倍癌霉素类似物
阅读说明：本技术 倍癌霉素类似物 (Duocarmycin analogs ) 是由 李和发 莫阿娜·特塞尔 于 2020-01-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及式I的2-甲基苯并噁唑化合物,其为倍癌霉素的DNA烷基化亚单位的类似物。式I化合物可用于合成DNA烷基化剂和抗体-药物缀合物以及相关化合物。式I的2-甲基苯并噁唑单元在结合高细胞毒性、低亲脂性和异常的水稳定性方面具有有利的性质,所有这些性质对于在有效的抗体-药物缀合物中作为有效负荷的应用是合乎需要的。(The present invention relates to 2-methylbenzoxazole compounds of formula I which are analogs of the DNA alkylated subunit of duocarmycin.)
1.
技术领域
本发明一般涉及可用于合成抗体-药物缀合物(ADC)的2-甲基苯并噁唑化合物和相关化合物。
2.
背景技术
倍癌霉素是一种具有明显细胞毒活性的天然产物，与DNA小沟结合，在腺嘌呤的N3位发生烷基化。以下两个实施例，倍癌霉素SA和CC-1065说明了典型的倍癌霉素结构，其由DNA-烷基化亚单位和在DNA螺旋的小沟内非共价结合的DNA结合亚单位组成。
结合作用的机制包括向烷基化亚单位的环丙基环添加腺嘌呤，使用该亚单位的通用结构在以下方案1中说明。该反应对于DNA是快速和选择性的，但是对于其他亲核试剂如水是较慢的数量级，使得在不存在DNA的情况下，烷基化亚单位在生理条件下在水性缓冲液中持续非常长的时间。
方案1
环丙基环可以由带有氯甲基或其它离去基团取代基的seco(即开环的)前体形成，如方案1中所示。闭环反应在生理条件下如此容易发生，使得两种形式(开环和环丙基)显示基本上相同的细胞毒性。然而，如果开环烷基化亚单位的酚为防止环化的化学形式，则细胞毒性大大降低。
天然产物如倍癌霉素SA以单一对映异构体形式分离，如所示。然而，两种对映异构体可烷基化DNA，尽管非天然对映异构体通常细胞毒性较低。
已经报道了倍癌霉素烷基化亚单位的许多合成形式。这些通常在由上述方案1中的结构中的虚线指示的环融合的性质上变化。这些环融合的性质可以对细胞毒性具有很强的作用。
例如，CBI(环丙基苯并吲哚)烷基化亚单位(以下以开环形式与在倍癌霉素SA中发现的TMI(三甲氧基吲哚)侧链组合说明)产生具有与天然产物类似的细胞毒性效力的倍癌霉素类似物(J.Org.Chem.(1990)55,5823)。
相反，包含替代COI(环丙基噁唑并吲哚)烷基化亚单位与TMI的组合的化合物的细胞毒性低几百倍(Bioorg.Med.Chem.Lett.(2010)20,1854)。
还报道了其它合成变化。例如，氨基开环-CBI是已知的，其中胺基取代酚的羟基。这些变体经历与它们的酚类似物相同的螺环化和DNA烷基化反应，并且具有相等的细胞毒性效力(ChemBioChem(2014)15,1998)。
进一步的变化包括以允许DNA中两个腺嘌呤的链间交联的方式将两个烷基化亚单位连接在一起(J.Am.Chem.Soc.(1989)111,6428；Angew.Chem.(2010)49,7336)。这些二聚体甚至可以比相应的单烷基化剂更具有细胞毒性，尽管二聚体的活性不必由其组分单烷基化单元的活性来预测。
下面示出了氨基开环-倍癌霉素和烷基化亚单位的二聚体。
已经研究了几种作为潜在小分子抗癌剂的倍癌霉素类似物。然而，临床试验不成功，因为毒性限制了可以以非常低的剂量施用的量。
最近，倍癌霉素类似物已发现作为抗体-药物缀合物(ADC)的有效负荷的应用。ADC最常用于癌症治疗，其中细胞毒小分子(有效负荷)通过接头与识别肿瘤相关抗原的抗体连接(Nat.Rev.Drug Discov.(2017)16,315；Pharmacol.Rev.(2016)68,3)。
通过将有效负荷化学连接至合适的接头来构建ADC，所述接头自身缀合至期望的抗体。ADC被设计为在循环中是稳定的，但通常在受体结合和内在化进入靶细胞之后在预定的靶位点释放有效负荷。以这种方式，有效负荷的细胞毒性作用被特异性地导向需要损伤的部位，即肿瘤中。几种这样的ADC已被批准作为抗癌治疗。
ADC概念是将有效负荷特异性地导向其靶细胞的巧妙手段，从而使与毒性化合物在体内的常规非特异性全身递送相关的不良作用最小化。遗憾的是，主要的技术挑战限制了ADC概念的成功应用。
ADC概念限制可递送至靶细胞的有效负荷的量，使得有效负荷对于ADC必须是非常细胞毒性的以具有治疗效果。
由于它们的高细胞毒性，已经研究了倍癌霉素类似物作为ADC有效负荷，作为单烷基化剂，或作为可以交联DNA的二聚体的组分(参见例如Mol.Pharm.(2015)12,1813；WO2011/133039；Biopharm.Drug Dispos.(2016)37,93；Cancer Chemother.Pharmacol.(2016)77:155–162；J.Med.Chem.(2012)55,766；J.Med.Chem.(2005)48,1344；Cancer Res.(1995)55,4079；Bioorg.Med.Chem.(2000)8,2175；WO 2018/035391；WO 2015/038426；WO2015/153401；WO 2015/023355；WO 2017/194960；WO 2018/071455)。
在这些实施例的绝大多数中，烷基化亚单位是高毒性开环-CBI，如下所示。
尽管使用这种烷基化亚单位将导致具有所需细胞毒性的ADC，但开环-CBI在高度亲脂性方面具有显著的缺点。亲脂性有效负荷及其衍生物在用于将有效负荷-接头组分缀合至抗体的水性缓冲液中不是非常可溶的，使得缀合步骤困难。所得到的ADC也倾向于聚集。在使用ADC之前必须除去ADC聚集体，增加了生产临床上有用的ADC的复杂性和成本。
亲脂性有效负荷还与ADC从血流中更快清除有关，这降低了它们的总暴露，并因此降低了它们的抗肿瘤功效(Nat.Biotechnol.(2015)33,733–735)。
亲脂性有效负荷，特别是引起聚集的那些，也可以产生引起体内免疫应答的ADC，导致意外的毒性或降低的治疗功效。
然而，尽管存在与亲脂性相关的问题，但开环-CBI化合物的高细胞毒性继续使它们成为用于抗癌ADC的有吸引力的有效负荷，采用各种策略来减少缺点。
例如，为了抵消开环-CBI的高亲脂性，一些研究者已经求助于修饰其他组分部分，使得ADC作为整体是较少亲脂性的。一些研究者已经掺入了修饰的接头(例如聚乙二醇间隔物，如在Mol.Pharm.(2015)12,1813；J.Med.Chem.(2005)48,1344中)。其它已经构建了更水溶性的前药形式(例如：J.Med.Chem.(2012)55,766,WO 2015/023355)。
然而，通过修饰ADC的其它组分解决有效负荷亲脂性问题本身可能具有缺点。除了使有效负荷-接头组分的合成更复杂和耗时之外，该技术还可能限制接头的选择。
连接至有效负荷的接头部分对ADC在体内的功效和安全性具有显著影响(Bioanalysis(2015)7(13),1561)。它必须在循环中具有适当的稳定性，但在需要时在体内裂解。ADC设计包括考虑释放有效负荷的生理条件，从而可以使用合适的接头。例如，含有腙部分的接头是pH敏感的并且将在较低pH环境如内体和溶酶体中裂解。二硫化物接头在还原环境(例如细胞内环境)中释放有效负荷。
