号1和2的肽、以及它们的部分肽(序列号3～7的肽)。接着，向小鼠给予这些各肽，验证了在活体内的效果。具体而言，验证了各肽的给予对小鼠的摄食行为带来的影响。

在本例中利用的肽为以下的七种：

(1)由序列号1表示的氨基酸序列(QAFEPIRSV)构成的肽

(2)由序列号2表示的氨基酸序列(TNPWHSPRQGSF)构成的肽

(3)由序列号3表示的氨基酸序列(QAFE)构成的肽

(4)由序列号4表示的氨基酸序列(PIRSV)构成的肽

(5)由序列号5表示的氨基酸序列(TNPW)构成的肽

(6)由序列号6表示的氨基酸序列(HSPR)构成的肽

(7)由序列号7表示的氨基酸序列(QGSF)构成的肽

(小鼠摄食行为的评价-2)

对小鼠(ddY小鼠，购入7周龄的雄性并驯化1周以上后使用)单次经口给予溶解于生理盐水的各肽(1mg/kg)。接着，使该小鼠摄食预先称量好的饲料(商品名“CE-2”，日本CLEA公司制造)，测定在摄食2小时后残留的饲料重量。

另外，除了单次经口给予生理盐水代替各肽这一点以外，进行与上述同样的试验作为对照试验。

将已饲喂给小鼠的饲料重量与摄食2小时后残留的饲料重量之差确定为摄食量(g/2小时)。基于该结果，将各组中的摄取量计算为将对照的摄取量设为“100”的情况下的相对值。其结果示于图6(n＝7～18，*相对于对照P<0.05)。

如图6所示，所有的肽均使小鼠的摄食量增加，均显示出食欲促进效果。这样的效果不仅在由序列号1或2所表示的氨基酸序列构成的肽中观察到，而且在其部分肽中也观察到。

特别是，由序列号3、5、6或7表示的氨基酸序列构成的肽与对照相比饲料摄取量显著地增加了。

序列表

<110> 龟田制菓株式会社

<110> 国立大学法人京都大学

<110> 公益财团法人上总DNA研究所

<120> 肽、组合物及饥饿素分泌促进剂

<130> KMSF-006PCT

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 1

Gln Ala Phe Glu Pro Ile Arg Ser Val

1 5

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 2

Thr Asn Pro Trp His Ser Pro Arg Gln Gly Ser Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 3

Gln Ala Phe Glu

1

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 4

Pro Ile Arg Ser Val

1 5

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 5

Thr Asn Pro Trp

1

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 6

His Ser Pro Arg

1

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 合成的

<400> 7

Gln Gly Ser Phe

1