具体实施方式

通过AEA和2-AG在体内CB1和/或CB2受体调节的幅度和持续时间相对较短，大概是由于涉及内源性大麻素失活蛋白的快速灭活过程，AEA和2-AG主要被脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰基甘油脂肪酶(MAGL)水解。FAAH和MAGL是丝氨酸水解酶并且已知它们的抑制作用增加内源性大麻素配体(包括AEA和2-AG)的水平。由AEA和/或2-AG水平增加引起的大麻素受体激活水平增加已在急性和慢性疼痛模型以及许多其他动物模型(例如抑郁症、焦虑症、炎症、脑外伤、多发性硬化症、癌症和青光眼))中显示镇痛作用(参见例如Nomura，Life Sci.2013，92(8-9)，492；和Mallet，Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.2016；54(7)，498)。

因此，本申请提供经由施用本文所述的化合物来增加内源性大麻素配体水平的替代方法。

化合物

本申请尤其提供式I的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

L¹是CO或PO₂；

X¹选自C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC(O)OC_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、和C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选地被OH或CO₂取代；

X²是C_1-6亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

Y¹选自O、S和NR⁵；

R¹是C_1-10烷基；

R²选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代；

每个R³独立地选自H和C_1-6烷基；

R⁴选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代；和

R⁵选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代。

在一些实施方案中，式I的化合物不是选自以下的化合物：

在一些实施方案中，式I的化合物是式VI化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

L¹是CO或PO₂；

X¹选自C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)OC_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，和C_1-4亚烷基-OC(O)NH-C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH或CO₂取代；

X²是C_1-6亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-10烷基；

R²选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代；和

每个R³独立地选自H和C_1-6烷基。

在一些实施方案中，式I或式VI的化合物是式VIa的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

L¹是CO或PO₂；

X¹选自C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)OC_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，和C_1-4亚烷基-OC(O)NH-C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH或CO₂取代；

X²是C_1-6亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-10烷基；

R^2A是H或CH₂CO₂；

R^2B是H或CO₂；和

每个R³独立地选自H和C_1-6烷基。

在一些实施方案中，式I的化合物是式VII化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

L¹是CO或PO₂；

X¹选自C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)OC_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，和C_1-4亚烷基-OC(O)NH-C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH或CO₂取代；

X²是C_1-6亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-10烷基；

R²选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代；和

每个R³独立地选自H和C_1-6烷基。

在一些实施方案中，式I或式VII的化合物是式VIIa的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

L¹是CO或PO₂；

X¹选自C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)OC_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，和C_1-4亚烷基-OC(O)NH-C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH或CO₂取代；

X²是C_1-6亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-10烷基；

R^2A是H或CH₂CO₂；

R^2B是H或CO₂；和

每个R³独立地选自H和C_1-6烷基。

在一些实施方案中，式I的化合物是式Ia化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

L¹是CO或PO₂；

X¹选自C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)OC_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、和C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选地被OH或CO₂取代；

X²是C_1-6亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

Y¹选自O、S和NR⁵；

R¹是C_1-10烷基；

R^2A是H或CH₂CO₂；

R^2B是H或CO₂；

每个R³独立地选自H和C_1-6烷基；

R⁴选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代；和

R⁵选自H和C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被OH或CO₂取代。

在一些实施方案中，式I、式Ia、式VII或式VIIa的化合物不是：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述化合物为式Ia化合物或其药学上可接受的盐，条件是当R^2A为H时，则R^2B是CO₂且R⁴不是羟甲基。

在一些实施方案中，L¹是CO。在式I-Ia、VI-VIa和VII-VIIa的一些实施方案中，L¹是PO₂。

在一些实施方案中，X¹选自CH₂、CH₂OC(O)OC_1-4亚烷基、CH₂OC(O)C_1-4亚烷基、CH₂OC_1-4亚烷基、CH₂OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基和CH₂-OC_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH取代。

在一些实施方案中，X¹选自C_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC(O)OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC(O)C_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基、和C_1-4亚烷基-OC_1-4亚烷基-OC(O)C _1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH或CO₂取代。

在一些实施方案中，X¹选自CH₂、CH₂OC(O)OC_1-4亚烷基、CH₂OC(O)C_1-4亚烷基、CH₂OC_1-4亚烷基、CH₂OC_1-4亚烷基OC_1-4亚烷基，CH₂-OC_1-4亚烷基OC(O)C_1-4亚烷基，和C_1-4亚烷基-OC(O)NH-C_1-4亚烷基，其中每个C_1-4亚烷基任选被OH取代。

在一些实施方案中，X¹选自CH₂、CH₂OC(O)OCH₂CH₂、CH₂OC(O)OCH₂CH(OH)CH₂、CH₂OC(O)CH₂CH₂CH₂、CH₂OC(O)CH₂CH₂、CH₂OCH(CH₃)、CH₂OCH(CH₃)OCH₂CH(OH)CH₂、CH₂OCH(CH₃)OCH₂CH₂、CH₂OCH(CH₃)OC(O)CH₂和CH₂OC(O)NHCH₂CH₂。

在一些实施方案中，X¹选自CH₂、CH₂OC(O)OCH₂CH₂、CH₂OC(O)OCH₂CH(OH)CH₂、CH₂OC(O)CH₂CH₂CH₂、CH₂OC(O)CH₂CH₂、CH₂OCH(CH₃)、CH₂OCH(CH₃)OCH₂CH(OH)CH₂、CH₂OCH(CH₃)OCH₂CH₂和CH₂OCH(CH₃)OC(O)CH₂。在一些实施方案中，X¹是CH₂OC(O)OCH₂CH₂、CH₂OC(O)OCH₂CH(OH)CH₂、CH₂OC(O)CH₂CH₂CH₂、CH₂OC(O)CH₂CH₂、CH₂OCH(CH₃)、CH₂OCH(CH₃)OCH₂CH(OH)CH₂、CH₂OCH(CH₃)OCH₂CH₂和CH₂OCH(CH₃)OC(O)CH₂。在一些实施方案中，X¹是CH₂。

在一些实施方案中，X²是C_1-3亚烷基，其任选地被OH或CO₂取代。在一些实施方案中，X²是C_1-3亚烷基，其为任选取代的CO₂。在一些实施方案中，X²选自CH₂、CHCH₃和CH₂CO₂。在一些实施方案中，X²是CH₂或CH₂CO₂。

在一些实施方案中，Y¹是O或NR⁵。在一些实施方案中，Y¹是NR⁵。在一些实施方案中，R⁵是H或C_1-3烷基。在一些实施方案中，Y¹是NH。在一些实施方案中，Y¹是O。

在一些实施方案中，R¹是C_1-6烷基。在一些实施方案中，R¹是C_1-3烷基。在一些实施方案中，R¹是丙基。

在一些实施方案中，R²选自H和任选被OH或CO₂取代的C_1-3烷基。在一些实施方案中，R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基。在一些实施方案中，R²选自H、CHCH₃和CH₂CO₂。在一些实施方案中，R²是H或CH₂CO₂。

在一些实施方案中，每个R³独立地选自H和C_1-3烷基。在一些实施方案中，每个R³是H。在一些实施方案中，每个R³是独立选择的C_1-3烷基。在一些实施方案中，每个R³是C_1-3烷基，其中每个R³是相同的基团。在一些实施方案中，每个R³是甲基或乙基。在一些实施方案中，每个R³是甲基。在一些实施方案中，每个R³是乙基。

在一些实施方案中，R⁴选自H和任选被OH或CO₂取代的C_1-3烷基。在一些实施方案中，R⁴选自H和任选被OH取代的C_1-3烷基。在一些实施方案中，R⁴是H或羟甲基。

在一些实施方案中：

L¹是CO或PO₂；

X¹是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

Y¹是O或NR⁵；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被OH或CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基；

R⁴选自H和任选被OH或CO₂取代的C_1-3烷基；和

R⁵选自H或C_1-3烷基。

在一些实施方案中：

L¹是CO或PO₂；

X¹是C_1-4亚烷基；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

Y¹是O或NH；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基；

R⁴选自H和任选被OH取代的C_1-3烷基。

在一些实施方案中：

L¹是PO₂；

X¹是C_1-4亚烷基；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

Y¹是NH；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基；

R⁴选自H和任选被OH取代的C_1-3烷基。

在一些实施方案中：

L¹是CO；

X¹是C_1-4亚烷基；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

Y¹是O；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基；

R⁴选自H和任选被OH取代的C_1-3烷基。

在一些实施方案中：

L¹是CO或PO₂；

X¹是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被OH或CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基。