为减轻烷基化亚单位的不期望的亲脂性而进行的一些接头修饰可降低使用它们的ADC的功效，使得所得ADC可能不是可由指定的有效负荷和抗体制备的最有效的产物。
亲脂性问题的其它解决方案包括ADC Bio专利锁定-释放技术(www.adcbio.com)，其在缀合至有效负荷-接头组分之前将抗体固定在固相支持物上。通过在ADC分子的制造期间将它们彼此物理分离来防止聚集。这允许使用更大范围的接头，但增加了缀合过程的额外成本，而实际上不降低最终ADC产物的亲脂性。
因此，高毒性烷基化亚单位的亲脂性是阻碍新ADC开发的问题。
已知的作为ADC有效负荷的倍癌霉素类似物的另一个潜在缺点是烷基化亚单位的环丙基形式的高稳定性。从ADC释放到循环中的稳定有效负荷可以持续足够长的时间以引起不期望的全身毒性。不幸的是，高稳定性是CBI烷基化亚单位的几乎所有合成类似物保留所需的有效细胞毒性的特征。先前研究已显示水性稳定性与细胞毒性之间的相关性，使得大部分细胞毒性类似物在中性pH的水性缓冲液中稳定(J Med Chem(2009)52,5271)。
因此，需要替代DNA-烷基化亚单位，其促进一系列ADC的有效合成，同时证明功效所需的细胞毒性和稳定性性质。
因此，本发明的目的是为了满足这种需要而采取至少某种方式；和/或至少向公众提供有用的选择。本发明的其它目的可从以下仅作为示例给出的描述中变得明显。
在本说明书中，已经参考外部信息源，包括专利说明书和其他文献，这通常是为了提供用于讨论本发明的特征的上下文。除非另有说明，否则对这样的信息源的引用不应解释为在任何权限下承认这样的信息源是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。
3.
发明内容
本发明提供了新的烷基化亚单位‘2-甲基苯并噁唑’以及该亚单位的受保护的和前药衍生物，其适于连接至宽范围的杂芳基和芳基DNA结合部分以产生高细胞毒性的倍癌霉素类似物。
本发明还提供了包含与DNA小沟结合单元缀合的新的2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的倍癌霉素类似物。当通过接头基团与抗体结合时，这些化合物可用于产生ADC。
因此，在第一方面，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中：
LG为离去基团；
X为选自羟基、受保护的羟基、前药羟基、胺和受保护的胺的基团；其中胺是-NH2，或-NH(C1-C6)烷基；并且
Y是N-保护基。
在第二方面，本发明提供式II的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中：
LG为离去基团；
X为选自羟基、受保护的羟基、前药羟基、胺和受保护的胺的基团；其中胺是-NH2，或-NH(C1-C6)烷基；并且
DB为DNA小沟结合单元。
在一个实施方案中，DB为直接或经由烯基连接的任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在一个实施方案中，DB为任选取代的吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃、吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、噻唑、噁唑、吡唑、三唑、吡嗪或哒嗪基。
在第三方面，本发明提供式III的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中：
LG为离去基团；
X为选自羟基、受保护的羟基、前药羟基、胺和受保护的胺的基团；其中胺是-NH2或-NH(C1-C6)烷基；并且
Y选自：
(a)N-保护基；
(b)-C(O)-Ar1
(c)-C(O)-Ar1-NH-C(O)-Ar2
(d)-C(O)-Ar1-NH-C(O)-CH＝CH-Ar3；或
(e)-C(O)-CH＝CH-Ar3
其中Ar1、Ar2和Ar3各自独立选自杂芳基或芳基，其中每个所述杂芳基或芳基任选被以下一种或多种取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基；
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，Ar1、Ar2和Ar3独立地选自由以下各项组成的组
其中表示与-C(O)或C(O)-CH＝CH-基团的连接点，并且每个芳基或杂芳基可以在编号位置被最多三个选自以下的取代基取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基；
其中在每种情况下取代基-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基可以独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在第四方面，本发明提供式IV的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中V为Y或DB且X、Y和DB具有与对式I、II和III的化合物所定义相同的含义且X'为X而失去H。
式IV的化合物可以通过体外或体内重排以及伴随的从相应的式I、II和III的开环-化合物中消除H-LG来形成。除非上下文另外规定，否则本文针对式I、II或III化合物或其任何部分所述的本发明的所有实施方案也明确涵盖为涉及式IV化合物的本发明方面的一部分。
以下实施方案和优选方案可单独地或以任何两个或更多个的组合涉及本文所述的本发明的任何方面。
在一个实施方案中，LG选自由以下各项组成的组：氯离子、溴离子、碘离子和-OSO2R1；其中R1选自(C1-C10)烷基、(C1-C10)杂烷基、(C1-C10)芳基或(C1-C10)杂芳基。
在一个实施方案中，LG为卤素，优选氯，并且LG所连接的手性碳上的构型为(S)。
在一个实施方案中，X选自由以下各项组成的组：-OH、-OBn、-OTf、-OMOM、-OMEM、-OBOM、-OTBDMS、-OPMB、-OSEM、哌嗪-1-羧酸酯，其中4位的N被(C1-C10)烷基、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR2)2、-NH2、-N＝C(Ph)2、-NHZ、NH(C1-C10)烷基和-N-Z(C1-C10)烷基取代；
其中R2为t-Bu、Bn或烯丙基；Z选自Boc、COCF3、Fmoc、Alloc、Cbz、Teoc和Troc。
在一个实施方案中，Y为选自Boc、COCF3、Fmoc、Alloc、Cbz、Teoc和Troc的N-保护基。
本文公开的数字范围(例如，1至10)也包括提及该范围内的所有有理数(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的有理数任何范围(例如，2到8、1.5到5.5和3.1到4.7)，因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围特此明确公开。这些仅仅是具体意图的示例，并且在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合被认为以类似的方式在本申请中明确地陈述。
虽然本发明广义地定义如上，但是本领域技术人员将理解本发明不限于此，并且本发明还包括以下描述给出示例的实施方案。
4.
