一种制备低敏性乳清蛋白肽的方法
阅读说明：本技术 一种制备低敏性乳清蛋白肽的方法 (Method for preparing hypoallergenic whey protein peptide ) 是由 涂宗财 陈海奇 胡月明 王辉 黎勇强 夏余鸿 杨一帆 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备低敏性乳清蛋白肽的方法,明属于食品加工技术领域,涉及一种利用糖基化反应协同蛋白酶酶解复合改性制备低敏性乳清蛋白肽的技术。该方法具体为：配制乳清蛋白-低聚果糖溶液,冷冻干燥后制得固样,于过热蒸汽条件下进行糖基化反应,用胃蛋白酶进行第一步酶解,再用胰蛋白酶进行第二步酶解,利用μm级别滤膜滤出蛋白质分子,最后冷冻干燥处理制得低敏性乳清蛋白肽。通过本发明加工技术制备得到的低敏性乳清蛋白肽,能够有效降低其致敏性,并且通过硒等营养物质的添加增加了其附加值,同时有效抑制其糖基化反应末期产物的生成。(The invention discloses a method for preparing hypoallergenic whey protein peptide, belongs to the technical field of food processing, and relates to a technology for preparing hypoallergenic whey protein peptide by utilizing glycosylation reaction in cooperation with protease enzymolysis composite modification. The method specifically comprises the following steps: preparing a whey protein-fructo-oligosaccharide solution, freeze-drying to obtain a solid sample, carrying out glycosylation reaction under the condition of superheated steam, carrying out first-step enzymolysis by using pepsin, carrying out second-step enzymolysis by using trypsin, filtering out protein molecules by using a filter membrane of a mu m level, and finally carrying out freeze-drying treatment to obtain the hypoallergenic whey protein peptide. The hypoallergenic whey protein peptide prepared by the processing technology can effectively reduce the allergenicity of the hypoallergenic whey protein peptide, increases the added value of the hypoallergenic whey protein peptide by adding nutrient substances such as selenium and the like, and effectively inhibits the generation of the final product of the glycosylation reaction.)
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种制备低敏性乳清蛋白肽的方法，其利用糖基化反应协同蛋白酶酶解复合改性制备低敏性乳清蛋白肽。
背景技术
牛乳具有营养丰富、易吸收消化等优点，但同时也是引起过敏的常见食物之一，牛乳诱发的过敏症状主要表现为皮肤反应、呼吸症状、肠道症状和系统反应。
牛乳过敏是一种非特异性反应，一般由牛乳中的酪蛋白、β-乳球蛋和α-乳白蛋白等过敏原引起。牛乳引起的过敏反应一般是由于IgE的介导诱发，如何降低牛乳中蛋白质的致敏性是制备低敏性蛋白肽的关键。
糖基化反应是食品热加工中最常见的反应，属于美拉德反应的前期阶段，它是指还原糖和含有游离氨基的蛋白质之间发生缩合，糖基化可能影响蛋白质的线性表位，进而降低蛋白质的致敏性。酶法水解是一种利用蛋白酶对蛋白质进行限制性水解的方法，能够有效降低蛋白质的致敏性。如CN 109897879 B公开了一种低敏性卵清蛋白肽的制备方法，其利用酶法改性有效降低致敏性；但是该方法的原料和糖基化反应对乳清蛋白过敏源抑制效率欠佳，此外该方法的糖基化反应过程中向末期进行，其生成了糖基化反应末期产物，该产物和人体的各种组织细胞相结合并破坏这些组织细胞，从而造成了对人体的危害。
发明内容
针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种制备低敏性乳清蛋白肽的方法，利用高温过蒸汽的糖基化反应结合蛋白质酶解技术，降低乳清蛋白的致敏性，从而获得一种低敏性的乳清蛋白肽。
