一种提取紫菜中高纯度r-藻红蛋白的新方法
阅读说明：本技术 一种提取紫菜中高纯度r-藻红蛋白的新方法 (Novel method for extracting high-purity R-phycoerythrin in laver ) 是由 王全富 侯艳华 王一帆 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提取高纯度藻红蛋白的方法。该方法将紫菜反复冻融使细胞破碎,经离心、盐析后透析,得到上清液粗蛋白。利用新型绿色的低共熔溶剂,并加入磷酸盐构成双水相体系,萃取得到较高纯度的藻红蛋白。本发明提取得到的藻红蛋白纯度高,所应用的低共熔溶剂双水相体系绿色环保,生物相容性好,且该提取方法成本低,易规模化、工业化,在提取高纯度藻红蛋白、保护环境等方面有应用前景。(The invention discloses a method for extracting high-purity phycoerythrin. The method comprises repeatedly freezing and thawing thallus Porphyrae to break cells, centrifuging, salting out, and dialyzing to obtain supernatant crude protein. A novel green eutectic solvent is utilized, phosphate is added to form a two-aqueous-phase system, and the phycoerythrin with higher purity is obtained through extraction. The phycoerythrin extracted by the invention has high purity, the applied eutectic solvent aqueous two-phase system is green and environment-friendly, the biocompatibility is good, and the extraction method has low cost, is easy to realize large-scale and industrialization, and has application prospects in the aspects of extracting high-purity phycoerythrin, protecting the environment and the like.)
技术领域
本发明属于蛋白质提取纯化技术领域，具体涉及一种低共熔溶剂-双水相法制备紫菜中高纯度取藻红蛋白的方法。
背景技术
藻红蛋白(PE)是藻胆蛋白的一种，是从红藻中分离纯化出来的。藻红蛋白具有很好的吸光性能和很高的量子产率，此外其可以很方便地将其与生物素和各种单克隆抗体结合，因此其应用广泛既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，又可制成荧光试剂，用于临床医学诊断和免疫化学及生物工程等领域。对于藻红蛋白的提取与研究就具有重要的理论和实际意义。
目前藻红蛋白的分离纯化主要有硫酸铵沉淀法结合琼脂糖凝胶色谱分析法(Indian J. Geo-Mar. Sci. 2013，42，21-28），羟基磷灰石柱色谱法(J. Biotechnol.2003，101,，289-293)，聚丙烯酰胺凝胶电泳法(J. Chromatogr. B. 2000，739，117-123)等。这些传统方法步骤过多，操作复杂，耗费溶剂，动力能消耗高，且提取出的蛋白质纯度有限，因此需要额外的多步层析来达到纯度目标，这一些蛋白的工业大规模生产极为不利。蛋白质由于不稳定性在酸性条件、碱性条件或者加热条件下，容易变性。因此，需要更为高效、稳定、经济且能规模化的方式，来获得既高纯度又高产量且有生物活性的产品。
随着绿色化学的发展，绿色溶剂越来越受到人们的重视。低共熔溶剂(DeepEutectic Solvents，DESs)是一种绿色溶剂，由氢键受体(季铵盐)和氢键供体(酸酰胺、羧酸和多元醇)按合适的摩尔比组成(Am. Chem. Soc. 2004，126，9142-9147)。而双水相体系中由于含有大量的水，萃取时接近生物物质的生理环境，故大部分的生物大分子被双水相技术分离后依然保持生物活性(Biochem. Eng. J. 2009，46，306-312)。
鉴于上述论述，本发明结合了低共熔溶剂与双水相体系，在传统硫酸铵盐析的基础上，采用低共熔溶剂/盐双水相体系进行紫菜中藻红蛋白的萃取，在制备高纯度藻红蛋白方面有应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取紫菜中高纯度藻红蛋白的新方法，该方法简化藻红蛋白的提纯过程、产物纯度高、绿色环保、易于放大。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）制备粗提蛋白：-20 ℃ 冷冻过夜的紫菜经离心后取上清液盐析，加入硫酸铵盐至35%饱和度。离心后取沉淀，于pH=6.8的磷酸缓冲液中透析，即得藻红蛋白粗提液。