附图说明
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1显示了开环-CBI-TMI在中性水性缓冲液中的稳定性的LCMS分析。上图显示了色谱图的示例(在20分钟的孵育时间之后)。下图总结了在>300min的总孵育时间内混合物组成的变化。
图2显示了化合物23在中性水性缓冲液中的稳定性的LCMS分析。上图显示了色谱图的示例(在200分钟的孵育时间之后)。下图总结了在500min的总孵育时间内混合物组成的变化。
图3显示了化合物52在中性水性缓冲液中的稳定性的HPLC分析。每小时监测一次实验，共8小时。
图4显示了化合物59在中性水性缓冲液中的稳定性的HPLC分析。每小时监测一次实验，共8小时。
图5显示了化合物66在中性水性缓冲液中的稳定性的HPLC分析。每小时监测一次实验，共8小时。
5.
具体实施方式
5.1定义
本说明书和权利要求书中使用的术语“包含”意指“至少部分由…组成”。当解释本说明书和权利要求书中包括术语“包含”的每个表述时，还可以存在不同于该术语或由该术语开头的那些特征。相关术语例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”将以相同的方式解释。
如本文所用，术语“和/或”意指“和”或“或”，或两者。
如本文所用，名词后面的“(s)”意指该名词的复数和/或单数形式。
不对称中心可存在于本文所述的化合物中。不对称中心可以被指定为(R)或(S)，这取决于手性碳原子处的三维空间中的取代基的构型。除非指出特定的立体化学或异构形式，否则意欲包括结构的所有手性、非对映异构体和外消旋形式。化合物的所有立体化学异构形式，包括非对映异构形式、对映异构形式和差向异构形式，以及顺式异构体和反式异构体，及其混合物，包括对映异构体富集的和非对映异构体富集的立体化学异构体的混合物，都在本发明的范围内。
单独的对映异构体可以由可商购的对映异构体纯的原料合成制备，或者通过制备对映异构体混合物并将混合物拆分成单独的对映异构体来制备。拆分方法包括(a)在手性固定相上通过色谱法分离对映异构体混合物和(b)将对映异构体混合物转化成非对映异构体的混合物和通过例如重结晶或色谱法分离非对映异构体，和本领域已知的任何其它合适的方法。具有限定立体化学的原料可以是可商购的或制备的，并且如果需要，通过本领域熟知的技术拆分。优选在手性碳(在开环形式中带有CH2-LG部分的碳)处具有“天然”构型的对映异构体。
本文所述的化合物还可以作为构象或几何异构体存在，包括顺式(cis)、反式(trans)、顺式(syn)、反式(anti)、entgegen(E)和zusammen(Z)异构体。所有这些异构体及其任何混合物都在本发明的范围内。
所述化合物的任何互变异构体或其混合物也在本发明的范围内。如本领域技术人员将理解的，多种官能团和其它结构可以显示互变异构现象。实例包括但不限于酮/烯醇、亚胺/烯胺和硫酮/烯硫醇互变异构。
本文所述的化合物还可以同位素异数体和同位素异位体存在，其中化合物中的一个或多个原子被不同的同位素替代。合适的同位素包括例如1H、2H(D)、3H(T)、12C、13C、14C、16O和18O。用于将此类同位素并入本文所述的化合物中的程序对于所属领域的技术人员将是显而易见的。本文所述的化合物的同位素异数体和同位素异位体也在本发明的范围内。
本文所述的化合物的盐，包括药学上可接受的盐也在本发明的范围内。此类盐包括，酸加成盐、碱加成盐和碱性含氮基团的季盐。酸加成盐可以通过使游离碱形式的化合物与无机酸或有机酸反应来制备。无机酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸。有机酸的实例包括但不限于乙酸、三氟乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、磺胺酸、己二酸、丁酸和新戊酸。碱加成盐可以通过使游离酸形式的化合物与无机或有机碱反应来制备。无机碱加成盐的实例包括碱金属盐、碱土金属盐和其它生理学上可接受的金属盐，例如铝、钙、锂、镁、钾、钠或锌盐。有机碱加成盐的实例包括胺盐，例如三甲胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺和乙二胺的盐。化合物中的碱性含氮基团的季盐可以通过例如使化合物与烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物、硫酸二烷基酯(如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯)等反应来制备。
本文所述的化合物可以与各种溶剂形成溶剂化物或作为溶剂化物存在。如果溶剂是水，则溶剂化物可称为水合物，例如一水合物、二水合物或三水合物。本文所述的化合物的所有溶剂化形式和非溶剂化形式均在本发明的范围内。
本文使用的一般化学术语具有它们通常的含义。
化学基团的标准缩写是本领域熟知的并且采用它们的通常含义，例如，Me＝甲基，Et＝乙基，Bu＝丁基，t-Bu＝叔丁基，Ph＝苯基，Bn＝苄基，Ac＝乙酰基，Boc＝叔丁氧基羰基，Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基，Tf＝三氟甲磺酸酯，OMOM＝甲氧基甲基醚，OMEM＝甲氧基乙氧基甲基醚，OBOM＝苄氧基甲基醚，OTBDMS＝叔丁基二甲基甲硅烷基醚，DPPA＝二苯基磷酰叠氮化物，NBS＝N-溴代琥珀酰亚胺，NIS＝N-碘代琥珀酰亚胺，OPMB＝4-甲氧基苄基醚，EDCI＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，HOBt＝羟基苯并三唑，OSEM＝[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基醚，Alloc＝烯丙氧基羰基，Cbz＝苄氧基羰基，Teoc＝(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基，TEMPO＝2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基，Troc＝2,2,2-三氯乙基羰基等。
除非另外说明，否则这些缩写适用于以下所有实例。
除非另外指明，否则如本文单独或与其它术语组合使用的术语“烷基”是指直链或支链饱和或不饱和无环烃基。在一些实施方案中，烷基具有1至15、1至13、1至11、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至12、2至9、2至8、2至6、2至4、3至9、3至8、4至9、4至15、6至15、8至15、10至15，或1，或2，或3个碳原子。在一些实施方案中，烷基是饱和的。此类烷基的实例包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基、-正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、-新戊基、2-甲基丁基、-异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3,4-三甲基戊基、3-甲基己基、2,2-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、3,5-二甲基己基、2,4-二甲基戊基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、正庚基、异庚基、异辛基、异壬基、异癸基、异十一烷基、异十二烷基、异十三烷基、异十四烷基和异十五烷基等。在一些实施方案中，烷基是不饱和的。这种烷基的实例包括但不限于-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1-丁炔基等。前缀“Cx-Cy”，其中x和y各自为整数，当与术语“烷基”组合使用时，是指烷基中的碳原子数。在一些实施方案中，“烷基”基团可以被如本文所述的一个或多个任选的取代基取代。