在一些实施方案中：

L¹是CO或PO₂；

X¹是C_1-4亚烷基；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基。

在式VI或式VIa的一些实施方案中：

L¹是PO₂；

X¹是C_1-4亚烷基；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基。

在式VII或式VIIa的一些实施方案中：

L¹是CO；

X¹是C_1-4亚烷基；

X²是C_1-3亚烷基，其任选被OH或CO₂取代；

R¹是C_1-6烷基；

R²选自H和任选被CO₂取代的C_1-3烷基；

每个R³独立地选自H和C_1-3烷基。

在一些实施方案中，式I或式VI的化合物是式II的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中变量L¹、X²、R²和R³根据本文提供的式I和式VI化合物的定义来定义。

在一些实施方案中，式I或式VI的化合物是式III的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中变量X²、R²和R³根据本文提供的式I和式VI化合物的定义来定义。

在一些实施方案中，式I或式VII的化合物是式IV的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中变量L¹、X²、R²和R³根据本文提供的式I和式VII化合物的定义来定义。

在一些实施方案中，式I或式VII的化合物是式V的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中变量X²、R²和R³根据本文提供的式I和式VII化合物的定义来定义。

在一些实施方案中，式I的化合物选自：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，式I的化合物选自：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，式I或式VI化合物选自：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，式I或式VII的化合物选自：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，式Ia或式VIa化合物选自：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，式I或式VI的化合物是：

或其药学上可接受的盐。

合成

应当理解，本文提供的化合物，包括其盐，可以使用已知的有机合成技术制备并且可以根据多种可能的合成路线中的任一种合成。

本文提供的化合物可以例如根据方案1-2中所示的一般程序，使用适当取代的起始材料来制备。

方案1

方案2

本领域技术人员将理解，所描述的方法不是可以合成本文提供的化合物的唯一手段，并且合成有机反应的广泛库可用于潜在地用于合成本文提供的化合物。本领域技术人员知道如何选择和实施合适的合成路线。起始材料、中间体和产物的合适合成方法可参考文献确定，包括参考来源，例如：Advances in Heterocyclic Chemistry，第1-107卷(Elsevier，1963-2012)；Journal of Heterocyclic Chemistry，第1-49卷(Journal ofHeterocyclic Chemistry，1964-2012)；Carreira等人(编辑)，Science of Synthesis，第1-48卷(2001-2010)和Knowledge Updates KU2010/1-4；2011/1-4；2012/1-2(Thieme，2001-2012)；Katritzky等人(编辑)Comprehensive Organic Functional GroupTransformations，(Pergamon Press，1996)；Katritzky等人(编辑)；ComprehensiveOrganic Functional Group Transformations II(Elsevier，第2版，2004)；Katritzky等人(编辑)，Comprehensive Heterocyclic Chemistry(Pergamon Press，1984)；Katritzky等人，Comprehensive Heterocyclic Chemistry II(Pergamon Press，1996)；Smith等人，March's Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第6版，(Wiley，2007)；Trost等人(编辑)，Comprehensive Organic Synthesis(Pergamon Press，1991)。

本文所述的化合物的制备可涉及各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可以容易地确定保护和脱保护的需要以及适当保护基团的选择。保护基团的化学性质可以例如发现在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley&Sons，Inc.，New York(1999)中。

可以根据本领域已知的任何合适的方法监测反应。例如，产物形成可以通过光谱方法，例如核磁共振光谱(例如，^1h或¹³C)、红外光谱、分光光度法(例如，UV-可见光)、质谱法，或通过色谱方法例如高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)或薄层色谱(TLC)监测。本领域技术人员可以通过多种方法纯化化合物，包括高效液相色谱(HPLC)和正相硅胶色谱。

在本说明书的不同地方，描述二价连接取代基。每个二价连接取代基特别意在包括连接取代基的正向和反向形式。例如，-NR(CR'R”)_n-包括-NR(CR'R”)_n-和-(CR'R”)_nNR-。在结构明确需要连接基团的情况下，为该基团列出的马库什变量被理解为连接基团。

如本文所用，短语“任选取代”是指未被取代或被取代。如本文所用，术语“取代的”是指氢原子被去除并被取代基取代。应当理解，给定原子上的取代受化合价的限制。

在整个定义中，术语“C_nm”表示包括端点的范围，其中n和m是整数并且表示碳数。实例包括C_1-4、C_1-6等。

如本文所用，单独使用或与其他术语组合使用的术语“C_n-m亚烷基”是指具有n至m个碳的二价烷基连接基团。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、乙-1,2-二基、丙-1,3-二基、丙-1,2-二基等。在一些实施方案中，亚烷基部分含有1至6、1至3或1至2个碳原子。

如本文所用，单独使用或与其他术语组合使用的术语“C_n-m烷基”是指可以是直链或支链的、具有n至m个碳的饱和烃基。烷基部分的实例包括但不限于化学基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；高级同系物，例如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。在一些实施方案中，烷基含有1至6个碳原子、1至4个碳原子、1至3个碳原子或1至2个碳原子。

如本文所用，术语“化合物”意在包括所示结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。除非另有说明，本文通过名称或结构标识为一种特定互变异构形式的化合物旨在包括其他互变异构形式。

本文提供的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式源于单键与相邻双键的交换以及质子的伴随迁移。互变异构形式包括质子互变异构体，它们是具有相同经验公式和总电荷的异构质子化状态。质子互变异构体实例包括酮-烯醇对、酰胺-亚氨酸对、内酰胺-内酰胺对、烯胺-亚胺对以及其中质子可以占据杂环系统的两个或多个位置的环状形式，例如1h-和3H-咪唑，1h-、2H-和4h-1,2,4-三唑，1h-和2H-异吲哚，以及1h-和2H-吡唑。互变异构形式可以处于平衡状态或通过适当的取代在空间上锁定为一种形式。

所有化合物及其药学上可接受的盐可以与其他物质例如水和溶剂(例如水合物和溶剂化物)一起发现或可以被分离。

在一些实施方案中，化合物的制备可涉及加入酸或碱以影响例如所需反应的催化或盐形式例如酸加成盐的形成。

示例性酸可以是无机或有机酸并且包括但不限于强酸和弱酸。一些示例性酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、4-硝基苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸、三氟乙酸和硝酸。一些弱酸包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸、酒石酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸。

示例性碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾和碳酸氢钠。一些示例性强碱包括但不限于氢氧化物、醇盐、金属酰胺、金属氢化物、金属二烷基酰胺和芳胺，其中醇盐包括甲基、乙基和叔丁基氧化物的锂盐、钠盐和钾盐；金属氨化物包括氨化钠、氨化钾和氨化锂；金属氢化物包括氢化钠、氢化钾和氢化锂；并且金属二烷基酰胺包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、三甲基甲硅烷基和环己基取代的酰胺的锂、钠和钾盐。

在一些实施方案中，本文提供的化合物和盐基本上是隔离的。“基本上隔离”是指化合物至少部分或基本上与其形成或检测的环境隔离。部分分离可以包括例如富含本文提供的化合物的组合物。基本上分离可以包括含有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99重量％的本文提供的化合物或其盐。隔离化合物及其盐的方法是本领域的常规方法。

如本文所用，术语“室温”或“RT”是本领域所理解的，并且通常指大约为进行反应的房间温度的温度(例如，反应温度)，例如约20℃至约30℃的温度。

本文所述的化合物可以是不对称的(例如具有一个或多个立体中心)。除非另有说明，否则所有立体异构体，例如对映异构体和非对映异构体都是预期的。含有不对称取代碳原子的本发明化合物可以光学活性或外消旋形式隔离。如何从光学活性非活性起始材料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，例如通过外消旋混合物的拆分或立体选择性合成。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，并且所有这些稳定的异构体都包括在本发明中。描述本发明的化合物的顺式和反式几何异构体并且可以将其隔离为异构体的混合物或分离的异构体形式。

