阅读说明：本技术 一种n-15标记的微囊藻毒素及其生产方法 (N-15 labeled microcystin and production method thereof ) 是由 吴振兴 高春蕾 刘金丽 刘红兵 于 2019-08-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种N-15标记的微囊藻毒素及其生产方法,其生产方法包括以下步骤：微囊藻的清洗：选用处于对数生长期的微囊藻作为藻种,采用去离子水对藻种进行悬浮清洗,离心后收集藻体,清洗次数至少2次；微囊藻的培养：将清洗干净的微囊藻接种到带有N-15的专用培养基中,并置于光下培养,光强约2500-5000LUX,温度为25-28℃,每天摇匀培养瓶1-5次,培养10-30天,得到培养液；微囊藻毒素的提取：对培养液中的微囊藻细胞进行裂解处理,离心收集上清液,得到微囊藻毒素粗提液。本发明的生产方法简单易操作,制备的微囊藻毒素的N-15标记率高,作为标准品使用降低基质效应,定量更准确,相比现有非标微囊藻毒素,具有更好的应用前景。(The invention discloses an N-15 marked microcystin and a production method thereof, wherein the production method comprises the following steps: cleaning the microcystis: selecting microcystis in logarithmic growth phase as algae seeds, performing suspension cleaning on the algae seeds by using deionized water, centrifuging, and collecting algae for at least 2 times; culturing microcystis: inoculating the cleaned microcystis into a special culture medium with N-15, culturing under light with light intensity of 2500-; extracting microcystin: and (3) cracking the microcystis cells in the culture solution, centrifuging and collecting supernatant to obtain crude microcystin extract. The production method is simple and easy to operate, the prepared microcystins have high N-15 labeling rate, the matrix effect is reduced when the microcystins are used as standard substances, the quantification is more accurate, and the method has better application prospect compared with the existing non-standard microcystins.)

一种N-15标记的微囊藻毒素及其生产方法

技术领域

本发明涉及微囊藻毒素的生产方法技术领域，尤其涉及一种N-15标记的微囊藻毒素及其生产方法。

背景技术

微囊藻(Microcystis aeruginosa)是形成蓝藻“淡水水华”的优势藻种。其适应能力强，繁殖速度快，产生的微囊藻毒素(Microcystis)主要为LR、RR、YR等，是一类具生物活性的单环七肽，可以在水生浮游动物和鱼类体内富集，当藻细胞破裂死亡后毒素会直接释放到水体中，人类通过饮用被污染的水源或食用水生动物会诱发肝损伤甚至肝癌等疾病，这就需要快速、高效、精确的提取并检测水源和食物中微囊藻毒素含量，以保障饮食健康。因此生产高纯度，高稳定性的微囊藻毒素标准品已刻不容缓，既是亟需克服的技术难题也具有重大经济意义。

近年来，国内市场的微囊藻毒素标准品因种类少，纯度低，稳定性不高很难满足精准检测的需求，而进口标准品的价格偏高，供求不平衡，并且尚未出现同位素标记的微囊藻毒素内标产品。在质谱检测过程中，同位素内标可以降低基质效应，使定量更加准确，同时同位素内标可以作为参照标准物质评定提取和处理过程及检测过程的效率，是普通标准品所不能替代的。因此，有必要研究一种简单，高效和低成本的生产同位素标记微囊藻毒素的方法，促进同位素内标产品产业化的快速发展，创造更高的技术价值和经济价值。

目前微囊藻中微囊藻毒素分子的合成途径尚不明确，分子中C、H、O的来源复杂，若以这三种元素的同位素标记藻毒素，成本较高，且过程不可控，而培养基中氮源相对单一。目前尚未见关于同位素标记的微囊藻毒素内标产品及其生产的报道。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种N-15标记的微囊藻毒素及其生产方法，所述微囊藻毒素的生产方法步骤简单、同位素标记可控，制备的N-15标记的微囊藻毒素的产量和标记率高。