除非另外指明，否则如本文单独或与其它术语组合使用的术语“芳基”是指不含有任何环杂原子的环状芳族烃基团。芳基包括单环、双环和三环环系。芳基的实例包括但不限于苯基、薁基、庚烯基、联苯基、芴基、菲基、蒽基、茚基、茚满基、并环戊二烯基和萘基。在一些实施方案中，芳基在环中具有6至20、6至14、6至12或6至10个碳原子。在一些实施方案中，芳基为苯基或萘基。芳基包括芳族碳环稠合环系。实例包括但不限于茚满基和四氢萘基。前缀“Cx-Cy”，其中x和y各自为整数，当与术语“芳基”组合使用时，是指芳基中的环碳原子数。在一些实施方案中，“芳基”基团可以被如本文所述的一个或多个任选的取代基取代。
除非另外指明，否则如本文单独或与其它术语组合使用的术语“杂芳基”是指含有5个或更多个环原子的芳族环系统，其中一个或多个是杂原子。在一些实施方案中，杂原子为氮、氧或硫。杂芳基是具有芳族电子结构的各种杂环基。在一些实施方案中，杂芳基包括具有5至20、5至16、5至14、5至12、5至10、5至8或5至6个环原子的单-、二-和三环环系。杂芳基包括但不限于吡咯基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、苯硫基、苯并苯硫基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基、氮杂吲哚基(吡咯并吡啶基)、吲唑基、苯并咪唑基、吡唑并吡啶基、三唑并吡啶基、苯并三唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、咪唑并吡啶基、咪唑基、异唑并吡啶基呫吨基、脒基(guaninyl)、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、喹喔啉基和喹唑啉基。杂芳基包括稠环系统，其中所有环是芳族的，例如吲哚基，和稠环系统，其中仅一个环是芳族的，例如2,3-二氢吲哚基。当与术语“杂芳基”组合使用时，前缀“x-y元”是指杂芳基中的环原子数目，其中x和y各自为整数。在一些实施方案中，“杂芳基”基团可以被如本文所述的一个或多个任选的取代基取代。
术语“卤代”或“卤素”旨在包括F、Cl、Br和I。
术语“杂原子”旨在包括氧、氮、硫、硒或磷。在一些实施方案中，杂原子选自氧、氮和硫。
如本文所用，术语“取代的”旨在表示所示基团中的一个或多个氢原子被一个或多个独立选择的合适取代基替代，条件是不超过与取代基连接的每个原子的正常化合价，并且该取代产生稳定的化合物。在各种实施方案中，本文所述化合物中合适的任选取代基包括但不限于卤素、-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基、-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH。除非另外指明，否则本文中的术语“稳定的”是指具有足以允许制造的稳定性并且将其完整性维持足以用于本文所述目的的一段时间的化合物。
本文所用的术语“抗体”是指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合目的靶的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，所述靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫性抗体的细胞。术语“抗体”包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。在结构上，抗体通常是由四条氨基酸链、两条重链和两条轻链组成的Y形蛋白。每个抗体主要具有两个区域：可变区和恒定区。位于Y臂末端的可变区与靶抗原结合并与之相互作用。该可变区包括互补决定区(CDR)，其识别并结合特定抗原上的特异性结合位点。位于Y尾部的恒定区被免疫系统识别并与之相互作用(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有许多结合位点，也称为表位，由多种抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有多于一种的相应抗体。
如本文所用，术语“反应性部分”意指可在相对温和的条件下与第二官能团反应而不需要预先官能化的官能团。反应性部分和第二官能团之间的反应仅需要施加热、压力、催化剂、酸和/或碱。反应性部分的实例包括氨基甲酰卤、酰卤、活性酯、酸酐、α-卤代乙酰基、α-卤代乙酰胺、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、二硫化物、硫醇、肼、酰肼、磺酰氯、醛、甲基酮、乙烯基砜、卤代甲基和甲基磺酸酯。第二官能团通常是接头或配体。
如本文所用，术语“配体”意指与受体、抗原或与给定靶细胞群相关的其它接受部分结合或反应性缔合或复合的配体。配体通常通过分子间力如氢键、离子键和范德华力结合。配体通常通过与表达特定抗原或细胞表面受体的细胞结合而将有效负荷递送至配体所结合的靶细胞群。例如，配体可以结合细胞表面受体或表面蛋白，其在患病细胞如癌细胞中过表达。
用于本发明的配体的实例包括抗体(其可以是单克隆、双特异性、嵌合或人源化抗体，或任何这些抗体的抗体片段)、生长因子、激素、细胞/组织靶向肽、适体和小分子如成像剂、辅因子或细胞因子。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指本文所述的化合物的药学上可接受的有机或无机盐。例如，本文所述的化合物可含有氨基，因此可与该氨基形成酸加成盐。盐的实例包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1′-亚甲基双(2-羟基-3-萘甲酸))。药学上可接受的盐可涉及包含另一种分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本文所述的化合物的缔合。形成药学上可接受的溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
5.2本发明的化合物
本发明的化合物提供具有高度期望性质的新的DNA-烷基化单元，其可用于使用常规技术合成宽范围的高效ADC。
具体地，本发明的化合物包含：
(a)N-保护的2-甲基苯并噁唑(2-methylbenzoxaxole)DNA烷基化单元(其中Y是N-保护基)和
(b)与DNA小沟结合单元连接的2-甲基苯并噁唑DNA烷基化单元。
本发明的N-保护的2-甲基苯并噁唑DNA烷基化单元可以容易地连接到DNA小沟结合单元以提供高细胞毒性的倍癌霉素类似物。它们还可以与其它化学部分缀合以形成新的生物活性化合物，包括ADC。
其中DNA烷基化亚单位与DNA小沟结合单元连接的本发明化合物可通过经由接头连接抗体或其它配体转化为ADC。接头可以通过羟基或胺基X直接连接到DNA烷基化亚单位，或通过在Y位置的DNA小沟结合单元间接连接到DNA烷基化亚单位。