本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明采取的技术流程是：先配制乳清蛋白溶液，冷冻干燥后制得固样，于过热蒸汽条件下进行糖基化反应，用胃蛋白酶进行第一步酶解，再用胰蛋白酶进行第二步酶解，利用μm级别滤膜滤出蛋白质分子，最后冷冻干燥处理制得低敏性乳清蛋白肽。
本发明方法的具体步骤为
1、乳清蛋白溶液的制备：先配制溶质质量分数为1％的食品级小苏打，将食品级小苏打与乳清蛋白混合，再向混合物中添加氯化铁、亚硒酸和L-抗坏血酸，根据溶质质量份数具体的比例如下：乳清蛋白∶食品级小苏打∶氯化铁∶亚硒酸∶L-抗坏血酸＝10∶0.1～0.3∶0.01～0.03∶0.1～0.15∶0.3～0.45；
2、糖基化处理：按溶质质量份数1∶1的比例，将乳清蛋白溶液与低聚果糖用去离子水溶解混匀，去离子水的质量应是总溶质的5倍；混合均匀后冷冻干燥制得固样，在140℃过热蒸汽条件下反应2～3分钟，获得糖基化后的样品；
3、酶解
(1)用1.0mol/L盐酸溶液将样品pH调节到2.0，按酶与样品1∶50～100(w/w)的比例加入胃蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解1～2小时，得到样品A；
(2)用1.0mol/L氢氧化钠溶液将样品A的pH调节到7.0，按酶与样品A1∶25～50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解1～2小时，得到样品B；
(3)将样品B置于沸水浴，7～10分钟后终止反应，冷却至室温；
4、过滤：把灭酶后的产物在μm级别的滤膜上过滤，分离出蛋白质分子；
5、冷冻浓缩：把滤液置于-80℃冰箱冷冻浓缩12小时；
6、冷冻干燥：将冷冻浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得低敏性乳清蛋白肽。
本发明中利用低聚果糖与β-乳球蛋白发生糖基化反应而降低致敏性；β-乳球蛋白的致敏表位多含赖氨酸，而糖基化主要是蛋白质中的赖氨酸和还原糖发生反应，因此糖基化反应能够降低β-乳球蛋白与IgE反应活性，进而降低致敏性。
本发明的原料的选择与参数配比、过热蒸汽条件具有调控糖基化反应，抑制其向糖基化反应末期进行，有效抑制其糖基化反应末期产物的生成。
本发明除了制备乳清蛋白肽，还添加了硒，硒是一种必需微量元素，具有预防心血管疾病、提高免疫力等作用。
所以，通过上述技术流程，可以制备出一种低敏性乳清蛋白肽，其有益效果是：能够制备一种乳清蛋白肽，能够有效降低其致敏性；通过硒等营养物质的添加增加了其附加值；通过原料参数和反应调控抑制其糖基化反应末期产物的生成。
附图说明
图1是各实施例和对比例制备的乳清蛋白肽抗原性的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例一
1、乳清蛋白溶液的制备：先配制溶质质量分数为1％的食品级小苏打，根据溶质质量份数为乳清蛋白∶食品级小苏打∶氯化铁∶亚硒酸∶L-抗坏血酸＝10∶0.1∶0.01∶0.1∶0.3的比例，先将食品级小苏打与乳清蛋白混合，再向混合物中添加氯化铁、亚硒酸和L-抗坏血酸，获得乳清蛋白溶液。
2、糖基化处理：按溶质质量份数1∶1的比例将乳清蛋白溶液与低聚果糖用去离子水溶解混匀，去离子水的质量应是总溶质的5倍；混合均匀后冷冻干燥制得固样，在140℃过热蒸汽条件下反应2分钟，获得糖基化后的样品。
3、酶解
(1)用1.0mol/L盐酸将样品pH调节到2.0，按酶与样品1∶50(w/w)的比例加入胃蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解1小时，得到样品A；
(2)用1.0mol/L氢氧化钠溶液将样品A的pH调节到7.0，按酶与样品1∶25(w/w)的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解1小时，得到样品B。
(3)将样品B置于沸水浴7分钟终止反应，冷却至室温。
4.过滤：把灭酶后的产物在μm级别的滤膜上过滤，分离出蛋白质分子。
5、冷冻浓缩：把滤液置于-80℃冰箱冷冻浓缩12小时。
6、冷冻干燥：将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得低敏性乳清蛋白肽。
实施例二
1、乳清蛋白溶液的制备：先配制溶质质量分数为1％的食品级小苏打，根据溶质质量份数为乳清蛋白∶食品级小苏打∶氯化铁∶亚硒酸∶L-抗坏血酸＝10∶0.2∶0.02∶0.1∶0.3的比例，先将食品级小苏打与乳清蛋白混合，再向混合物中添加氯化铁、亚硒酸和L-抗坏血酸，获得乳清蛋白溶液。
2、糖基化处理：按溶质质量份数1∶1的比例将乳清蛋白溶液与低聚果糖用去离子水溶解混匀，去离子水的质量应是总溶质的5倍；混合均匀后冷冻干燥制得固样，在140℃过热蒸汽条件下反应2分钟，获得糖基化后的样品。
3、酶解
(1)用1.0mol/L盐酸将样品pH调节到2.0，按酶与样品1∶50(w/w)的比例加入胃蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解2小时，得到样品A；
