一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白
阅读说明：本技术 一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白 (Method for efficiently separating and purifying marine microalgae phycobiliprotein and phycobiliprotein ) 是由 郑伊奕 范建华 季亮 钱宇慧 凌睿婧 马娆 王启要 于 2021-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法,其特征在于,包括：取新鲜海洋微藻藻液于离心管,将藻液稀释至5×10～6-5×10～7cells/mL；二次离心,去上清,获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中,获得双水相藻体重悬液；然后经反复冻融,获得微藻细胞破碎液；接着,待双水相体系分配平衡后取上相,即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；接着,依次经羟基磷灰石柱纯化和银离子交换柱纯化获得藻胆蛋白纯化液；接着,进行透析除盐,冷冻干燥获得微藻藻胆蛋白成品。本发明采用冻融法破碎双水相藻体重悬液,可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化,可简化分离纯化步骤,有效提高回收率。(The invention provides a method for efficiently separating and purifying phycobiliprotein of marine microalgae, which is characterized by comprising the following steps: taking fresh marine microalgae solution in a centrifuge tube, and diluting the solution to 5 × 10 6 ‑5×10 7 cells/mL; centrifuging for the second time, and removing the supernatant to obtain algae; resuspending the algae in a PEG/salt aqueous two-phase system to obtain aqueous two-phase algae suspension; then repeatedly freezing and thawing to obtain microalgae cell crushing liquid; then, after the two aqueous phase system is distributed and balanced, taking the upper phase, namely the primarily purified phycobiliprotein extracting solution; then purifying by hydroxyapatite columnPurifying with silver ion exchange column to obtain purified phycobiliprotein solution; and then dialyzing to remove salt, and freeze-drying to obtain a microalgae phycobiliprotein finished product. The invention adopts a freeze-thawing method to crush the aqueous two-phase algae heavy suspension, can realize the crushing of algae and the primary purification of phycobiliprotein by one step, can simplify the separation and purification steps and effectively improve the recovery rate.)
技术领域
本发明属于生化分离技术领域，具体地涉及一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法及藻胆蛋白。
背景技术
微藻通常是指含有叶绿素a并能进行光合作用的微生物的总称，属于原生生物的一种。藻胆体是螺旋藻、红藻、隐藻等海洋微藻中主要的捕光天线复合物，藻胆体由藻胆蛋白和连接蛋白构成，藻胆蛋白则是由藻胆素色基与脱辅基蛋白通过共价键联接而成。不同藻胆蛋白的结构基本相似，均含有两条结构相似的多肽链α和β亚基，分子量约为3万道尔顿，每一亚基各与一分子的藻蓝素结合。藻胆蛋白按照吸收光谱性质藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)和藻红蓝蛋白(Phcoerycyanin，PEC)。其中藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白的纯度越高，售价越高，纯度计算分别以A620/A280、A565/A280与A650/A280来表征，根据其纯度的不同可分级为：食品级>0.7，药品级>3.0和试剂级>4.0。藻胆蛋白具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫荧光性等功能，被广泛用作天然色素(食品、化妆品、染料等)、医药保健品和分子生物学研究中的荧光试剂，潜在市场需求巨大。
对于藻胆蛋白这类胞内可溶性蛋白，要对其提取分离，必须破碎藻类细胞，在保持蛋白活性的基础上使其以溶解的状态释放出来，再进行分离纯化。在藻胆蛋白粗提液中，杂蛋白含量极高，要分离得到商品应用标准的藻胆蛋白，通常首先需要经过如利凡诺沉淀、盐析法、等电点法或结晶法初步分离除去杂蛋白后，再通过柱层析法纯化，包括轻基石灰石吸附层析法、纤维素系列离子交换层析法、亲和层析和分子排阴层析法等。上述藻胆蛋白纯化方法一次性可处理量较少且易污染，单柱纯化所得纯度低，柱回收操作复杂且效率低，导致生产成本太高而无法大量工业化制备。