化合物的外消旋混合物的拆分可以通过本领域已知的多种方法中的任一种进行。一个示例性方法包括使用手性拆分酸进行分级重结晶，该酸是光学活性的、成盐的有机酸。用于分级重结晶方法的合适拆分剂是例如光学活性酸，例如D和L形式的酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或各种光学活性樟脑磺酸，例如β-樟脑磺酸。适用于分级结晶方法的其他拆分剂包括立体异构纯形式的α-甲基苄胺(例如S和R形式，或非对映体纯形式)、2-苯基甘氨醇、去甲麻黄碱、麻黄碱、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1,2-二氨基环己烷等。

外消旋混合物的拆分也可以通过在填充有光学活性拆分剂(例如，二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上洗脱来进行。合适的洗脱溶剂组成可由本领域技术人员确定。

本文提供的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式源于单键与相邻双键的交换以及质子的伴随迁移。互变异构形式包括质子互变异构体，它们是具有相同经验公式和总电荷的异构质子化状态。互变异构形式可以处于平衡状态或通过适当的取代在空间上锁定为一种形式。

本文所用的短语“药学上可接受的”是指那些在合理医学判断范围内适合与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。

本申请还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。本申请的药学上可接受的盐包括母体化合物的例如由无毒的无机或有机酸形成的常规无毒盐。本申请的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇)或乙腈(MeCN)。合适的盐的列表被发现在Re mington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页和Journal ofPharmaceutical Science，66，2(1977)。制备盐形式的常规方法例如描述于Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use，Wiley-VCH，2002。

使用方法

本申请进一步提供治疗受试者的疾病或病症的方法。如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，包括哺乳动物。示例性受试者包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马、灵长类动物和人。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，该方法包括向受试者(例如，有需要的受试者)施用治疗有效量的本文提供的化合物(例如，式I的化合物)或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，疾病或病症选自疼痛、疼痛相关疾病或病症、情绪疾病或病症、中枢神经系统的疾病或病症、光学疾病或病症、癌症、胃肠疾病或病症、肾病或病症、肾相关疾病或病症、心血管疾病或病症以及皮肤疾病或病症。

在一些实施方案中，疾病或病症是疼痛或疼痛相关疾病或病症。在一些实施方案中，疼痛或疼痛相关疾病或病症选自急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、炎性疼痛、癌痛、纤维肌痛、类风湿性关节炎、骨关节炎、手术相关的疼痛，和骨质疏松症。

在一些实施方案中，疾病或病症是情绪疾病或病症。在一些实施方案中，情绪疾病或病症选自：焦虑、抑郁、睡眠障碍、饮食失调、创伤后应激障碍、药物或酒精戒断症状、精神分裂症、强迫症、双相情感障碍、性功能障碍、注意力缺陷障碍(ADD)和注意力缺陷多动障碍(ADHD)。

在一些实施方案中，疾病或病症是中枢神经系统的疾病或病症或光学疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是中枢神经系统的疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是光学疾病或病症。在一些实施方案中，中枢神经系统的疾病或病症或光学疾病或病症选自：脱髓鞘疾病、青光眼、年龄相关性黄斑变性(AMD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、认知障碍、阿尔茨海默病、运动障碍、亨廷顿舞蹈病、图雷特综合症、尼曼-皮克病、帕金森病、癫痫、脑血管疾病，以及脑损伤。

在一些实施方案中，脱髓鞘疾病选自多发性硬化症(MS)、视神经脊髓炎(NMO)、Devic病、中枢神经系统神经病、脑桥中央髓鞘溶解症、梅毒性脊髓病、白质脑病、脑白质营养不良、格林-巴利综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗髓鞘相关糖蛋白(MAG)周围神经病、Charcot-Marie-Tooth疾病、周围神经病、脊髓病、视神经病、进行性炎性神经病、视神经炎和横贯性脊髓炎。

在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，癌症选自：白血病、套细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、皮肤癌、肾癌和肺癌

在一些实施方案中，疾病或病症是胃肠疾病或病症。在一些实施方案中，胃肠道疾病或病症选自：炎症性肠病、胃食管反流病、麻痹性肠梗阻、分泌性腹泻、胃溃疡、恶心、呕吐和肝脏疾病。

在一些实施方案中，肝脏疾病选自：急性肝功能衰竭、Alagille综合症、肝炎、肝脏肿大、吉尔伯特综合症、肝囊肿、肝血管瘤、脂肪肝疾病、脂肪性肝炎、原发性硬化性胆管炎、片形吸虫病、原发性胆汁性肝硬化、Budd-Chiari综合症、血色病、威尔森氏病和甲状腺素运载蛋白-相关的遗传性淀粉样变性。

在一些实施方案中，疾病或病症是肾病或病症或肾相关疾病或病症。在一些实施方案中，肾脏疾病或病症或肾脏相关疾病或病症选自：糖尿病、糖尿病肾病、急性炎性肾损伤、肾缺血尿失禁和膀胱过度活动症。

在一些实施方案中，疾病或病症是皮肤疾病或病症。在一些实施方案中，皮肤疾病或病症是牛皮癣或狼疮。

在一些实施方案中，疾病或病症是心血管疾病或病症。在一些实施方案中，心血管疾病或病症选自心血管疾病、血管炎症、特发性肺纤维化，和高血压。

本申请进一步提供用于本文所述的任何方法中的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。

本申请进一步提供本文所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于本文所述的任何方法的药物中的用途。

如本文所用，短语“治疗有效量”是指引发被研究人员、兽医、医生或其他临床医生在组织、系统、动物、个体或人中寻求的生物或医学反应的活性化合物或药剂的量。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以下中的一种或多种：(1)抑制疾病；例如，抑制正在经历或显示疾病、症状或病症的病理学或症状学的个体中的疾病、症状或病症(即阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；和(2)改善疾病；例如，改善正在经历或显示疾病、症状或病症的病理学或症状学的个体的疾病、症状或病症(即，逆转病理学和/或症状学)，例如降低疾病的严重性或减少或减轻疾病的一种或多种症状。

联合疗法

一种或多种另外的治疗剂例如化学治疗剂、麻醉剂(例如，用于与外科手术组合使用)或用于治疗本文提供的疾病或病症的其他药剂可以与本文提供的化合物和盐组合使用。

示例性麻醉剂包括但不限于局部麻醉剂(例如利多卡因、普鲁卡因、罗哌卡因)和全身麻醉剂(例如地氟烷、安氟烷、氟烷、异氟烷、甲氧基氟烷、一氧化二氮、七氟烷、mmobarbital、美索比妥、硫阿米妥、硫喷妥、地西泮、劳拉西泮、咪达唑仑、依托咪酯、氯胺酮、丙泊酚、阿芬太尼、芬太尼、瑞芬太尼、丁丙诺啡、布托啡诺、氢吗啡酮左啡诺、哌替啶、美沙酮、吗啡、纳布啡、羟吗啡酮和喷他佐辛)。

在一些实施方案中，另外的治疗剂与本文提供的化合物或盐同时施用。在一些实施方案中，在施用本文提供的化合物或盐之后施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，在施用本文提供的化合物或盐之前施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，本文提供的化合物或盐在外科手术期间施用。在一些实施方案中，本文提供的化合物或盐在外科手术期间与另外的治疗剂组合施用。

药物制剂

当用作药物时，本文提供的化合物和盐可以药物组合物的形式施用。这些组合物可以如本文或别处所述制备，并且可以通过多种途径施用，这取决于需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部的(例如，透皮、表皮、眼部和粘膜，包括鼻内、阴道和直肠递送)、肺(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过雾化器；气管内或鼻内)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内肌内或注射或输注；或颅内(例如，鞘内或心室内施用)。肠胃外施用可以是单次推注剂量的形式，或可以是，例如通过连续灌注泵。在一些实施方案中，本文提供的化合物(例如，式I的化合物)适合于肠胃外施用。在一些实施方案中，本文提供的化合物(例如，式I的化合物)适用于静脉内施用。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或合乎需要的。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物适合于肠胃外施用。在一些实施方案中，本文提供的组合物适用于静脉内施用。

还提供药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的本文提供的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)。在制备本文提供的组合物时，活性成分通常与赋形剂混合、被赋形剂稀释或封装在例如胶囊、小袋、纸或其他容器形式的此类载体中。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料，用作活性成分的赋形剂、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、香囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液和无菌包装粉剂的形式。