在第一方面，本发明提供式I的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中：
LG为离去基团；
X为选自羟基、受保护的羟基、前药羟基、氨基和受保护的氨基的基团；其中氨基是-NH2，或-NH(C1-C6)烷基；并且
Y是N-保护基。
式I化合物可用于合成式II和III化合物，以及用于ADC及其前体。
本发明还涉及式Ia的化合物，
其中LG、X和Y如式I所定义。
在第二方面，本发明提供式II的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中：
LG为离去基团；
X为选自羟基、受保护的羟基、前药羟基、氨基和受保护的氨基的基团；其中氨基是-NH2，或-NH(C1-C6)烷基；并且
DB为DNA小沟结合单元。
本发明还涉及式IIa的化合物，
其中LG、X和DB如对式II所定义。
在一个实施方案中，DB为直接或经由烯基连接的任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在一个实施方案中，DB为任选取代的吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃、苯、吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、噻唑、噁唑、吡唑、三唑、吡嗪或哒嗪基。
如下所述，在DNA小沟结合单元的设计和合成以及建立它们的DNA结合模式和强度的方法方面，本领域有广泛的信息可用。从而，本领域技术人员容易确定具体的化学实体是否构成DNA小沟结合单元。
在一个实施方案中，DB包含与接头基团或接头基团的组分上的互补反应性位点相容的反应性部分RM，其中所述接头基团连接至配体，或适于连接至配体，例如抗体。
在一个实施方案中，RM是选自由以下各项组成的组的反应性部分：叠氮化物、炔、氨基甲酰卤、酰卤、活性酯、酸酐、α-卤代乙酰基、α-卤代乙酰胺、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、二硫化物、硫醇、肼、酰肼、磺酰氯、醛、甲基酮、乙烯基砜、卤代甲基和甲基磺酸酯。
在本发明的一些实施方案中，例如式II的化合物，2-甲基苯并噁唑DNA烷基化亚单位与DNA小沟结合单元(DB)结合。用于本发明的合适的DNA结合部分具有在双链DNA的小沟中结合的亲和力。关于设计和合成这些分子以及确定它们的DNA结合模式和强度的方法，有大量信息可供利用，例如，如在由J.B.Chaires和M.J.Waring编辑的药物-核酸相互作用(Drug-Nucleic Acid Interactions)(Methods in Enzymology Vol 340,AcademicPress,2001)中所述；小分子对DNA的分子识别(Molecular Recognition of DNA by SmallMolecules)(Bioorg.Med.Chem.(2001)9,2215)；用于药物发现的使用小分子配体的基于结构的DNA靶向策略(Structure-Based DNA-Targeting Strategies with Small MoleculeLigands for Drug Discovery)(Med.Res.Rev.(2013)33,1119)；以及用于建立DNA结合选择性和亲和性的荧光嵌入剂置换测定法(A Fluorescent Intercalator DisplacementAssay for Establishing DNA Binding Selectivity and Affinity)(Chem.Rev.(2004)37,61)。
用于与DNA-烷基化单元连接的DNA结合部分是可以被其它官能团取代的杂芳基或芳基。通常，平面芳基和杂环体系具有用于在小沟内结合的适当物理化学性质，这通常由H-键合和范德华相互作用与沟的壁和底部的DNA组分的组合驱动。增强这些相互作用的芳基和杂芳基环取代基增加结合强度。
通过将两个或更多个环系连接在一起以产生与小沟更长且更广泛的相互作用，进一步有利于结合，只要总体结构保持正确的曲率和扭曲以匹配其结合到其中的小沟的曲率和扭曲。这在小分子配体或DNA存在最小畸变时最有利地实现；即，当存在高度的形状互补性时。使用酰胺键连接环系是有利的基序，因为酰胺本身可参与与DNA的氢键相互作用，同时还提供足够的柔性以适应所需的扭曲和曲率。
考虑的另一个因素，特别是对于延伸长度的DNA小沟结合剂，是保持配体上和DNA上H-键供体和受体之间的正确对齐或定位。在一些情况下，这可以通过改变芳基或杂芳基环上的取代基的性质或改变取代基的位置来实现。已经构建了大量的DNA小沟结合配体文库并测定了它们的结合亲和力(例如偏端霉素A和2640类似物的全合成：一种溶液相组合方法，用于发现新的生物活性DNA结合剂并开发快速、高通量筛选以确定相对DNA结合亲和力或DNA结合序列选择性(A Solution-Phase Combinatorial Approach to the Discoveryof New,Bioactive DNA Binding Agents and Development of a Rapid,High-Throughput Screen for Determining Relative DNA Binding Affinity or DNABinding Sequence Selectivity)，J.Am.Chem.Soc.(2000)122,6382)，并且这些文库已经被用于制备倍癌霉素类似物(例如平行合成和评价CC-1065和倍癌霉素的132(+)-1,2,9,9a-四氢环丙并[c]苯并[e]吲哚-4-酮(CBI)类似物，其限定了DNA结合结构域的作用(Parallel Synthesis and Evaluation of 132(+)-1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[c]benz[e]indol-4-one(CBI)Analogues of CC-1065and the Duocarmycins Defining theContribution of the DNA-Binding Domain)，J.Org.Chem.(2001)66,6654)。
在式II和IIa化合物的具体实施方案中，DNA小沟结合单元包含可以通过酰胺键与第二个杂芳基或芳基连接的杂芳基。
在式II和IIa化合物的其它实施方案中，DNA小沟结合单元包含通过烯基(-CH＝CH-)与DNA烷基化单元连接的单个芳基或杂芳基。
在第三方面，本发明提供式III的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中：
LG为离去基团；
X为选自羟基、受保护的羟基、前药羟基、氨基和受保护的氨基的基团；其中氨基是-NH2，或-NH(C1-C6)烷基；并且
Y选自：
(a)N-保护基；
(b)-C(O)-Ar1
(c)-C(O)-Ar1-NH-C(O)-Ar2
(d)-C(O)-Ar1-NH-C(O)-CH＝CH-Ar3；或
(e)-C(O)-CH＝CH-Ar3
其中Ar1、Ar2和Ar3各自独立选自杂芳基或芳基，其中每个所述杂芳基或芳基任选被以下一种或多种取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基；
