具体实施方式

本发明提供了胶原三肽的提取方法及制备的胶原三肽，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

酸法、碱法、盐法、酶法等是从动物组织中提取胶原蛋白的主要方法，其中，酸法提取可以最大限度地保持其三股螺旋结构，生物学特性较好，成纤维性能佳，适用于生物材料，碱法制备胶原蛋白因周期长、步骤多很少被采用，且产物的利用价值较低。盐法提取中不同的盐类型对胶原的稳定性也有影响，有的可以提高胶原的稳定性，有的则会降低构象的稳定性，制约了胶原蛋白的提取。经酶法提取的胶原蛋白纯度高，理化性质稳定，水溶性好，大大缩短了提取时间，减少环境污染，因此本发明采用酶解法进行胶原蛋白的酶解。

鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，本发明选取青鱼皮作为胶原蛋白多肽的提取原料，使胶原蛋白多肽的提取率更高，胶原蛋白提取量更多，更便于提取

所述原料的预处理包括将活青鱼去头、去内脏，对剖成两片后将鱼皮与鱼肉分离，将分离得到的鱼皮去鳞、去鳍，清水冲洗干净，阴凉处自然晾干，然后用剪刀将干净的鱼皮剪成碎片，碎片大小为10mm×10mm，放入密封袋封口后于-20℃冻藏备用。

通过正已烷的浸泡，进行鱼皮的脱脂处理，防止鱼皮中脂肪含量过高降低胶原蛋白多肽的提取率，保障鱼皮中的处胶原蛋白之外的其他组分含量为最低，避免提取时的误差较大，从而防止其他物质的干扰提取。脱脂时鱼皮与正已烷的料液比为1:9，混合后充分搅拌，且称量所用设备为PTX-FA201S电子天平，

所述酶解包括将pH调节至7.5后对鱼皮进行浸泡溶胀，溶胀时间为12h，溶胀后进行搅拌匀浆，匀浆后的溶液进行混合酶液的加入，通过设置酶解的pH梯度值进行实验比对，其他变量保持不变，pH值为单一变量，设置pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，研究pH值对胶原蛋白提取效果的影响。经试验可得知，pH值为7-8时胶原蛋白提取率为最佳，低于或高于此pH值范围，胶原蛋白提取率均不理想，与碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的活动酸碱度范围一致，因此选择酶解的pH为7.5为最佳提取值.

实施例中，通过设置超声波功率分别为300、400、500、600、700、800W，其他环境保持不变，研究超声波功率对胶原蛋白提取效果的影响，当超声波功率为300W-600W之间时，胶原蛋白提取率与超声波功率呈正相关，随着超声波功率的提高，大量溶剂渗透到细胞中，从而提高提取率，当超声波功率达到600W时胶原蛋白提取率达到最高值，此后，提取率随着超声波功率的上升反而降低，由于功率过大的超声波破坏了鱼皮胶原蛋白的分子结构，从而导致胶原蛋白提取率下降，因此超声波功率为600W为最佳功率.

超声辅助酶解法能够有效提高胶原蛋白的提取率，使提取时间明显缩短，且超声的功率低，能够降低提取成本，实施例中，依次设置超声波超声时间的梯度值进行测试，随着超声波处理时间的延长，胶原蛋白的提取率不断增大，当超过50min时，提取率几乎不变，表明基本溶出全部胶原蛋白，但超声波处理时间过长可能会造成体系温度过高而降低酶的活性或破坏胶原蛋白的结构，因此，选择超声波提取时间为45min。

一些实施例中，酶解的温度控制仪器采用SYC-6水浴摇床，酶解中测定PH值的设备为STARTE2100型实验室PH计，离心处理采用设备为TDL-40B台式低速大容量离心机，原料预处理冷冻设备为Alpha1-2LDplus冻干机。

通过各个设备进行胶原蛋白提取中环境的各项参数和工作的控制，便于胶原蛋白的提取的进行，干燥收集为釆用压力式喷雾干燥机，设置进风温度180℃，出风温度80℃，进料温度为35℃。

本发明采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶以1:3比例混合酶解法对青鱼皮进行胶原蛋白肽的提取制备，同时加以600W的超声波进行处理45min，进行酶解的辅助提取，有效增加酶解鱼皮的彻底程度，使鱼皮中对胶原蛋白肽的提取率提高了15％-25％，从而有效增加混合酶解的胶原蛋白肽的提取效率，使胶原蛋白肽提取率高达92％，

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：

如图1所示，一种高活性胶原三肽提取富集的工艺方法，包括如下步骤：

Sp1：原料预处理：

将活青鱼去头、去内脏，对剖成两片后将鱼皮与鱼肉分离，将分离得到的鱼皮去鳞、去鳍，清水冲洗干净，阴凉处自然晾干，然后用剪刀将干净的鱼皮剪成碎片，碎片大小为10mm×10mm，放入密封袋封口后于-20℃冻藏备用。

Sp2：脱杂蛋白和脱色：将冷藏的鱼皮取出，放置于4℃环境下贮藏，用0.1mol/LNaOH溶液浸泡鱼皮1h用来脱杂蛋白和脱色，用蒸馏水清洗后备用；

Sp3：脱脂：将脱杂蛋白和脱色后的鱼皮用正己烷浸泡鱼皮6h以去除脂肪，取出用蒸馏水清洗后备用，正己烷的体积为鱼皮体积的两倍，脱脂环境温度为4℃；

Sp4：酶解：将脱脂后的鱼皮称量，加入蒸馏水，料液比为1：20，将pH调节至7.5后对鱼皮进行浸泡溶胀，溶胀时间为12h，溶胀后进行搅拌匀浆，用盐酸氢氧化钠调节pH至7.5，加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶液进行酶解，混合比例为1:3，加酶量为110U/g，酶解温度为75℃，酶解时间6h；

Sp5：超声波辅助酶解：将酶解时的酶解容器进行超声波超声处理，超声功率为600W，处理时间为45min；

Sp6：灭酶：将酶解结束后溶液放入100℃中灭酶15min；

Sp7：离心：将灭酶后的溶液进行冷却至4℃，冷却后的溶液进行离心，离心速度为12000r/min,离心时间15min；

Sp8：干燥收集：取离心后溶液取上清液进行喷干，设置进风温度180℃，出风温度80℃，进料温度为35℃，得到白色粉末状状粗肽，收率为92％。

经检测，该产物对自由基DPPH，OH和超氧阴离子自由基具有良好的清除能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。