合适的赋形剂的一些实例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂可以另外包括但不限于润滑剂如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；调味剂或其组合。

实施例

将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相同的结果的各种非关键参数。整个实施例中描述的分析方法根据以下程序进行：

LC-MS–方法A

LC-MS–方法B

LC-MS–方法C

LC-MS–方法D

LC-MS–方法E

LC-MS–方法F

PREP-HPLC方法A

PREP-HPLC方法B

PREP-HPLC方法C

PREP-HPLC方法D

PREP-HPLC方法E

PREP-HPLC方法F

MS/MS调谐参数

附加MS/MS参数

中间体12-羟乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

步骤1. 2-(苄氧基)乙-1-醇

在0℃下向在THF(50mL)中搅拌的NaH溶液(1.93g，80.645mmol，1.0当量)加入乙二醇(5g，80.645mmol，1.0当量)，接着加入催化量的TBAI(100mg)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，并且然后在室温搅拌1h。然后在0℃下将苄基溴(13.7mL，80.645mmol，1.0当量)逐滴加到反应混合物中。然后将反应在25℃下搅拌。反应混合物用冷水(250mL)猝灭并用EtOAc(3×250mL)萃取。合并的有机层用无水Na₂SO₄干燥并真空浓缩。获得的粗产物(9g)经由硅胶色谱纯化，使用30％EtOAc/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为淡黄色油状物(2.5g)。¹HNMR(CDCl₃)：δ7.38-7.30(m，5H)，4.56(s，2H)，3.78-3.74(m，2H)，3.61-3.59(m，2H)，2.06(t，J＝6.4Hz，1H)。

步骤2. 2-(苄氧基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

在-10℃下向在氯仿(10mL)中搅拌的2-(苄氧基)乙-1-醇(1g，6.535mmol，1当量)的溶液中加入Et₃N(1.18mL，8.169mmol，1.25当量)，然后加入POCl₃(0.78mL，8.169mmol，1.25当量)。然后将反应混合物在25℃下搅拌1h。在1h后，加入吡啶(2.5mL，56.208mmol，8.6当量)，接着在-10℃下加入胆碱甲苯磺酸酯((2.6g，9.803mmol，1.5当量)，并且将反应物在25℃下搅拌18h。然后将反应物冷却至0℃，并用水(5mL)淬灭，并用DCM(3×50mL)萃取。水层通过快速色谱纯化(方法：柱：Biotage-C18，60g30μm；流动相：(ACN:水+0.1％TFA)；B％：B％：0-8％，0-20min/8％20-45min)，冻干纯级分以获得标题化合物，作为无色液体(1.1g)。[M+H]⁺(m/z)：318.4；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.34-7.28(m，5H)，4.46(s，2H)，4.25(bs，2H)，4.04(bs，2H)，3.64(bs，2H)，3.52(bs，2H)，3.03(s，9H)。³¹P NMR：δ-2.23。

步骤3. 2-羟乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

在25℃下向在IPA(3mL)中搅拌的2-(苄氧基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(300mg，0.946mmol，1.0当量)溶液加入10％Pd/C(50％湿)(50mg)。然后将反应混合物在25℃下在氢气压力下搅拌18h。通过硅藻土垫过滤反应混合物，用IPA洗涤，并将所得滤液浓缩至干燥。真空干燥所得粗残留物，得到标题化合物，为无色液体(200mg)。[M+H]⁺(m/z)：227.5；¹H NMR(CD₃OD)：4.32-4.28(m，2H)，3.96-3.92(m，2H)，3.70(t，J＝4.8Hz，2H)，3.65-3.63(m，2H)，3.22(s，9H)。³¹P NMR：δ-0.17。

中间体2. 3-羟丙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

步骤1. 3-(苄氧基)丙-1-醇

在0℃下向在THF(50mL)中搅拌的NaH(1.5g，65.703mmol，1.0当量)溶液加入丙烷-1,3-二醇(5g，65.703mol，1.0当量)，然后加入催化四丁基碘化铵(TBAI；100mg)。然后将反应混合物在0℃下搅拌10min，然后在室温搅拌1h。然后在0℃下将苄基溴(7.8mL，65.703mol，1.0当量)逐滴加到反应混合物中。将反应混合物在25℃下搅拌18h，然后用冰水(250mL)淬灭，并用EtOAc(3X 250mL)萃取。合并的有机层用无水Na₂SO₄干燥并浓缩至干燥。获得的粗残留物(11g)通过硅胶色谱纯化，使用30％EtOAc/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为淡黄色液体(4.6g)。¹H NMR(CDCl₃)：δ7.37-7.27(m，5H)，4.52(s，2H)，3.79(q，J＝11.2，5.6Hz，2H)，3.66(t，J＝6Hz，2H)，2.26(t，J＝5.6Hz，1H)，1.90-1.84(m，2H)。

步骤2. 3-(苄氧基)丙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

在-10℃下向在氯仿(10mL)中搅拌的3-(苄氧基)丙-1-醇(1g，5.988mmol，1当量)的溶液中加入Et₃N(1.05mL，7.485mmol，1.25当量)，接着加入POCl₃(0.699mL，7.485mmol，1.25当量)。将反应混合物在25℃下搅拌1h。在-10℃下将吡啶(2.5mL，51.496mmol，8.6当量)和甲苯磺酸胆碱(2.47g，8.982mmol，1.5当量)加到反应混合物中，并将反应在25℃下搅拌。在18h后，将反应混合物冷却至0℃，加入水(5mL)，并用DCM(3×20mL)萃取该混合物。水层通过快速色谱纯化(方法：柱：Biotage-C18，60g30μm；流动相：(CAN:水+0.1％TFA]；B％：B％：0-8％，0-20min/8％20-45min)。冻干纯级分，得到标题化合物，为无色液体(430mg)。[M+H]⁺(m/z)：332.4；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.36-7.25(m，5H)，5.55(bs，4H)，4.44(s，2H)，4.28(bs，2H)，4.01(q，J＝12.8，6.4Hz，2H)，3.60(bs，2H)，3.57(t，J＝6Hz，2H)，3.09(s，9H)，1.94-1.88(m，2H)。³¹P NMR：δ-2.28。

步骤3. 3-羟丙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

在25℃下向在IPA(1mL)中搅拌的3-(苄氧基)丙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(100mg，0.302mmol，1.0当量)溶液加入10％Pd/C(50％湿)(10mg)。将反应混合物在25℃下在氢气压力下搅拌18h，通过硅藻土垫过滤，并用IPA洗涤。然后浓缩滤液，减压干燥所得粗残留物，得到标题化合物(60mg)，作为无色液体(60mg)。[M+Na]⁺(m/z)：264.1；¹H NMR(CD₃OD)：4.26(bs，2H)，3.98(q，J＝12.4，6Hz，2H)，3.67(t，J＝6Hz，2H)，3.64-3.61(m，2H)，3.22(s，9H)，1.86-1.79(m，2H)。³¹P NMR：δ-0.03。

中间体3. 2-氨基乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

步骤1.(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯

在0℃下向在DCM(1.5L)中搅拌的2-氨基乙-1-醇(50g，0.819mol，1.0当量)溶液逐滴加入Et₃N(137mL，0.983mol，1.2当量)。将反应混合物在0℃下搅拌10min，并且在10min后，在0℃下将氯甲酸苄酯(Cbz-Cl；50％；302mL，1.064mol，1.2当量)逐滴加到反应混合物中。然后将反应物在0℃下搅拌3小时，并通过薄层色谱法(TLC)监测。然后用水(500mL)淬灭反应混合物并用DCM(3X 500mL)萃取。然后用无水Na₂SO₄干燥总有机层，过滤并浓缩以获得粗(200g)化合物，将其通过硅胶柱色谱纯化，使用3％MeOH/DCM梯度洗脱以获得(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯(95g)，为白色固体。Mass[m/z]：196.09[M+H]⁺。产量：95g(59.7％)。