本发明提供了以下技术方案：

一种N-15标记的微囊藻毒素的生产方法，其包括以下步骤：

S1.微囊藻的清洗：选用处于对数生长期的微囊藻作为藻种，采用去离子水对藻种进行悬浮清洗，离心后收集藻体；清洗次数为3-5次；

S2.微囊藻的培养：将清洗干净的微囊藻接种到带有N-15的专用培养基中，并置于光下培养，光强约2500-5000LUX，每天摇匀培养瓶2次，培养10-30天，得到培养液；

S3.微囊藻毒素的提取：对培养液中的微囊藻细胞进行裂解处理，离心收集上清液，得到微囊藻毒素粗提液。

优选地，S2步骤中，所述专用培养基包括以下浓度的大量元素组分和微量元素组分：

大量元素组分包括：N-15标记的氮源0.1-1.8g/L、KH₂PO₄ 20-50mg/L、KCl20-40mg/L、MgSO₄·7H₂O 50-100mg/L、CaCl₂·2H₂O 20-50mg/L、柠檬酸4-8mg/L、FeCl₃ 4-6mg/L、Na₂CO₃ 10-30mg/L；

微量元素组分包括：H₃BO₃ 1.5-3.0mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.5-2.5mg/L、ZnSO4·7H₂O0.1-0.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.5mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05-0.1mg/L、CoCl₂·6H₂O0.03-0.06mg/L；

其余为溶剂ddH₂O。

上述专用培养基中，不仅提供微囊藻生长繁殖所必需的N、P、K、Mg、Ca、Fe等大量营养成分，以及多种微量元素，并且大量元素与微量元素的所有成分中，除N-15标记的CH₄N₂O，无任何N元素在内，而唯一的氮源采用N-15标记，便于生产N-15标记的微囊藻毒素，这种氮源的同位素标记方法较为简单、可控，培养成本低、微囊藻毒素的同位素标记率高。

如利用C-13标记培养基中的含C化合物，并用C-13标记的CO₂作为培养过程中微囊藻的碳源，也可能会培养出C-13标记的微囊藻毒素，但是培养过程需严格防止空气(或空气中CO2)进入培养体系，此过程较难控制；另外培养基中的含碳化合物有多种，将其全部用C-13标记物来替代，培养成本将大幅增多；若只将大量元素用同位素替代(Na₂CO₃，CO₂)，不添加含其他C量少的化合物将会影响藻细胞的生长。其他几种元素H,O做同位素标记也会有类似问题。

优选地，所述N-15标记的氮源为以下N-15标记的各成分中的一种或几种的组合：CH₄N₂O 100-250μg/L、NaNO₃ 1.2-1.6g/L、KNO₃ 1.4-1.8g/L。

进一步地，所述专用培养基还包括N-15标记的其他含氮微量元素组分，优选地，所述N-15标记的其他含氮微量元素组分为柠檬酸铁铵5-8mg/L、EDTANa₂0.8-1.2mg/L、Co(NO₃)₂·5H₂O 0.04-0.08mg/L中的一种或多种。这样不仅能补充其他微量元素，进一步地优化专用培养基，并且还可以进一步地引入N-15同位素，提高培养基中N-15同位素的比重，提高微囊藻毒素的标记率。

其中，采用CH₄N₂O 100-250mg/L作为氮源最为优选，原因在于用N-15标记的CH₄N₂O，尿素中的N元素百分比含量较高，且易被植物吸收利用，有效降低同位素标记的微囊藻毒素的生产成本。

更优选地，专用培养基包括以下浓度的大量元素组分和微量元素组分：

大量元素组分包括：N-15标记的氮源CH₄N₂O 180-220mg/L、KH₂PO₄ 40-50mg/L、KCl30-40mg/L、MgSO₄·7H₂O 60-90mg/L、CaCl₂·2H₂O 35-50mg/L、柠檬酸5-7mg/L、FeCl₃ 5-6mg/L、Na₂CO₃ 15-25mg/L；

