一种蛋白核小球藻抗氧化肽及其制备方法
阅读说明：本技术 一种蛋白核小球藻抗氧化肽及其制备方法 (Chlorella pyrenoidosa antioxidant peptide and preparation method thereof ) 是由 王际辉 肖珊 王璐 王波 蔡燕雪 于 2021-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蛋白核小球藻抗氧化肽及其制备方法,以蛋白核小球藻为原料,通过蛋白核小球藻粉破壁处理,提取小球藻蛋白,制备小球藻多肽,分离纯化小球藻多肽,冷冻干燥,得到蛋白核小球藻抗氧化肽。所述抗氧化肽的氨基酸序列为∶VPADDL。本发明采用酶解法超声辅助提取小球藻蛋白,含盐量低,蛋白提取率高。使用多种酶制备小球藻抗氧化肽,以羟基自由基的清除率作为判别指标,能更精准的用于小球藻抗氧化肽的制备。采用截留分子量3000Da的超滤膜制备藻多肽,为下一步色谱分离获得更纯的藻抗氧化肽提供了方便条件。根据藻多肽分子量大小的不同采用凝胶层析分离方式,所得到的藻多肽纯度更高。(The invention discloses chlorella pyrenoidosa antioxidant peptide and a preparation method thereof. The amino acid sequence of the antioxidant peptide is VPADDL. The method adopts an enzymolysis method to extract chlorella protein with ultrasonic assistance, and has low salt content and high protein extraction rate. The chlorella antioxidant peptide is prepared by using various enzymes, and the clearance rate of hydroxyl free radicals is used as a discrimination index, so that the chlorella antioxidant peptide can be more accurately prepared. The ultrafiltration membrane with the molecular weight cutoff of 3000Da is adopted to prepare the algae polypeptide, thereby providing convenient conditions for obtaining purer algae antioxidant peptide by the next chromatographic separation. The purity of the obtained algae polypeptide is higher by adopting a gel chromatography separation mode according to the difference of molecular weight of the algae polypeptide.)
技术领域
本发明涉及一种蛋白核小球藻抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
传统的合成抗氧化剂有可能引起一些不可预期的副作用，消费者对人工抗氧化剂在食品安全方面的顾虑很多，绿色健康食品日益受到消费者的关注，蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)是单细胞绿色微藻，广泛分布于淡水和海水中。小球藻因富含蛋白质、膳食纤维、脂质、维生素、叶绿素和类胡萝卜素以及活性代谢产物而备受关注。此外，小球藻还具有出色的免疫调节作用，抗氧化能力以及降血糖和降血脂作用，被联合国粮食及农业组织(FAO)评为“绿色健康食品”。蛋白核小球藻抗氧化肽是一种天然抗氧化剂，目前，我国对澡蛋白利用率偏低，其制备方法复杂，提取的小球藻蛋白，含盐量偏高，且蛋白提取率低，纯度低等缺点。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供一种蛋白核小球藻抗氧化肽及其制备方法，该抗氧化肽具有良好的抗氧化能力。对科技、经济和食品业的发展将具有重要意义。
本发明所采用的技术方案是一种蛋白核小球藻抗氧化肽，所述肽的氨基酸序列为∶VPADDL。
一种蛋白核小球藻抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤∶(1)蛋白核小球藻粉破壁处理；(2)小球藻蛋白提取；(3)小球藻多肽制备；(4)小球藻多肽的分离纯化。
进一步地，所述的步骤(1)中蛋白核小球藻粉的具体破壁方法为∶将小球藻粉过60目筛去除杂物，藻粉与纯净水的液料比为10：1；超声30min，细胞破碎仪处理15min(3/2s)后，冷冻干燥为破壁小球藻粉，装袋备用。
进一步地，所述的步骤(2)中小球藻蛋白提取的具体方法为∶称取破壁小球藻粉，按照质量体积比1∶30的比例加入纯水，并充分搅拌溶胀，调节pH至5.0，酶解温度50℃，加入1％纤维素酶酶解3h,酶解结束后升温至100℃灭酶10min,后于超声功率480w超声辅助提取40分钟，再均质10分钟，8000r/min离心10分钟，取沉淀冷冻干燥，即得小球藻藻蛋白。
进一步地，所述的步骤(3)中小球藻藻多肽制备的具体方法为∶称取小球藻藻蛋白，加20倍的纯水溶解，加3％碱性蛋白酶，调pH至8.0、酶解温度60℃，酶解时间6h，酶解结束后升温至100℃灭酶10min，调节pH至2.0，酶解温度37℃，加入2％胃蛋白酶酶解2h,调节pH至7.5，酶解温度37℃，加入2％胰酶酶解2h,酶解结束后升温至100℃灭酶10min,得到小球藻藻多肽酶解液，冷藏备用。