在藻胆蛋白分离纯化方面，国内相关技术研究起步晚、研究基础较为薄弱，存在分离纯化工艺复杂、成本高、得率低的问题，目前开发利用的力度、深度还很小，大部分仅限于简单的食用。繁杂的分离纯化工艺使藻胆蛋白的应用受到了限制。因此，有必要开发一种简单高效的适合大量制备分离纯化藻胆蛋白的方法，为实现海洋微藻藻胆蛋白的工业化生产提供技术基础。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺陷和不足，提供一种操作简单、得率高、适用于大规模生产的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法。本发明的第二个目的是提供一种藻胆蛋白。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，包括：
步骤一、取新鲜海洋微藻藻液于离心管，将藻液稀释至5×106-5×107cells/mL；二次离心，去上清，获得藻体；将藻体重悬于PEG/盐双水相体系中，获得双水相藻体重悬液；
步骤二、反复冻融步骤一中所述的双水相藻体重悬液，获得微藻细胞破碎液，离心备用；
步骤三、待步骤二中的双水相体系分配平衡后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
步骤四、步骤三的藻胆蛋白提取液经纯化、透析除盐获得微藻藻胆蛋白。
根据本发明，所述高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，还包括如下步骤：
步骤A、采用羟基磷灰石柱纯化步骤三中所述的藻胆蛋白提取液，获得藻胆蛋白纯化液1；
步骤B、采用阴离子交换柱进一步纯化步骤A中所述的藻胆蛋白纯化液1，获得藻胆蛋白纯化液2；
步骤C、针对步骤B中所述的藻胆蛋白溶液2进行透析除盐，冷冻干燥获得微藻藻胆蛋白成品。
根据本发明，海洋微藻包括但不限于螺旋藻、红藻、隐藻。
根据本发明，步骤一的离心转速为4000-10000rpm，离心时间为5-10min。
根据本发明，步骤一所述的PEG/盐双水相体系为等体积的PEG/酒石酸钾钠体系，系线长为15-35％，藻体与PEG/盐双水相体系的体积比为0.2-0.4，pH为6.8-8.0。
优选的，所述的PEG/酒石酸钾钠体系，系线长为20％，藻体与PEG/盐双水相体系的体积比为0.3，pH为7.2。
根据本发明，所述步骤二中所述的冻融的次数优选为5-10次，冻融的操作步骤优选为-80至-20℃冷冻结冰，0-4℃融化完全。
优选的，所述步骤二中所述的冻融的次数优选为6-8次，冻融的操作步骤优选为-80至-20℃冷冻结冰，4℃融化完全。
根据本发明，所述步骤三中所述的双水相体系分配平衡步骤为：将微藻细胞破碎液于3-5℃静置1-5h，直至出现明显的分层。
进一步的，微藻细胞破碎液于4℃静置3h。
根据本发明，步骤A、采用羟基磷灰石柱纯化步骤三中所述的藻胆蛋白提取液，并进行梯度洗脱，获得藻胆蛋白纯化液1。
进一步，所述步骤A中所述的采用羟基磷灰石柱纯化步骤为：采用0.01M、pH为7.0、3-5倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的1/3-2/3，上样完毕后用含0.1-0.2M氯化钠、pH为6.5-7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为200-300cm/h。
根据本发明，所述阴离子交换柱为Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱。
根据本发明，所述步骤B中所述采用阴离子交换柱进一步纯化的步骤为：配置Tris-HCl缓冲液Buffer A、Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集洗脱液；用盐溶液清洗离子交换柱，然后用碱溶液反向冲洗；所述Tris-HCl缓冲液的pH为6-6.8，电导率为4-8μs/cm；Tris-HCl-NaCl缓冲液的pH为5-6.8，电导率为4-8.5μs/cm。
根据本发明，所述步骤C的具体透析步骤为：置于截留量为100-300KDa的透析袋中，并用0.01-0.02M、pH为6.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12-15h。
作为本发明的第二个方面，一种藻胆蛋白，采用上述所述的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法制备获得。
本发明的高效分离纯化海洋微藻藻胆蛋白的方法，其有益效果：
(1)传统提取工艺常常采用微藻干粉，而本发明直接以新鲜微藻藻泥作为原料，极大程度降低了干燥工艺带来的高能耗和高成本，在绿色环保的基础上，可进一步降低生产成本。
(2)不同于传统先破碎后初纯的藻胆蛋白分离纯化方法，本发明采用冻融法破碎双水相藻体重悬液，可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化，可简化分离纯化步骤，有效提高回收率。
(3)本发明采用的冻融-双水相一步提取初纯方法，提取工艺简单，成本低，适用于藻胆蛋白的大规模工业化生产。
(4)本发明采用的海洋微藻藻胆蛋白分离纯化方法，操作温度低，可有效保障藻胆蛋白的生物活性不受破坏。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步说明。实施例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例的藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白的吸光度用紫外-可见分光光度仪检测，藻蓝蛋白纯度计算依据公式P1＝A620/A280，别藻蓝蛋白纯度计算依据公式P2＝A650/A280，藻红蛋白纯度计算依据公式P3＝A565/A280，藻蓝蛋白浓度计算依据公式[PC]＝(A620-0.7×A650)/7.38，别藻蓝蛋白浓度计算依据公式[APC]＝(A650-0.19×A620)/5.65，藻红蛋白浓度计算依据公式[PE]＝(A565-2.8×[PC]-1.34×[APC])/12.7，其中:A280、A565、A620、A650分别为波长280、565、620、650nm处的吸光度。
以下实施例采用的阴离子交换柱为Agarosix FF-DEAE阴离子交换柱。所述阴离子交换柱的介质为粒径为50-150μm，交联度为6％的琼脂糖凝胶组成；优选地，粒经为90μm；所述琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，琼脂糖凝胶的结构是稳定的，可以在许多条件下使用(如水，pH为4-9范围内的盐溶液)；琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