微量元素组分包括：H₃BO₃ 2.0-3.0mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.8-2.3mg/L、ZnSO4·7H₂O0.2-0.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.3-0.5mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.06-0.1mg/L、CoCl₂·6H₂O0.04-0.06mg/L。其余为溶剂ddH₂O。

优选地，微囊藻与专用培养基的接种比例为1:10-1:30。

优选地，微囊藻的培养过程中，以第一次转接得到的藻液作为藻种连续转接3-5次，以不断提高培养产物中微囊藻毒素浓度及毒素的N-15标记率。

优选地，所述裂解方法为高温处理或超声处理，其中，高温处理的条件为：100-110℃条件下，处理25-35min；超声处理的条件为：将培养液进行离心，收集藻细胞沉淀，向沉淀中加入适量水后，50-70℃下超声15-30min。

优选地，还包括微囊藻毒素的纯化步骤：

将微囊藻毒素粗提液进行真空旋转蒸发，通过吸附柱进行初步纯化，得到初纯液；

通过真空旋转蒸发将初纯液进行浓缩，将浓缩后的毒素初纯液通过HPLC进行再次纯化后，对产物进行浓缩和冷冻干燥后，得到高纯度的N-15标记的微囊藻毒素粉末。

本发明还提供一种N-15标记的微囊藻毒素，采用如上所述的生产方法制备得到。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明的生产方法简单易操作，有较强的实用性，适合产品的产业化生产。

2.本发明制备的微囊藻毒素的N-15标记率高，纯度高，作为标准品使用降低基质效应，定量更准确，相比现有非标微囊藻毒素，具有更好的应用前景。

3.本发明选用氮源作为同位素标记的元素，较其他营养元素具有容易操作，容易定量，培养成本低，且不抑制藻细胞生长的优点。

附图说明

图1为微囊藻毒素-LR的纯化后的HPLC-UV色谱图；

图2为微囊藻毒素-RR的纯化后的HPLC-UV色谱图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实验材料：

1、微囊藻：采用主要产MC-LR的铜绿微囊藻FACHB-315和主要产MC-RR的铜绿微囊藻FACHB-912为实验藻种，均购于中国科学院淡水藻种库；微囊藻毒素标准品采用：微囊藻毒素LR和微囊藻毒素RR，规格均为10μg/ml,购自北京万佳首化生物科技有限公司。

2、培养基：

(1)大量元素母液：N-15标记的CH₄N₂O 100-250g/L；KH₂PO₄ 20-50g/L；KCl20-40g/L；MgSO₄·7H₂O 50-100g/L；CaCl₂·2H₂O 20-50g/L；Citric acid 4-8g/L；FeCl₃4-6g/L；Na₂CO₃ 10-30g/L；以上各母液分开配制。各大量元素母液灭菌冷却后4℃保存，每种用量为1ml/L。

(2)微量元素母液配方如下：H₃BO₃ 1.5-3.0g/L；MnCl₂·4H₂O 1.5-2.5g/L；ZnSO4·7H₂O 0.1-0.3g/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.5g/L；CuSO₄·5H₂O 0.05-0.1g/L；CoCl₂·6H₂O 0.03-0.06g/L。以上各微量元素母液配好后，灭菌冷却4℃保存，每种用量1ml/L。

实施例1N-15标记的微囊藻毒素的生产

1、N-15标记的微囊藻毒素的生产方法，包括以下步骤：

S1.微囊藻的清洗：选用正常BG11培养基培养的处于对数生长期的微囊藻作为藻种，采用去离子水对藻种进行悬浮清洗，离心后收集藻体；清洗次数为3-5次，直至去除原培养基中的氮源和其他营养盐，收集微囊藻。