步骤2. 2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

在-10℃下向在氯仿(100mL)中搅拌的(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯(5g，25.641mmol，1当量)溶液加入Et₃N(5.5mL，38.461mmol，1.5当量)，然后加入POCl₃(2.65mL，28.205mmol，1.1当量)。然后将反应混合物在25℃下搅拌1h，并通过TLC监测。在1h后，在-10℃下加入吡啶(17.5mL，220.512mmol，8.6当量)和甲苯磺酸胆碱(10.55g，38.461mmol，1.5当量)，并在25℃下搅拌所得混合物18h。然后将反应物冷却至0℃，用水(20mL)淬灭，并用DCM(3X100mL)萃取。水层通过快速色谱法纯化[柱：Biotage-C18，60g30μm；流动相：[ACN:水+0.1％TFA]；B％：B％：0-8％，0-20min/8％20-45min.]以获得2-((((苄氧基)羰基)氨基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(2.4g)，作为无色液体。Mass[m/z]：361.01[M+H]⁺。产量：2.4g(26％)。

步骤3. 2-氨基乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐

在25℃下向在异丙醇(IPA；20mL)搅拌的2-((((苄氧基)羰基)氨基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(2.3g，0.638mmol，1.0当量)溶液加入10％Pd/C(50％湿；500mg)。将反应混合物在25℃下在氢气压力下搅拌18h。所得混合物通过硅藻土垫过滤并用IPA洗涤。将滤液浓缩并真空干燥，得到2-氨基乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(1.6g)，作为无色液体。产物无需进一步纯化即可用于以下实施例中。Mass[m/z]：227.5[M+H]⁺。产量：1.6g(93％)。

实施例1(5Z,8Z,11Z,14Z)-N-(2-羟乙基)二十碳-5,8,11,14-四烯酰胺(化合物2；花生四烯乙醇胺)

在室温下向在CH₂Cl₂(100mL)中的搅拌的花生四烯酸(化合物1)(5g，1.64mmol，1.0当量)溶液分批加入DMAP(2.0g，1.64mmol，1.0当量)和HOBT(1.1g，0.82mmol，0.5当量)。在0℃下搅拌反应混合物。在搅拌30min后，在0℃下将EDCI.HCl(9.45g，4.93mmol，3.0当量)加入反应混合物中；然后将混合物升温至室温并继续搅拌3小时。接着，逐滴加入乙醇胺(5.0mL，8.22mmol，5.0当量)并将反应混合物在室温下搅拌16h。反应混合物用水(200mL)猝灭并用DCM(2×300mL)萃取。合并的有机层依次用2N HCl(150mL)和氯化钠溶液(150mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。所得残留物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯:己烷(15:85)作为洗脱剂进一步纯化，得到作为淡黄色液体的花生四烯乙醇胺(化合物2)(3.8g)。[M+H]⁺(m/z)：348.2；¹H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.94(bs，0.8H)，5.44-5.30(m，8H)，3.73-3.71(m，2H)，3.44-3.35(m，2H)，2.85-2.79(m，6H)，2.22(t，J＝7.6Hz，2H)，2.10-2.03(m，4H)，1.77-1.69(m，3H)，1.39-1.24(m，7H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。

实施例2. 2-(5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基乙基2-(三甲基胺基)乙基磷酸盐(化合物3；花生四烯乙醇胺-PC)

向在无水CH₂Cl₂(30mL)中搅拌的花生四烯乙醇胺溶液(化合物2)(2.5g，7.20mmol，1.0当量)加入三乙胺(1.5mL，10.8mmol，1.5当量)，然后逐滴加入POCl₃(0.72mL，7.92mmol，1.1当量，在1mL CH₂Cl₂中)，并将所得混合物在-78℃下搅拌30min。在-78℃下加入无水吡啶(4.9mL，61.9mmol，8.6当量)和甲苯磺酸胆碱(2.85g，10.8mmol，1.5当量)并将混合物在室温下搅拌16h。将反应混合物冷却至0℃，用水(20mL)淬灭并搅拌1h，然后用10％MeOH/DCM(2×50mL)萃取。合并的有机层用无水硫酸钠干燥并过滤。在减压下浓缩溶剂以提供粗残留物，将其溶解在DCM(50mL)中并用MeOH:H₂O(1:1，32mL)，接着3％Na₂CO₃/MeOH(1:1，20mL)，接着MeOH:H₂O(1:9，30mL)洗涤。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，并与异丙醇(2mL)共蒸馏至干燥。将所得残留物在丙酮(55mL)中研磨约30min，过滤并在25-30℃下减压浓缩以获得部分纯材料，将其溶解在EtOH(55mL)中并过滤以除去不溶性颗粒。滤液用30mLAmberlite MB树脂处理。在搅拌4h后，将溶剂过滤并浓缩，得到粗产物，将其通过PREP-HPLC(色谱柱：LUNA-C18，250x21.2mm，1.6μm；流动相：\[CH₃CN：水]；B％：80％-50％，22min；50％-90％35min)以获得花生四烯乙醇胺-PC(化合物3)(170mg)，作为浅棕色固体。[M+H]⁺(m/z)：513.2；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.35(bs，1H)，5.34-5.28(m，8H)，4.03-4.02(m，2H,)，3.67-3.62(m，2H)，3.52-.3.49(t，J＝4.8Hz，2H)，3.16-3.12(m，11H)，2.82-2.77(m，6H)，2.08-2.00(m，6H)，1.59-1.50(m,2H)，1.32-1.24(m，6H)，0.860(t，J＝6.8Hz，3H)。¹³C-NMR(100MHz，DMSO-d₆)：δ172.27，130.42，129.92，128.59，128.50，128.46，128.26，128.16，128.00，65.94，63.07，63.01，58.77，58.72，53.57，35.38，31.35，29.18，27.08，26.81，25.72，25.67，22.44，14.40。³¹P-NMR(161.9MHz，DMSO-d₆)：δ-0.27。

实施例3. 2-铵乙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐(化合物4)

步骤1. 2((((苄氧基)羰基)氨基)乙基(2((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)磷酸盐

在-10℃下向在氯仿(20mL)中搅拌的(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯(1g，5.128mmol，1当量)溶液加入Et₃N(1.1mL，7.692mmol，1.5当量)，然后加入POCl₃(0.52mL，5.641mmol，1.1当量)。然后将反应混合物在25℃下搅拌1h，然后在-10℃下加入吡啶(3.6mL，44.102mmol，8.6当量)和N-Boc乙醇胺(1.23g，7.692mmol，1.5当量)。将反应混合物在25℃下搅拌18h。然后将混合物冷却至0℃，加入水(20mL)，并用二氯甲烷(DCM；3×30mL)萃取该混合物。有机层浓缩并通过快速色谱纯化柱纯化：Biotage-C18，30g 30μm；流动相：ACN:水+0.015％NH₄HCO₃；min/B％：0/0，5/5，30/5，35/14，55/14，58/100。将纯级分冻干以提供作为灰白色固体的标题化合物(200mg)。[M-H]⁺(m/z)：417.2；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ7.69(br s，1H)，7.38-7.27(m，5H)，7.09(br s，1H)，4.99(s，2H)，3.72-3.57(m，4H)，3.14-3.10(m，2H)，3.05-3.01(m，2H)，1.36(9H)。³¹P NMR(400MHz，DMSO-d₆)：0.14。

步骤2. 2-氨基乙基(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)磷酸盐

在25℃下向在异丙醇(IPA；2mL)中搅拌的2(((苄氧基)羰基)氨基)乙基(2((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)磷酸盐(50mg，0.119mmol，1.0当量)溶液加入10％Pd/C(50％湿)(15mg)。将反应混合物在25℃下在氢气气氛下搅拌2h，并通过硅藻土垫过滤，并用IPA(5mL)洗涤。将滤液浓缩并真空干燥，得到作为灰白色固体的标题产物(40mg，粗品)，其无需纯化即可用于下一步骤。[M+H]⁺(m/z)：285.2；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.36(br s，2H)，6.96(br s，1H)，3.87-3.79(m，2H)，3.68-3.60(m，2H)，3.10-3.02(m，2H)，2.97-2.92(m，2H)，1.37(s，9H)。³¹P NMR(400MHz，DMSO-d₆)：0.82。