(2)用1.0mol/L氢氧化钠溶液将样品A的pH调节到7.0，按酶与样品1∶25(w/w)的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解2小时，得到样品B。
(3)将样品B置于沸水浴8分钟终止反应，冷却至室温。
4.过滤：把灭酶后的产物在μm级别的滤膜上过滤，分离出蛋白质分子。
5、冷冻浓缩：把滤液置于-80℃冰箱冷冻浓缩12小时。
6、冷冻干燥：将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得低敏性乳清蛋白肽。
实施例三
1、乳清蛋白溶液的制备：先配制溶质质量分数为1％的食品级小苏打，根据溶质质量份数为乳清蛋白∶食品级小苏打∶氯化铁∶亚硒酸∶L-抗坏血酸＝10∶0.2∶0.02∶0.15∶0.45的比例，先将食品级小苏打与乳清蛋白混合，再向混合物中添加氯化铁、亚硒酸和L-抗坏血酸，获得乳清蛋白溶液。
2、糖基化处理：按溶质质量份数1∶1的比例将乳清蛋白溶液与低聚果糖用去离子水溶解混匀，去离子水的质量应是总溶质的5倍；混合均匀后冷冻干燥制得固样，在140℃过热蒸汽条件下反应3分钟，获得糖基化后的样品。
3、酶解
(1)用1.0mol/L盐酸将样品pH调节到2.0，按酶与样品1∶100(w/w)的比例加入胃蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解1小时，得到样品A；
(2)用1.0mol/L氢氧化钠溶液将样品A的pH调节到7.0，按酶与样品1∶50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解1小时，得到样品B。
(3)将样品B置于沸水浴9分钟终止反应，冷却至室温。
4.过滤：把灭酶后的产物在μm级别的滤膜上过滤，分离出蛋白质分子。
5、冷冻浓缩：把滤液置于-80℃冰箱冷冻浓缩12小时。
6、冷冻干燥：将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得低敏性乳清蛋白肽。
实施例四
1、乳清蛋白溶液的制备：先配制溶质质量分数为1％的食品级小苏打，根据溶质质量份数为乳清蛋白∶食品级小苏打∶氯化铁∶亚硒酸∶L-抗坏血酸＝10∶0.3∶0.03∶0.15∶0.45的比例，先将食品级小苏打与乳清蛋白混合，再向混合物中添加氯化铁、亚硒酸和L-抗坏血酸，获得乳清蛋白溶液。
2、糖基化处理：按溶质质量份数1∶1的比例将乳清蛋白溶液与低聚果糖用去离子水溶解混匀，去离子水的质量应是总溶质的5倍；混合均匀后冷冻干燥制得固样，在140℃过热蒸汽条件下反应3分钟，获得糖基化后的样品。
3、酶解
(1)用1.0mol/L盐酸将样品pH调节到2.0，按酶与样品1∶100(w/w)的比例加入胃蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解2小时，得到样品A；
(2)用1.0mol/L氢氧化钠溶液将样品A的pH调节到7.0，按酶与样品1∶50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，在37℃条件下震荡酶解2小时，得到样品B。
(3)将样品B置于沸水浴10分钟终止反应，冷却至室温。
4.过滤：把灭酶后的产物在μm级别的滤膜上过滤，分离出蛋白质分子。
5、冷冻浓缩：把滤液置于-80℃冰箱冷冻浓缩12小时。
6、冷冻干燥：将浓缩后的样品进行冷冻干燥，获得低敏性乳清蛋白肽。
对比例一
按照实例二中乳清蛋白肽的制备方法进行，不同的是在步骤1中只加入乳清蛋白和食品级小苏打，且乳清蛋白∶食品级小苏打＝10∶0.2，其他处理步骤不变获取蛋白肽。
对比例二
按照实例二中乳清蛋白肽的制备方法进行，不同的是在步骤1中只加入乳清蛋白和氯化铁，且乳清蛋白∶氯化铁＝10∶0.02，其他处理步骤不变获取蛋白肽。
对比例三
按照实例二中乳清蛋白肽的制备方法进行，不同的是在步骤1中只加入乳清蛋白、亚硒酸和L-抗坏血酸，且乳清蛋白∶亚硒酸∶L-抗坏血酸＝10∶0.1∶0.3，其他处理步骤不变获取蛋白肽。
对比例四
按照实例二中乳清蛋白肽的制备方法进行，不同的是在步骤1中只加入乳清蛋白，其他处理步骤不变获取蛋白肽。
对实施例一至四、对比例一至四制得的乳清蛋白肽，采用酶联免疫吸附测定法进行抗原性分析，将乳清蛋白肽的浓度配为5μg/mL，向酶标板中加入乳清蛋白肽(100μL/每孔)，在4℃条件下过夜；用PBST洗涤酶标板三次(200μL/每孔)，拍干；加入BSA进行封闭(250μL/每孔)，在37℃条件下放置2小时，洗板后拍干；向酶标板中加入兔抗OVA的血清(50μL/每孔)，37℃条件下放置1小时，洗板后拍干；向酶标板中加入羊抗兔二抗(200μL/每孔、HRP酶标记)，37℃条件下放置1小时，洗板后拍干；加入TMB显色；加入硫酸终止反应；在490nm处测量并记录吸光值，结果如图1所示。
通过测定各例在490nm处的吸光值来表明蛋白肽的抗原性，抗原性低则表示蛋白肽的致敏性较低。
乳清蛋白-低聚果糖溶液通过糖基化、酶解、过滤、冻干等步骤最后获取蛋白肽，由图1可知，在溶液的制备中加入食品级小苏打、氯化铁和纳米硒对产物的抗原性都有抑制作用，但是三者协同工作时抑制作用更为明显，此时制备的乳清蛋白肽的致敏性更低。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：胶原三肽的提取方法及制备的胶原三肽