S2.微囊藻的培养：将清洗干净的微囊藻接种到带有N-15的专用培养基中，并置于光下培养，光强约4000LUX，每天摇匀培养瓶2次，培养10-30天，得到培养液；每周取样测定微囊藻毒素浓度及微囊藻毒素中N-15的标记率。

本实施例中，设置实验组A1-A6，每个实验组按照本实施例的上述方法培养微囊藻，专用培养基的接种比例为1:10，培养温度为25℃，光照强度为4000LUX，各个实验组的培养基配方如下：

(1)A1组和A4组的专用培养基配方如下：

大量元素组分包括：N-15标记的氮源CH₄N₂O 100mg/L、KH₂PO₄ 20mg/L、KCl20mg/L、MgSO₄·7H₂O 50mg/L、CaCl₂·2H₂O 20mg/L、柠檬酸4mg/L、FeCl₃ 4mg/L、Na₂CO₃ 10mg/L；

微量元素组分包括：H₃BO₃ 1.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 1.5mg/L、ZnSO4·7H₂O 0.1mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.2mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.03mg/L。

(2)A2组和A5组的专用培养基配方如下：

大量元素组分：N-15标记的CH₄N₂O 200mg/L、KH₂PO₄ 45mg/L、KCl 35mg/L、MgSO₄·7H₂O 70mg/L、CaCl₂·2H₂O 40mg/L、柠檬酸6mg/L、FeCl₃ 5mg/L、Na₂CO₃20mg/L；

微量元素组分：H₃BO₃ 2.5mg/L、MnCl₂·4H₂O 2mg/L、ZnSO4·7H₂O 0.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.4mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.08mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.05mg/L。

(3)A3组和A6组的专用培养基配方如下：

大量元素组分包括：N-15标记的氮源CH₄N₂O 250mg/L、KH₂PO₄ 50mg/L、KCl40mg/L、MgSO₄·7H₂O 100mg/L、CaCl₂·2H₂O 50mg/L、柠檬酸8mg/L、FeCl₃ 6mg/L、Na₂CO₃ 30mg/L；

微量元素组分包括：H₃BO₃ 3.0mg/L、MnCl₂·4H₂O 2.5mg/L、ZnSO4·7H₂O 0.3mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.1mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L。

对各实验组培养20天后的培养液的藻液浓度、毒素浓度进行测定，结果见下表一：

表一 不同专用培养基对微囊藻培养的影响

其他实施例中，可将上述浓度的CH₄N₂O替换成1.2-1.6g/L的NaNO₃、1.4-1.8g/L的KNO₃、5-8mg/L的柠檬酸铁铵、0.8-1.2mg/L的EDTANa₂、或0.04-0.08mg/L的Co(NO₃)₂·5H₂O。此外，上述氮源也可进行组合使用。

S3.微囊藻毒素的提取：对培养液中的微囊藻细胞进行高温处理，条件为：105℃条件下，处理30min；离心收集上清液，得到微囊藻毒素粗提液。

其他实施例中，可采用超声波处理：收集培养液，4000rpm离心10min，去上清，得藻细胞沉淀，然后加入适量的ddH₂O，在60℃下超声20min，6000rpm再离心8min，上清液作为微囊藻毒素的粗提液。

测试实施例2

(1)按照下表二的条件设置多个实验组，采用实施例1中A2的专用培养基，按照本实施例1的方法制备和初步提取得到微囊藻毒素粗提液，并对培养20天后的培养液藻液浓度、毒素浓度进行测定，结果见表二。

表二 不同培养条件对微囊藻毒素的影响

MC-LR/MC-RR浓度的检测方法为：采用HPLC检测，检测波长为238nm。色谱条件:色谱柱为Thermo公司C18(150mm*2.1mm，3um)，柱温35℃，进样量25微升，流动相为水:甲醇(40:60)。

微囊藻毒素在238nm波长处有特异吸收峰，不同的微囊藻毒素异构体在HPLC中有不同的保留时间，与标准微囊藻毒素的保留时间相比较，可确定样品中微囊藻毒素的组成，依据出峰面积，计算样品中微囊藻毒素的含量。