步骤3. 2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐

向在DMF(2mL)中的搅拌的花生四烯酸(43mg，0.141mmol，1.0当量)溶液加入HATU(64mg，0.167mmol，1.2当量)并搅拌30min。在30min后，在25℃下将DIPEA(0.07mL，0.424mmol，3.0当量)和2-氨基乙基(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙基)磷酸盐(40mg，0.141mmol，1.0当量)加到反应混合物中。在室温下搅拌该混合物18h。然后在减压下蒸发溶剂以提供粗固体，其不经纯化即用于下一步骤。[M+H]⁺(m/z)：571.5。

步骤4. 2-铵乙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐

在0℃下向在DCM(2mL)中搅拌的2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐(48mg，0.084mmol，1.0当量)溶液加入三氟乙酸(TFA；0.2mL)，然后在25℃下搅拌2h。在起始材料完成后，减压蒸发反应混合物，得到粗品2-铵乙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐(35mg)。粗固体通过PREP-HPLC方法-B纯化为灰白色固体(3.7mg)：LUNA-C18，250X 21.2mm，5μm；流动相：ACN:水+HCOOH(0.1％)；B％：80％，15min 95％，30min。[M+H]⁺(m/z)：471.4。¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.36(s，2H)，8.10(s，1H)，5.44–5.22(m，5H)，3.85-3.79(m，2H)，3.66-3.64(m，2H)，3.18(q，J＝5.6Hz，2H)，2.95(s，2H)，2.83-2.75(m，4H)，2.07–1.99(m，5H)，1.57-1.49(m，2H)，1.35–1.24(m，7H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)。³¹P NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ1.0

实施例4. 2-铵基-2-羧甲基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐(化合物5)

步骤1. 2-((((苄氧基)羰基)氨基)乙基(3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基)磷酸盐

在-10℃下向在氯仿(20mL)中搅拌的(2-羟乙基)氨基甲酸苄酯(1g，5.128mmol，1.0当量)溶液加入Et₃N(1.1mL，7.692mmol，1.5当量)，然后加入POCl₃(0.52mL，5.641mmol，1.1当量)。然后将反应混合物在25℃下搅拌1h。在-10℃下加入吡啶(3.6mL，44.102mmol，8.6当量)和Boc-L-丝氨酸叔丁酯(2g，7.692mmol，1.5当量)并且将混合物在25℃下搅拌18h。然后将反应混合物冷却至0℃，并加入水(20mL)。混合物用DCM(3x30mL)萃取，并且有机层浓缩并通过快速色谱法纯化(柱：Biotage-C18，30g30μm；流动相：乙腈:水+0.015％NH_{4 h}CO₃；min./B％：0/0、30/5、35/20、50/20、55/100)。冻干纯级分，得到标题产物(220mg)，作为灰白色固体。[M-H]⁺(m/z)：517.2；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ7.94-7.89(m，1H)，7.64-7.58(m，1H)，7.39-7.27(m，5H)，7.09(bs，3H)，4.99(s，2H)，3.88-3.78(m，3H)，3.67-3.58(m，2H)，3.16-3.08(m，2H)，1.42-1.32(m，18h)。³¹P NMR(400MHz，DMSO-d₆)：0.66。

步骤2. 2-氨基乙基(3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基)磷酸盐

在25℃下向在IPA(2mL)中搅拌的2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基(3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基)磷酸盐(50mg，0.096mmol，1.0当量)加入10％Pd/C(50％湿)(15mg)。将反应混合物在25℃下在氢气气氛下搅拌2h。通过硅藻土垫过滤反应混合物，用IPA(5mL)洗涤，浓缩滤液并真空干燥，得到标题化合物(22mg)，为灰白色固体。[M+H]⁺(m/z)：385.3；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.23(bs，2H)，3.95-3.81(m，5H)，2.97-2.93(m，2H)，1.44-1.35(m，18h)。³¹P NMR(400MHz，DMSO-d₆)：1.09。

步骤3. 3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐

向在DMF(1mL)中的搅拌的花生四烯酸(18mg，0.059mmol，1.0当量)溶液加入HATU(26mg，0.071mmol，1.2当量)并搅拌30min。接下来，DIPEA(0.03mL，0.177mmol，3.0当量)和2-氨基乙基(3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基)磷酸盐(22mg，0.059mmol，1.0当量)在25℃下加到反应混合物中。将所得混合物在25℃下进一步搅拌18h。然后在减压下浓缩反应物质并且粗固体3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐(63mg)无需任何进一步纯化即可用于下一步。[M+H]⁺(m/z)671.5。

步骤4.2-铵基-2-羧甲基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐

在0℃下向在DCM(50mL)中搅拌的3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧代丙基(2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙基)磷酸盐(63mg，0.094mmol，1.0当量)溶液中加入TFA(0.15mL)，并且将混合物在25℃下搅拌18h。然后将反应混合物在减压下浓缩并经由PREP-HPLC方法-C纯化粗固体(40mg)(Gemini C18,250x21.2x5μm、1.6μm；流动相：ACN/0.1％甲酸水溶液；min./B％：0/10、15/70、30/95)。将所得级分冻干以提供作为灰白色固体的标题化合物(7mg)。[M+H]⁺(m/z)：515.4；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.05(t，J＝5.6Hz，1H)，5.39-5.29(m，8H)，4.09-4.03(m，2H)，3.70-3.64(m，2H)，3.18(q，J＝5.6Hz，2H)，2.84-2.74(m，6H)，2.10-1.99(m，6H)，1.55-1.51(m，2H)，1.35-1.24(m，6H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)。³¹P NMR(400MHz，DMSO-d₆)：0.18

实施例5. 2-((((2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙氧基)羰基)氧基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(化合物6)

在0℃下向在6mL DCM中搅拌的化合物2溶液(实施例1；100mg，0.2873mmol，1.0当量)加入吡啶(45μL，0.5747mmol，2.0当量)，然后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(69mg，0.344mmol，1.2当量)，并在25℃下将反应混合物搅拌6h。然后将反应混合物真空浓缩至干燥。将得到的粗制残留物在25℃下溶解在DMF(2mL)，并且加入DMAP(45mg，0.3735mmol，1.3当量)，接着加入中间体1(65mg，0.2873mmol，1.0当量)。然后将反应混合物在相同温度下搅拌18h。然后用IPE(20mL)稀释反应混合物，并且倾析溶剂以获得粗固体(130mg)，根据PREP-HPLC方法-D将其纯化：Gemini-C18，250X21.2mm，5.0μm；流动相：(乙腈:水+HCOOH(0.1％))；B％：30％，20min 75％，25min 95％)以获得标题化合物，作为浅棕色固体(3.8mg)。[M+H]⁺(m/z)：601.5；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.22(t，J＝5.6Hz，1H)，5.39-5.27(m，8H)，4.16(t，J＝4.4Hz，2H)，4.07(t，J＝5.2Hz，2H)，4.05-3.98(m，2H)，3.84-3.77(m，2H)，3.49(t，J＝4.8，2H)，3.31-3.26(m，2H)，3.12(s，9H)，2.83-2.74(m，6H)，2.08(t，J＝7.6，2H)，2.05-1.97(m，4H)，1.57-1.49(m，2H)，1.35-1.22(m，6H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)。³¹P-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ-1.10

实施例6. 3-((((2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙氧基)羰基)氧基)丙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(化合物7)

在0℃下向在5mL DCM中搅拌的化合物2溶液(实施例1；100mg，0.287mmol，1.0当量)加入吡啶(46μL，0.574mmol，2.0当量)，然后加入4-硝基苯基氯甲酸酯(69mg，0.344mmol，1.2当量)，并将反应在25℃下搅拌6h。然后将反应混合物真空浓缩至干燥。将得到的粗残留物在25℃下溶解在DMF(2mL)中，并且加入DMAP(45mg，0.373mmol，1.3当量)，接着加入中间体2(69mg，0.287mmol，1.0当量)，并随后在相同温度下搅拌18h。然后用IPE(20mL)稀释反应混合物，并且倾析溶剂以获得粗固体(150mg)，根据PREP-HPLC方法-E将其纯化：Gemini-C18，250X 21.2mm，5.0μm；流动相：(ACN:水+HCOOH(0.1％)；B％：70％，20min20％)以得到作为浅棕色固体的标题化合物(8mg)。[M+H]⁺(m/z)：615.5；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.24(t，J＝5.6Hz，1H)，5.37-5.31(m，8H)，4.13(t，J＝6.4Hz，2H)，4.06(t，J＝5.2Hz，2H)，4.01(bs，2H)，3.68(q，J＝6.4Hz，2H)，3.49(t，J＝4.4Hz，2H)，3.31-3.25(m，2H)，3.12(s，9H)，2.85-2.74(m，6H)，2.08(t，J＝7.2Hz，2H)，2.06-1.97(m，4H)，1.83-1.77(m，2H)，1.58-1.48(m，2H)，1.35-1.21(m，6H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)。³¹P-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ-0.90