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
本发明还涉及式IIIa的化合物，
其中LG、X和DB如对式III所定义。
以下实施方案适用于式I、Ia、II、IIa、III和IIIa的化合物。
本文所用的术语“离去基团”是指在取代反应中离开碳中心的基团。通常这种基团在阴离子形式下是稳定的。离去基团的实例是本领域熟知的，并且包括但不限于卤素基团和磺酸酯基团，如任选取代的(C1-C6)链烷磺酸酯(例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯和三氟乙磺酸酯)和任选取代的苯磺酸酯。
在一个实施方案中，LG选自由以下各项组成的组：氯离子、溴离子、碘离子和-OSO2R1；其中R1选自(C1-C10)烷基、(C1-C10)杂烷基、(C1-C10)芳基或(C1-C10)杂芳基。在一个实施方案中，LG为卤素基团，优选氯。下面的方案2显示了包含不同离去基团的DNA烷基化亚单位的合成。
在本发明的化合物中，基团X可以是游离羟基或游离氨基，或可以是被合适的保护基(分别是被保护的羟基或被保护的氨基)保护的羟基或氨基。X也可以是羟基的前药形式(前药羟基)。
术语“前药羟基”意指在体内通过生物化学品如酶的作用转化以提供游离OH基团的基团。用于选择和制备可以使用的合适的前药羟基基团的常规程序描述于由H.Bundgaard,Elsevier在1985年编辑的“前药设计(Design of Prodrugs)”中。实例是本领域熟知的并且包括但不限于磷酸基、氨基甲酸酯和糖苷。
其中X为前药羟基的本发明化合物可用于其中接头将连接至DNA小沟结合单元而不是通过X连接的ADC。这将产生ADC的前药形式。本领域技术人员，设计并入本发明化合物的ADC，将能够选择系链抗体组分的适当位置，并确定特定前药形式对于ADC的预期应用的合意性。
如本文所用，术语“受保护的羟基”是指在合成程序期间已被保护免受不合需要的反应的羟基。当不再需要和/或允许羟基反应时，受保护的羟基容易转化为游离羟基。在T.W.Greene等人编辑的有机合成中的保护基中描述了羟基保护基。(John Wiley&Sons,1999)。如本文所用，术语“受保护的羟基”还包括诸如OTf的基团，其包含良好的离去基团并且可用于合成其中OH基团被替代基团替代的衍生物。可用于本发明化合物的羟基保护基的实例包括-OBn、-OTf、-OMOM、-OMEM、-OBOM、-OTBDMS、-OPMB、-OSEM。
本文所用的术语“受保护的氨基”是指在合成程序中已被保护免受不希望的反应的氨基。当不再需要和/或允许氨基反应时，受保护的氨基易于转化成游离氨基。在本发明的化合物中，X位置的氨基选自-NH2和-NH(C1-C6)烷基。氨基保护基描述于由T.W.Greene等人编辑的有机合成中的保护基(John Wiley&Sons,1999)和由Fernando Albericio编辑的‘氨基酸-保护基’(与Albert Isidro-Llobet和Mercedes Alvarez)Chemical Reviews2009(109)2455-2504。
可用于本发明化合物的氨基保护基的实例包括但不限于酰基和酰氧基，例如乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯基乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、三氟乙酰基、乙酰乙酰基、4-氯丁酰基、异丁酰基、吡啶甲酰基、氨基己酰基、苯甲酰基、甲氧基-羰基、9-芴基甲氧基羰基、2,2,2-三氟乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基-羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、对硝基苯氧基羰基、2,4-二氯-苄氧基羰基等。进一步的实例包括硝基苯磺酰基(邻-或对-硝基苯磺酰基)、Bpoc(2-(4-联苯基)异丙氧基羰基)和Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚己基)乙基)。
在一个实施方案中，X选自由以下各项组成的组：-OH、-OBn、-OTf、-OMOM、-OMEM、-OBOM、-OTBDMS、-OPMB、-OSEM、哌嗪-1-羧酸酯，其中4位的N被(C1-C10)烷基、-OP(O)(OH)2、-OP(O)(OR2)2、-NH2、-N＝C(Ph)2、-NHZ、NH(C1-C10)烷基和-N-Z(C1-C10)烷基取代；
其中R2为t-Bu、Bn或烯丙基；Z选自Boc、COCF3、Fmoc、Alloc、Cbz、Teoc和Troc。
在一个实施方案中，X为-OH或-NH2。
在一个实施方案中，X为保护的或前药-OH。
在一个实施方案中，X为保护的-NH2。
在一个实施方案中，X选自-OBn、-OTf、-OMOM和-OMEM。
制备其中X为羟基、受保护的羟基或前药羟基的本发明化合物的方法示于以下方案2中。制备其中X为氨基或保护的氨基的本发明化合物的方法示于以下方案3中。
其中Y为N-保护基的本发明化合物提供2-甲基苯并噁唑DNA-烷基化单元，其可容易地与DNA小沟结合单元连接以提供高细胞毒性的倍癌霉素类似物。
本文所用的术语“N-保护基”是指能够容易地被除去以提供游离N并且在合成程序中保护N原子免受不希望的反应的基团。这样的保护基描述于由T.W.Greene等人编辑的有机合成中的保护基(John Wiley&Sons,1999)和由Fernando Albericio编辑的‘氨基酸-保护基’(与Albert Isidro-Llobet和Mercedes Alvarez)Chemical Reviews 2009(109)2455-2504。实例包括但不限于酰基和酰氧基，例如乙酰基、氯乙酰基、三氯乙酰基、邻硝基苯基乙酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、三氟乙酰基、乙酰乙酰基、4-氯丁酰基、异丁酰基、吡啶甲酰基、氨基己酰基、苯甲酰基、甲氧基-羰基、9-芴基甲氧基羰基、2,2,2-三氟乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧基-羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、对硝基苯氧基羰基、2,4-二氯-苄氧基羰基等。进一步的实例包括硝基苯磺酰基(邻-或对-硝基苯磺酰基)、Bpoc(2-(4-联苯基)异丙氧基羰基)和Dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚己基)乙基)。
在一个实施方案中，Y为选自Boc、COCF3、Fmoc、Alloc、Cbz、Teoc和Troc的N-保护基。
本领域技术人员将能够选择适合于所使用的具体合成方案和所需终产物的保护基和前药羟基部分。
在式III的化合物中，DNA小沟结合单元包含杂芳基或芳基，其可以经由酰胺键或经由-NH-C(O)-CH＝CH-连接至第二杂芳基或芳基。
在其它实施方案中，DNA小沟结合单元包含单个芳基或杂芳基。
在一个实施方案中，Ar1、Ar2和Ar3独立地选自由以下各项组成的组
其中表示与-C(O)或C(O)-CH＝CH-基团的连接点，并且每个芳基或杂芳基可以在编号位置被最多三个选自以下的取代基取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基。