实施例1
(1)取新鲜螺旋藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min，获得藻体；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融6次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例1的试验数据见表1。
表1实施例1的实验数据
实施例2
(1)取新鲜螺旋藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至1×107cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-80℃反复冻融8次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例2的试验数据见表2。
表2实施例2的实验数据
实施例3
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融6次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH为7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例3的试验数据见表3。
表3实施例3的实验数据
溶液名称
B-PE浓度(mg/L)
光谱学纯度
藻胆蛋白提取液
124
2.43
藻胆蛋白纯化液1
102
3.24
藻胆蛋白纯化液2
82
3.75
藻胆蛋白溶液
77
4.02
实施例4
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至1×107cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-80℃反复冻融8次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例4的试验数据见表4。
表4实施例4的实验数据
溶液名称
B-PE浓度(mg/L)
光谱学纯度
藻胆蛋白提取液
137
2.16
藻胆蛋白纯化液1
128
2.96
藻胆蛋白纯化液2
94
4.12
藻胆蛋白溶液
82
4.22
依据上述实施例1-实施例4的结果，采用上述方法可制得的藻蓝蛋白纯度＞4，别藻蓝蛋白纯度＞4，藻红蛋白纯度＞4，可满足试剂级要求。
实施例5
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融4次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例5的试验数据见表5。
表5实施例5的实验数据
溶液名称
B-PE浓度(mg/L)
光谱学纯度
藻胆蛋白提取液
76
1.99
藻胆蛋白纯化液1
61
2.52
藻胆蛋白纯化液2
35
3.12
藻胆蛋白溶液
27
3.86
实施例6
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至1×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融6次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例6的试验数据见表6。
表6实施例6的实验数据
溶液名称
B-PE浓度(mg/L)
光谱学纯度
藻胆蛋白提取液
18
1.87
藻胆蛋白纯化液1
15
2.34
藻胆蛋白纯化液2
/
/
藻胆蛋白溶液
/
/
实施例7
(1)取新鲜紫球藻藻液于离心管，将藻液按比例用水稀释至5×106cells/mL；4000rpm离心10min，弃上清；沉淀使用去离子水清洗一次，4000rpm离心10min；将藻体重悬于等体积的PEG/酒石酸钾钠体系中，其系线长为20％，体积比为0.3，pH为7.2，获得双水相藻体重悬液；
(2)将步骤(1)中所述双水相藻体重悬液，于-20℃反复冻融4次，于4℃融化完全，获得微藻细胞破碎液，10000rpm离心10min备用；
(3)将微藻细胞破碎液于4℃静置3h，待双水相系统出现明显的分层后取上相，即为初步纯化的藻胆蛋白提取液；
(4)采用0.01M、pH为7.0、4倍柱体积的磷酸盐缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱，平衡后，将初步纯化的藻胆蛋白提取液上样至平衡好的羟基磷灰石柱，上样量为柱床体积的2/3，上样完毕后用含0.2M氯化钠、pH为7.2的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，磷酸盐缓冲液的浓度梯度分别为0.02、0.05、0.1M，pH＝7.0，洗脱线速度为300cm/h，获得藻胆蛋白纯化液1；
(5)配置pH为6.8，电导率为6μs/cm的Tris-HCl的缓冲液Buffer A、pH为6.8，电导率为8.5μs/cm的Tris-HCl-NaCl缓冲液Buffer B，过滤；用1个柱体积的去离子水洗泵，5个柱体积的Buffer A缓冲液平衡离子交换柱；将2.5个柱体积的藻胆蛋白纯化液1直接上样，Buffer B梯度洗脱，收集45-100％pH为6.0、电导率为4μs/cm的Tris-HCl-NaCl洗脱液，获得藻胆蛋白纯化液2；
(6)置于截留量为100KDa的透析袋中，并用0.01M、pH为6.5的磷酸盐缓冲溶液作为透析液透析12h，脱盐后的溶液再进行8000rpm离心30min，获得藻胆蛋白溶液。
实施例7的试验数据见表7。
表7实施例7的实验数据
溶液名称
B-PE浓度(mg/L)
光谱学纯度
藻胆蛋白提取液
76
1.99
藻胆蛋白纯化液1
61
2.52
藻胆蛋白纯化液2
35
3.12
藻胆蛋白溶液
27
3.86
依据上述实施例5-7的试验结果，采用上述方法可制得的藻蓝蛋白纯度＞3，别藻蓝蛋白纯度＞3，藻红蛋白纯度＞3，可满足药品级要求。
综上所述，本发明以新鲜海洋微藻为原料，通过冻融-双水相提取初纯法，可一步实现藻体的破碎与藻胆蛋白的初步纯化，进一步联合柱层析可制备高纯度藻胆蛋白，与传统层析法工艺相比，提取工艺简单，成本低，适用于藻胆蛋白的大规模工业化生产。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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