实施例7. 2-((((2-((5Z,8Z,11Z,14Z)-二十碳-5,8,11,14-四烯酰氨基)乙氧基)羰基)氨基)乙基(2-(三甲铵基)乙基)磷酸盐(化合物8)

在0℃下向在5mL DCM中搅拌的化合物2溶液(实施例1；100mg，0.287mmol，1.0当量)加入吡啶(46μL，0.574mmol，2.0当量)，然后加入4-硝基氯甲酸苯酯(69mg，0.344mmol，1.2当量)。将混合物在25℃下搅拌6h并真空浓缩至干燥。将粗残留物溶解在DMF(2mL)中并在25℃下加入DMAP(45mg，0.373mmol，1.3当量)，然后加入中间体3(64mg，0.287mmol，1.0当量)，并在相同温度下搅拌18h。然后将反应混合物用IPE(20mL)稀释，倾析溶剂得到粗固体(150mg)。根据PREP-HPLC方法-F纯化粗固体：Gemini-C18，250X21.2mm，5.0μm；流动相：(ACN:水+HCOOH(0.1％)；B％：60％，20min 30％，25min 5％)得到标题化合物，作为淡棕色固体(10mg)。[M+H]⁺(m/z)：600.5；¹H-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ8.02(t，J＝5.6Hz，1H)，7.459(t，J＝5.2Hz，1H)，5.39-5.28(m，8H)，4.02(bs，2H)，3.91(t，J＝6.0Hz，2H)，3.69-3.62(m，2H)，3.52-3.47(m，2H)，3.21(q，J＝5.6Hz，2H)，3.12(s，9H)，3.11-3.07(m，2H)，2.83-2.74(m，6H)，2.11-1.97(m，6H)，1.57-1.48(m，2H)，1.36-1.22(m，7H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)。³¹P-NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ-0.31

可以使用与方案1-2和/或本文提供的实施例中描述的那些程序类似的程序，使用适当取代的起始材料来制备以下化合物。

实施例8体外Mfsd2a转运

方法

该测定用制备的HEK293细胞以低通量6孔格式进行，并且然后用含有hMfsd2a野生型(WT)版本、D97A突变版本或作为对照的空载体的质粒在重复孔中转染。通过薄层色谱(TLC)和超高效液相色谱联用质谱法评估细胞吸收。

细胞转染

HEK293细胞以每6孔6.25X10⁵接种在2mL具有10％FBS和1％青霉素-链霉素(P/S)培养基(Sigma)的DMEM中，并在37℃下在5％CO₂中孵育过夜。第二天早上检查细胞的汇合。基于每个孔，产生以下脂质混合物；将6μL Lipofecta mine 2000逐滴加到200μL OptiMEM中，在室温(RT)下静置5min。1μg hMfsd2a WT、D97A或空质粒在200μL OptiMEM中为每孔适当地制备；然后将OptiMEM溶液中的Lipofecta mine 2000逐滴添加至400μL的总体积(这可以缩放以支持待测定的孔/板的数量)。然后将该转染制剂在室温下孵育20分钟。将具有10％FBS且无P/S培养基的DMEM加热至37℃，更换HEK293板培养基，并且然后将用1mL具有10％FBS无P/S培养基的温热DMEM、1.6mL具有10％FBS无P/S培养基的温热DMEM洗涤的细胞加到每个孔。然后将400μL转染制剂适当逐滴加到每个孔中，并以圆周运动轻轻旋转板。然后将板在37℃下在5％CO₂中孵育过夜。

化合物孵育和分析样品的制备

化合物储备溶液在PBS溶液中的12％BSA中制备，使得40μL加入2mL普通DMEM中将产生50μM的测试化合物浓度(化合物处理的培养基)。将在PBS中的12％BSA中剩余的化合物储备溶液在-20℃下冷冻以进行培养基稳定性测试。从培养箱中取出HEK293 6孔板，并且用1mL已预热至37℃的普通DMEM轻轻冲洗孔。然后将2mL化合物处理的培养基加到每个孔中。对化合物处理的培养基的100μL样品取样以代表T＝0h的样品；将5μL该样品(剩余部分保留并冷冻以备需要重新分析)用45μL DMEM稀释，并用50μL MeCN冲入密封并保存在冰上的96孔板中。然后将HEK293 6孔板在37℃下在5％CO₂中孵育1h，然后将板从培养箱中取出并且从每个孔中取出100μL培养基样品以代表T＝1h样品；5μL该样品(剩余部分保留并冷冻以备需要重新分析)用45μL DMEM稀释，并用50μL MeCN冲入重新密封并储存在-20℃的96孔板中。然后从HEK293 6孔板中取出剩余的培养基，用1mL 0.5％BSA的DMEM轻轻冲洗孔两次，然后取出培养基并使6孔板在室温下完全干燥。将1mL的3:2己烷:异丙醇(HIP)加到通风橱中的每个孔中，并使板在室温下在不摇动的情况下静置30min。然后将HIP溶液转移到2mLEppendorf管中，并用第二份1mL HIP等分试样重复该过程，并将两等分试样合并。然后在氮气流下干燥HIP样品。

薄层色谱(TLC)分析

硅胶板在通风橱中通过首先在距离板底边缘1.5cm处画线并且然后绘制宽度为1cm且道间间隔为0.5cm的样品道制备。磷脂的TLC缓冲液制备为甲醇:氯仿:氢氧化铵的31:62:7溶剂混合物。板在含有200mL TLC缓冲液的潮湿室中预运行直到溶剂前沿距板边缘1.5cm，然后让板干燥。按上述方法制备的HIP样品在50μL氯仿中重构，短暂涡旋3次，然后保存在冰上。通过用移液器吸头轻轻划线将样品(连同参考化合物)加载到板上，让样品在划线之间干燥。在样品加载完成后，将板在含有上述TLC缓冲液的密封潮湿室中运行约1.5小时或直到溶剂前沿几乎到达板顶部。从室中取出板并干燥。初始图像使用Bio-Rad Imagelab 6.0拍摄。将碘晶体加到新的密封室，使碘蒸气浸透容器，然后将板暴露到室中的碘蒸气中，使不饱和脂肪酸的带可视化，一旦板被显影，第二图像使用Bio-Rad Image lab 6.0拍摄。然后将板风干以除去碘。然后使用喷雾瓶用乙酸铜溶液使板饱和，乙酸铜溶液由在水溶液中组成的按重量计3％的乙酸铜、按体积计8％的磷酸组成。使板在室温下干燥5min，然后在通风橱中使用热风枪加热以使带更明显。使用Bio-Rad Image lab 6.0获取最终图像。将从hMfsd2a(WT)或D97A转染的HEK293细胞产生的带之间的强度差异与空载体(EV)转染的细胞比较，允许吸收到由hMfsd2a驱动的细胞中，以根据参考(REF)进行识别。TLC分析的结果示于图1A-7B。

图1A-1B分别显示来自如上针对化合物3所述的碘和乙酸铜染色的TLC图像–左起道：参考化合物，来自WT细胞的HIP样品，用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物3的带在WT细胞中显示更高的强度，从而证实该化合物经由Mfsd2a转运。

图2A-2B对应于如上针对化合物4所述的TLC图像，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物4的带在WT细胞中显示更高的强度，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图3A-3B对应于如上针对化合物5所述的TLC图像，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物5的带在WT细胞中显示更高的强度，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图4A-4B对应于如上针对化合物6所述的TLC图像，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物6的带在WT细胞中显示更高的强度，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图5A-5B对应于如上针对化合物7所述的TLC图像，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物7的带在WT细胞中显示更高的强度，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图6A-6B对应于如上针对化合物8所述的TLC图像，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物8的带在WT细胞中显示更高的强度，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图7A-7B对应于如上针对化合物20所述的TLC图像，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，对应于化合物20的带在WT细胞中的强度没有显著差异。因此，无法确认该化合物是否通过该方法经由Mfsd2a转运。