如本领域技术人员所理解的，5-氮杂吲哚、6-氮杂吲哚、7-氮杂吲哚、咪唑、噻唑、噁唑和吡唑基团可以被至多两个基团和三唑，仅一个取代。
当Ar1通过NH-C(O)连接到Ar2时，或当Ar1通过-NH-C(O)-CH＝CH连接到Ar3时，Ar1上的连接点可以是任何一个编号位置。如本领域技术人员将理解的，这样的连接将减少Ar1上可能的取代基的数目的一个。
在每种情况下取代基-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基可以独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，Ar1为杂芳基。在一个实施方案中，杂芳基为吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基，其在杂芳基的2-位上经由-C(O)或C(O)-CH＝CH-连接至DNA烷基化单元。
在一个实施方案中，Ar1通过NH-C(O)连接到Ar2或Ar1通过-NH-C(O)-CH＝CH连接到Ar3。在一个实施方案中，Ar1上的连接点在吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基的5位上。
在一个实施方案中，Ar2选自由以下各项组成的组：吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、噻唑、噁唑、吡唑、三唑、吡嗪或哒嗪。
在一个实施方案中，Ar2选自吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡咯或咪唑。
在一个实施方案中，Ar3选自苯、吡啶、嘧啶和哒嗪。在一个实施方案中，Ar3是苯或吡啶，优选苯。
在一个实施方案中Y为-C(O)-Ar1，其中Ar1为杂芳基或芳基，其任选被以下一种或多种取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基或-NHC(O)-(C1-C6)烷基，
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，Ar1在杂芳基环或芳基环的一个位置上被取代。
在一个实施方案中，Ar1为杂芳基。
在一个实施方案中，杂芳基为吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基，其在杂芳基的2-位上经由-C(O)或C(O)-CH＝CH-连接至DNA烷基化单元。
在一个实施方案中，Ar1为
其中A为NH、O或S，并且
R10、R11和R12独立地选自H、-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基，
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NH-C(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代。
在一个实施方案中，A为NH。
在一个实施方案中，R10、R11和R12为OMe。
在一个实施方案中，R10为-O-(C1-C6)烷基，其任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代；R11和R12都是H。
在一个实施方案中，R10为-NHC(O)-(C1-C6)烷基，其任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代；R11和R12都是H。
在一个实施方案中，R10为-NH-C(O)-Ar2，其中Ar2为任选取代的吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡咯或咪唑基；R11和R12都是H。
在一个实施方案中，R10为-NH-C(O)-Ar2，其中Ar2为任选取代的吲哚基；R11和R12都是H。在一个实施方案中，吲哚基团被-O-(C1-C6)烷基取代，任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代。
在一个实施方案中，R10为-NH-C(O)-Ar2，其中Ar2为任选取代的苯基；R11和R12均为H。在一个实施方案中，所述苯基被-OH、-NH2或-O-(C1-C6)烷基取代，其中-O-(C1-C6)烷基任选被-NMe2取代。
在一个实施方案中，R10是-NH-C(O)-CH＝CH-Ar3，其中Ar3是任选取代的苯、嘧啶基或吡咯基；R11和R12均为H。在一个实施方案中，苯、嘧啶基或吡咯基被-O-(C1-C6)烷基、-NH2或-NHC(O)-(C1-C6)烷基取代，其中-O-(C1-C6)烷基任选地被吗啉取代。
在一些实施方案中，Ar1选自由以下各项组成的组：
其中R10、R11和R12(当存在时)独立地选自H、-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基，
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，R10、R11和R12为OMe。
在一个实施方案中，R10、R11和R12中的一个为-O-(C1-C6)烷基，其任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代。
在一个实施方案中，R10、R11和R12中的一个为-NHC(O)-(C1-C6)烷基，其任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代。
在一个实施方案中，R10、R11和R12中的一个为-NH-C(O)-Ar2，其中Ar2为任选取代的吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡咯或咪唑基。
在一个实施方案中，R10、R11和R12中的一个为-NH-C(O)-Ar2，其中Ar2为任选取代的吲哚基。在一个实施方案中，吲哚基被-O-(C1-C6)烷基取代，其任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代。
在一个实施方案中，R10、R11和R12中的一个为-NH-C(O)-Ar2，其中Ar2为任选取代的苯基。在一个实施方案中，苯基被-OH、-NH2或-O-(C1-C6)烷基取代，其中-O-(C1-C6)烷基任选被-NMe2取代。
在一个实施方案中，R10、R11和R12中的一个为-NH-C(O)-CH＝CH-Ar3，其中Ar3为任选取代的苯、嘧啶基或吡咯基。在一个实施方案中，苯、嘧啶基或吡咯基被-O-(C1-C6)烷基、-NH2或-NHC(O)-(C1-C6)烷基取代，其中-O-(C1-C6)烷基任选地被吗啉取代。
在一个实施方案中Y为-C(O)-Ar1-NH-C(O)-Ar2，其中Ar1和Ar2为杂芳基或芳基，其任选被以下一种或多种取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基或-NHC(O)-(C1-C6)烷基，
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，Ar1为杂芳基并且Ar2为杂芳基或芳基。