进一步地，所述的步骤(4)小球藻多肽的分离纯化的具体方法为∶用截留分子量3000Da的超滤膜制备分子量小于3000Da的小球藻多肽溶液；将多肽溶液60℃真空浓缩后冷冻干燥，得到分子量小于3000Da的小球藻多肽；将分子量小于3000Da的小球藻多肽用SephadexG-15凝胶层析进行分离，即得到所述小球藻抗氧化肽。
本发明的有益效果是：本发明采用酶解法超声辅助提取小球藻蛋白，含盐量低，蛋白提取率高。使用多种酶制备小球藻抗氧化肽，以羟基自由基的清除率作为判别指标，能更精准的用于小球藻抗氧化肽的制备。采用截留分子量3000Da的超滤膜制备藻多肽，为下一步色谱分离获得更纯的藻抗氧化肽提供了方便条件。根据藻多肽分子量大小的不同采用凝胶层析分离方式，所得到的藻多肽纯度更高。
附图说明
图1为Sephadex G-15凝胶层析分离纯化图。
图2为小球藻抗氧化肽质谱图。
图3为纯化的抗氧化多肽与谷胱甘肽的羟基自由基清除能力对比图。
图4为纯化的抗氧化多肽与谷胱甘肽的铁离子螯合能力对比图。
图5为纯化的抗氧化多肽与谷胱甘肽的超氧阴离子自由基清除能力对比图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，但不以任何方式限制本发明。
一、实施例1
步骤1、将10g小球藻粉过60目筛去除杂物，加入纯净水100ml；超声30min，细胞破碎仪处理15min(3/2s)后，冷冻干燥为破壁小球藻粉，装袋备用。
步骤2、称取10g破壁小球藻粉，加入300ml纯水，并充分搅拌溶胀，调节pH至5.0，酶解温度50℃，加入0.1g纤维素酶酶解3h,酶解结束后升温至100℃灭酶10min,后于超声功率480w超声辅助提取40分钟，再均质10分钟，8000r/min离心10分钟，去上清，沉淀冷冻干燥，即得小球藻藻蛋白。
步骤3、称取5g小球藻藻蛋白，加100ml纯水溶解，加0.15g碱性蛋白酶，调pH至8.0、酶解温度60℃，酶解时间6h，酶解结束后升温至100℃灭酶10min，调节pH至2.0，酶解温度37℃，加入0.1g胃蛋白酶酶解2h,调节pH至7.5，酶解温度37℃，加入0.1g胰酶酶解2h,酶解结束后升温至100℃灭酶10min,得到小球藻藻多肽酶解液，冷藏备用。
步骤4、将得到的多肽酶解液利用分子量截留范围为3000Da的超滤膜对酶解产物进行超滤分离，将其分为2个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于3000Da的组分、分子量小于3000Da的组分；收集具有最佳抗氧化活性的组分，再经过Sephadex G-15凝胶层析柱(长60cm，直径1.6cm)进行分离，以纯水洗脱，流速为1ml/min；收集具有最佳抗氧化活性的峰，得到本发明的抗氧化多肽。
二、抗氧化多肽的氨基酸序列测定，
色谱仪器：Easy-nano 1200；质谱仪器：Q Exactive Plus(Thermo,USA)。所用色谱柱为Pico Tip EMITTER(C18，1.9μm粒径，120A孔径)，上样量3ul，洗脱液为A：0.1％甲酸水溶液，B：80％乙腈，0.1％甲酸，流速：200nL/min。数据采集软件为Xcalibur(Thermo,USA)；。质谱条件：MS扫描范围(m/z)355-1700，分辨率70,000，最大离子注入时间100ms，MS/MS离子注入时间75ms，扫描范围200-2000，分辨率35,000，碎裂模式：高能碰撞(HCD)，碎裂能量(NCE)：27；排除1价及高于7价的离子，动态排除时间60s，数据依赖采集模式(DDA)，一个MS1图谱选择10个最强的母离子进行串级扫描。
利用液相色谱质谱联用测定本发明的抗氧化多肽是由6个氨基酸组成，所述多肽的氨基酸全序列为∶VPADDL。
三、藻肽抗氧化活性的测试
1)羟基自由基清除能力测定，如图3所示，
取浓度为1mg/ml多肽样品2mL,再分别加入0.5mL 6mm/L的硫酸亚铁溶液、2mL1.5mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和0.5mL 0.1％的H2O2溶液,摇匀,并置于37℃水浴中反应15min,在510nm处测定其吸光度Ai；以等量蒸馏水代替H2O2,测其吸光度Aj；以等量蒸馏水代替样品,测其吸光度A0。
羟基自由基清除率＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
2)铁离子螯合能力测定，如图4所示，
取1mL的1mg/ml多肽样品加入2.7mL去离子水和0.1mL Fe Cl2溶液(2mmol/L),混匀后加入0.2mL Ferrozine(5mmol/L),静置10min。在562nm波长处测定吸光度A1；A0为空白对照组即以1mL双蒸水代替样品的吸光度。
铁离子螯合率＝(1-A/A0)×100％
3)超氧阴离子自由基清除能力测定，如图5所示，
利用邻苯三酚自氧化对超氧阴离子自由基清除能力进行测定。取50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)2.5mL,置25℃水浴中保温20min,分别加入1mL浓度为1g/ml多肽样品溶液和0.6mL 25mmol/L邻苯三酚溶液,混匀后于25℃水浴中反应5min,加入0.5mL浓盐酸终止反应,于299nm处测定吸光度A1,以去离子水代替邻苯三酚测定吸光值A2；以去离子水代替样品溶液测定吸光值A0。
超氧阴离子自由基清除率％＝(1-(A1-A2)/A0)×100％
纯化后的抗氧化多肽具有很强的抗氧化能力，由图3、4和5可以看出，与谷胱甘肽标准品对比，藻抗氧化肽具有较强的羟基自由基清除能力，铁离子螯合能力以及超氧阴离子自由基清除能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 东莞理工学院
<120> 一种蛋白核小球藻抗氧化肽及其制备方法
<141> 2021-02-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Pro Ala Asp Asp Leu
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