MC-LR/MC-RR中N-15标记率的测定方法为：利用HPLC-MS，采用ESI在正/负离子扫描模式下对N-15标记MC-RR和N-15标记MC-LR进行扫描，根据不同微囊藻毒素分子在质谱条件下的特征质荷比m/z及母离子片段和保留时间进行定性分析，然后通过峰面积加和的形式得到每种微囊藻毒素的总标记量，进而计算每种毒素的N-15标记率。

具体操作方法参照出入境检验检疫行业标准SN/T 4319-2015，其中具体采用的两种同位素标记的微囊藻毒素的定性离子对和定量离子对参见下表三：

表三 定性离子对和定量离子指标

化合物	母离子(m/z)	定量子离子(m/z)	定性子离子(m/z)
				N-15-微囊藻毒素-LR	1006	135.1	127.2
N-15-微囊藻毒素-RR	533	135.1	103.1

(2)按照实施例最佳实验组2和实验组7的培养条件，设置实验组11-16，分别以第一次培养得到的藻液作为藻种，转接不同次数的培养基进行扩大培养后，分别测定粗提液中藻液浓度、毒素MC-LR/RR的浓度、以及同位素标记率进行测定，测定结果如下表四：

表四 转接次数对微囊藻毒素浓度和标记率的影响

根据表四的结果可知：微囊藻的培养过程中，以第一次培养得到的藻液作为藻种连续转接多次，能够不断提高培养产物中微囊藻毒素浓度及毒素的N-15标记率。

实施例3微囊藻毒素的纯化

(1)初步纯化：将转接3次之后的微囊藻毒素粗提液(原MC-LR/RR的浓度分别为1.89±0.16ppm和1.36±0.04ppm)在40℃条件下进行真空旋转蒸发，通过吸附柱进行初步纯化，得到初纯液。本实施例选用D101大孔树脂做填料对粗提液进行初步纯化，步骤如下：

A.吸附柱的预处理：溶胀(95％乙醇)过夜的1000g大孔吸附树脂装入底部用6层纱布堵塞的100mm*1000mm层析柱；

B.用1000ml 95％乙醇润洗柱子2次；

C.用1000ml ddH₂O润洗柱子4次；

D.藻毒素粗提液的上样；

E.洗脱步骤：依次分别用1000ml ddH₂O洗脱2次，1000ml 20％乙醇洗脱2次，1000ml 60％乙醇洗脱8次。

(2)再次纯化：将上一步得到的微囊藻毒素的初纯液在40℃条件下进行真空旋转蒸发，进行浓缩；将浓缩后的初纯液用HPLC方法进行纯化，纯化条件如下：

柱温:室温；检测波长:238nm；

流速:1ml/min(分析柱)，20ml/min(制备柱)；

流动相为水:甲醇的体积比为：45:55。

色谱柱类型和型号为：Bondapak^TM C₁₈制备柱(19mm*300mm)

得到的纯化色谱图分别见图1和图2。接着收集目的馏分，通过旋转蒸发除去甲醇后，再经冷冻干燥获得纯品固体粉末，即高纯度的N-15标记的微囊藻毒素粉末。

微囊藻毒素粉末的纯度测定：

将微囊藻毒素粉末作为样品，经甲醇复溶后配制成一定量浓度的溶液，在相同液质条件下测定峰面积，与标准品峰面积做对比，计算出所配溶液的真实浓度，真实浓度与所配样品浓度的比值即为所测藻毒素的纯度。测纯度经与微囊藻毒素标准品相对比，N-15标记的微囊藻毒素粉末的纯度可达96-98％。

N-15标记的微囊藻毒素粉末的全标标记率为：

实际检测结果为MC-LR：52.34％±2.41％；MC-RR：62.96％±0.03％。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。