实施例9体外Mfsd2a转运

UPLC-MS-MS分析

将如上所述制备的HIP样品在100μL MeCN中重构，涡旋混合并倒置多次以确保Eppendorf管的所有表面都用MeCN冲洗，并且最后脉冲离心。然后取50μL MeCN重构溶液的等分试样作为未稀释的HIP提取物样品并加到96孔板中，同时通过取5μL等分试样并用45μLMeCN稀释制备1:10稀释样品；向每个样品中加入50μL Millipore水。通过将2μL 0.5mM测试化合物DMSO储备液加到98μL MeCN中以生成10μM最高标准品，然后用MeCN连续稀释制备生物分析校准线以覆盖0.0001至10μM的浓度范围以生产6个校准标准储液。将50μL每种校准标准储液加到96孔板中并用50μL的Millipore水稀释。然后将50μL合适的MeCN内标加到96孔板中的每个孔中，该孔包含样品或校准标准，将板密封并转移到UPLC-MS-MS系统进行分析。通过比较hMfsd2a和D97A转染细胞与空载体转染细胞中的测试化合物浓度的比率来评估在hMfsd2a的影响下从HIP样品分析测定的测试化合物摄入到HEK293细胞，如图8A-8G所示。。

图8A显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物3的浓度，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，在WT细胞中检测到更多的化合物3，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图8B显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物4的浓度，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，在WT细胞中检测到更多的化合物4，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图8C显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物5的浓度，与用D97A突变体和/或WT相比，在用空载体转染的细胞中检测到更多的化合物5。因此，无法确认该化合物是否通过该方法经由Mfsd2a转运。

图8D显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物6的浓度，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，在WT细胞中检测到更多的化合物6，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图8E显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物7的浓度，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，在WT细胞中检测到更多的化合物7，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图8F显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物8的浓度，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，在WT细胞中检测到更多的化合物8，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

图8G显示在来自WT细胞、用D97A突变体Mfsd2a和空载体转染的细胞的HIP样品中测量的化合物8的浓度，与用D97A突变体Mfsd2a和/或空载体转染的细胞相比，在WT细胞中检测到更多的化合物20，从而证实化合物经由Mfsd2a转运。

实施例10体内ADME

方案1：在3mg/kg下IV JVC大鼠PK研究

将化合物3以3mg/kg静脉内投配到一组3只单独饲养的、正常喂养的雄性SpragueDawley大鼠中，这些大鼠已装有颈静脉导管(JVC)。以2mL/kg的投配体积和5％DMSO 95％的水作为投配媒介进行投配。在投配的每个时间点(0.08h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h和24H)，从每只动物采集系列血样(150μL)放入在含有等量水的冰上的肝素化的Eppendorf管(含有5μL肝素)。然后将两个100μL等分试样置于干冰上的96孔板中。样品在-20℃的冰箱中储存直至生物分析。

方案2：在10mg/kg下PO JVC大鼠PK研究

将化合物3以10mg/kg口服投配到一组3只单独饲养的雄性Sprague Dawley大鼠，这些大鼠禁食过夜并在施用后4h进食，给大鼠配备JVC。以5mL/kg的投配体积和5％DMSO95％的水作为投配媒介进行投配。在每个时间点(0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和24H)，从每只动物采集系列血液(150μL)样品放入在含有等量水的冰上的肝素化的Eppendorf管(含有5μL肝素)。然后将两个100μL等分试样置于干冰上的96孔板中。样品在-20℃的冰箱中储存直至生物分析。

生物分析样品制备

将样品解冻并使用乙腈(含有内标)沉淀蛋白质。将所有样品混合、离心，并根据以下程序通过LC-MS-MS分析上清液：

1.将20μL血浆转移到v底96孔板中。

2.将80μL含有IS的乙腈(ACN)加到每个孔中。

3.将板密封并轻轻混合约30s。

4.将板以3500rpm离心10min。

5.将50μL上清液转移到含有100μL MilliQ水的新鲜v底96孔板中。

将板热封并在4℃下储存直至分析。得到的PK参数在下表1中显示。

表1

方案3：在20mg/kg下PO JVC大鼠终末PK研究

将化合物3以20mg/kg口服施用至一组9只、颈静脉插管、单独饲养的雄性SpragueDawley大鼠，这些大鼠禁食过夜并在施用后4h进食以评估其组织分布特征。以5mL/kg的投配体积进行投配，其中5％DMSO、95％的水用作投配媒介。在投配后的3个时间点(1h、2h和4H)，通过在CO₂下心脏穿刺从3只动物的组中采集终末血样(>230μL)进入在含有等量水的冰上的肝素化的Eppendorf管(含有5μL肝素)。然后将两个100μL等分试样置于干冰上的96孔板中。在采血后立即切下脑和眼对样品，称重，冲洗，吸干，并在液体N₂中快速冷冻。样品在-20℃的冰箱中储存直至生物分析。

组织样品称重，并在均质前将3倍质量的水加入样品中。在眼球的情况下，晶状体不能均质化，但所有其他组织均质化。结果数据(组织分布参数)在下表2中显示。

表2

*修正每克脑组织污染15μL的血液。Brown等人，BR.J.Pharmac.(1986)，87，569-578。

方案4脑匀浆分析

需要开发一种更灵敏的生物分析方法来检测脑组织中的化合物2，因为在上述分析中未检测到高于定量下限的化合物2。

根据以下程序对以上采集的脑组织(见实施例4)进行再分析，并且数据在表3中显示。

1.将100μL脑匀浆转移到2mL方形矩阵深孔板中。

2.将300μL含有IS的乙腈(ACN)分配到样品上并在振荡器上混合。

3.将样品以3500rpm离心15min。

4.将300μL上清液转移到新鲜的2mL方形矩阵深孔板中。

5.使用氮气浓缩样品，然后在80μL的50:50ACN:MilliQ水中重构，并在平板振荡器上摇晃。

6.然后通过LC-MS-MS分析样品。

表3

实施例11体外脑匀浆稳定性

新鲜啮齿动物大脑在收集后立即速冻，并在同一天进行测定。大脑在37℃下预孵育，然后加入1μM的测试化合物。在6个时间点(0、10、20、30、45和60min)收集样品，并在含有内标(亮氨酸脑啡肽)的冷乙腈中碰撞并保存在冰上，直到收集到所有样品。然后摇动样品并离心。将100μL上清液转移到含有50μL MilliQ水的板上并混合。这些板在6个时间点上通过LC-MS/MS进行分析，其中使用初始时间点(T＝0min)的峰面积作为100％计算剩余测试化合物的百分比。然后计算剩余百分比的自然对数。剩余百分比对时间(min)的自然对数绘制在图表上并且该图表的梯度用于计算消除速率常数(K)。使用2的自然对数除以消除速率常数计算测试化合物的半衰期(t_1/2)。形成的化合物2的百分比在下表4-6中报告。图9A-9F显示用实施例的代表性化合物进行的脑匀浆稳定性的结果。

表4

表5

表6

如表4-6和图9A-9F所示，化合物3、4、5在大鼠和小鼠脑匀浆稳定性研究中均表现出一定的清除水平，药理活性化合物2(花生四烯乙醇胺)的形成在一小时的孵育期中增加。这些数据与使用化合物3的体内大鼠CNS渗透数据一致，其中还在脑中检测到化合物2。

生物分析

根据上述用于LC-MS-MS分析的程序制备生物分析样品。使用AB Sciex QTRAP5500通过LC-MSMS分析样品。对于所有分析，仪器均设置为在正离子模式下运行，数据如下在表7中显示。

表7

其他实施例

应当理解，虽然已经结合其详细描述描述本发明，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。本发明所涉及的领域的普通技术人员应当理解，本文描述的关于本发明的任何特定方面和/或实施方案的任何特征可以与本文描述的本发明的任何其他方面和/或实施方案的任何其他特征中的一个或多个组合，进行适当的修改以确保组合的兼容性。这种组合被认为是本公开所涵盖的本发明的一部分。