（2）低共熔溶剂的合成：以氯化胆碱和尿素为原料，在80-90 ℃温度下搅拌2-3 h，得到澄清透明液体即为低共熔溶剂。
（3）双水相体系的建立：向0.3-0.5 g低共熔溶剂中加入300-400 μL pH为8.0的K2HPO4盐溶液，静置于25 ℃ 水浴中，即成双水相体系。
（4）将粗提蛋白加入到双水相中，振荡后置于20-25 ℃水浴中，成相稳定后吸取上相，用紫外分光光度计测定在280 nm、565 nm、618 nm和650 nm处的吸光值，计算纯度及提取率。
纯度：
提取率：
浓度：
其中Ct和Cb分别为富DES上相和富盐下相中藻红蛋白的浓度，Vt和Vb分别表示上相和下相的体积。
（5）技术优点：
1.本发明所提取的藻红蛋白纯度和得率都较高。
2.本发明的双水相体系分离条件温和，整个操作可以在常温常压下进行。
3.本发明分离步骤少，分离过程更加经济。
4.本发明各参数可按比例放大，可连续化操作，易于实现工业化大规模生产。
附图说明
图1a为藻红蛋白在不同低共熔溶剂加入量下的纯度和提取率。
图1b为藻红蛋白在不同粗蛋白加入量下的纯度和提取率。
图1c为藻红蛋白在不同提取时间下的纯度和提取率。
图2为藻红蛋白的凝胶电泳图。
图3a为纯水中的藻红蛋白与本发明实例中低共熔溶剂双水相中的藻红蛋白的紫外-可见光谱图。
图3b为纯水中的藻红蛋白与本发明实例中低共熔溶剂双水相中的藻红蛋白的荧光光谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明进行进一步的说明和描述。
实施例1：
（1）取5 g干紫菜，加入250 mL灭菌水后于-20℃ 冷冻过夜，经离心后取上清液盐析，加入硫酸铵盐至35%饱和度。
（2）离心后取沉淀，于pH=6.8的磷酸缓冲液中透析，出去硫酸铵，即得藻红蛋白粗提液。
（3）低共熔溶剂的合成：以氯化胆碱和尿素为原料，在80-90 ℃温度下搅拌2-3 h，得到澄清透明液体即低共熔溶剂。
（4）双水相体系的建立：向0.30-0.50 g低共熔溶剂中加入300-400 μL pH为8.0的K2HPO4盐溶液，置于20-25 ℃水浴中，即成双水相体系。
（5）藻红蛋白提取条件的优化：向0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 g DES中加入300-400 μL pH为8.0的K2HPO4盐溶液，加入粗蛋白，振荡后置于25 ℃ 水浴中，成相稳定后吸取上相，计算纯度和提取率，结果如图1a所示。当DES量为0.35g时，纯度与提取率最高；向DES-盐双水相体系中加入0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060 mg藻红蛋白，振荡后置于20-25 ℃水浴中，成相稳定后吸取上相，计算纯度和提取率，结果如图1b所示。当蛋白加入量为0.04 mg时，纯度与提取率最高。建立7个低共熔溶剂双水相体系并加入粗蛋白提取液，振荡后分别于25 ℃水浴中放置0、10、20、30、40、50、60 min，计算纯度和提取率，结果如图1c所示。当时间为20-30 min时，纯度与提取率最高，分别为3.825和92.60%。
（6）将在最优条件下所得的高纯度蛋白进行SDS-PAGE验证，结果如图2所示。分子量分别约为18.0，21.0，30.0 kDa，分别为α、β、γ亚基。
（7）采用紫外-可见光谱和荧光光谱研究提取前后藻红蛋白的构象。R-藻红蛋白在纯水和DES相中的紫外-可见光谱曲线形态相似，最大吸收峰仍存在于495、540和565 nm处(图3a)。此外，在水和DES相中，R-藻红蛋白激发波长均为495 nm，发射波长均为570 nm(图3b)。这些结果表明，R-藻红蛋白与DESs之间没有相互作用，也没有形成化学键。
实施例2：
（1）取5 g干紫菜，加入250 mL灭菌水后于-20 ℃冷冻过夜，经离心后取上清液盐析，加入硫酸铵盐至35%饱和度。
（2）离心后取沉淀，于pH=6.8的磷酸缓冲液中透析，出去硫酸铵，即得藻红蛋白粗提液。
（3）低共熔溶剂的合成：以氯化胆碱和尿素为原料，在80-90 ℃温度下搅拌2-3h，得到澄清透明液体即低共熔溶剂。
（4）双水相体系的建立：向0.30-0.50 g低共熔溶剂中加入300-400 μL pH为8.0的K2HPO4盐溶液，置于25 ℃水浴中，即成双水相体系。
（5）藻红蛋白提取条件的优化
向0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 g DES中加入300-400 μL pH为8.0的K2HPO4盐溶液，加入粗蛋白，振荡后置于25 ℃ 水浴中，成相稳定后吸取上相，计算纯度和提取率。当DES量为0.35 g 时，纯度与提取率最高；向DES-盐双水相体系中加入0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060 mg藻红蛋白，振荡后置于20-25 ℃水浴中，成相稳定后吸取上相，计算纯度和提取率，当蛋白加入量为0.04 mg时，纯度与提取率最高。建立7个低共熔溶剂双水相体系并加入粗蛋白提取液，振荡后分别于25 ℃水浴中放置0、10、20、30、40、50、60min，计算纯度和提取率，当时间为20-30min时，纯度与提取率最高，分别为3.775和93.20%。