在一个实施方案中，Ar1为吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基，其在杂芳基的2-位与DNA烷基化单元连接。
在一个实施方案中，Ar2选自由以下各项组成的组：吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、噻唑、噁唑、吡唑、三唑、吡嗪或哒嗪。
在一个实施方案中，Ar2选自吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡咯或咪唑基。
一个实施方案中，Ar1为吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基，其与杂芳基2-位的DNA烷基化单元连接，并且Ar2选自吲哚、氮杂吲哚、苯、苯并呋喃、吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、噻唑、噁唑、吡唑、三唑、吡嗪或哒嗪。
在一个实施方案中，Ar1上的连接点在吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基的5位上。
在一个实施方案中Y为-C(O)-Ar1-NH-C(O)-CH＝CH-Ar3，其中Ar2和Ar3为杂芳基或芳基，其任选被以下一种或多种取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基或-NHC(O)-(C1-C6)烷基，
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，Ar1为杂芳基并且Ar3为杂芳基或芳基。
在一个实施方案中，Ar1为吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基，其在杂芳基的2-位与DNA烷基化单元连接。
在一个实施方案中，Ar3选自苯、吡啶、嘧啶和哒嗪。在一个实施方案中，Ar3是苯或吡啶，优选苯。
在一个实施方案中，Ar1为吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基，其与杂芳基2-位的DNA烷基化单元连接，并且Ar3选自苯、吡啶、嘧啶和哒嗪。
在一个实施方案中，Ar1上的连接点在吲哚、氮杂吲哚、苯并呋喃或苯并噻吩基的5位上。
在一个实施方案中Y为-C(O)-CH＝CH-Ar3，其中Ar3为杂芳基或芳基，其任选被以下一种或多种取代：-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-OH、-O-(C1-C6)烷基、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基或-NHC(O)-(C1-C6)烷基，
其中在每种情况下-(C1-C6)烷基、-CO-(C1-C6)烷基、-CONH(C1-C6)烷基、-CON(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基、-O-(C1-C6)烷基、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基(C1-C6)烷基和-NHC(O)-(C1-C6)烷基独立地任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种所取代。
在一个实施方案中，Ar3选自苯、吡啶、嘧啶和哒嗪。在一个实施方案中，Ar3为苯或吡啶，优选苯。
在一个实施方案中，Ar3为任选地被-O-(C1-C6)烷基取代的苯基，其任选被-NMe2、-NHMe、-NH2、-OH、吗啉和-SH中的一种或多种取代。
式I、II和III的化合物是式IV的化合物的开环前体，其被认为是体内的活性剂。
在第四方面，本发明提供式IV的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物
其中V为Y或DB且X、Y和DB具有与对式I、II和III的化合物所定义相同的含义且X'为X而失去H。
式IV的化合物可以通过体外或体内重排以及伴随的从相应的式I、II和III的开环-化合物中消除H-LG来形成。除非上下文另外规定，否则本文针对式I、II或III化合物或其任何部分所述的本发明的所有实施方案也明确涵盖为涉及式IV化合物的本发明方面的一部分。
式I、II和III的化合物含有离去基团(LG)，其在生理条件下促进环丙基环形成以形成式IV的化合物。
在一个方面，本发明提供选自化合物49、18、50、51、23、52、53、57、58、59、63、64、65、66、70、74、79、80、81、82、83、24、26、85、87、88、89、90、91和93中任一个的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供选自化合物49、18、50、51、23、52、57、53、58、59、63、64、65、66、70、74、79、80、81、82、83、24、85、88和90中任一个的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供选自由以下各项组成的组的化合物：
在一个实施方案中，本发明提供选自由以下各项组成的组的化合物：
在一个实施方案中，本发明提供选自由以下各项组成的组的化合物：
5.3本发明的化合物的合成
本发明的化合物可以使用本文所述的方法和程序或与其类似的方法和程序制备。制备本发明化合物的其它合适的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。
应当理解，在指出典型的或优选的工艺条件(例如，反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)的情况下，也可以使用其他工艺条件，除非另有说明。最佳反应条件可随所用的特定反应物而变化。
用于该方法和反应的原料是可商购的，或者可以通过已知的程序或其修改制备，例如例如标准参考文献中所描述的那些，例如Fieser and Fieser's Reagents forOrganic Synthesis，卷1-15(John Wiley and Sons，1991)，Organic Reactions，卷1-40(John Wiley and Sons，1991)，March's Advanced Organic Chemistry，(John Wiley andSons，第四版)，和Larock's Comprehensive Organic Transformations(VCH PublishersInc.，1989)。
各种原料、中间体和化合物可以在适当时使用常规技术如沉淀、过滤、结晶、蒸发、蒸馏和色谱法分离和纯化。化合物的表征可以使用常规方法进行，例如通过熔点、质谱、核磁共振和各种其它光谱分析。
常规保护基可能是防止某些官能团经历不期望的反应所必需的。保护和脱保护的需要以及适当保护基的选择是本领域技术人员容易确定的。用于各种官能团的合适保护基以及用于保护和脱保护特定官能团的合适条件是本领域熟知的(参见，例如，T.W.Greene和G.M.Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis,第三版,Wiley,New York,1999)。
含有2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的有效负荷的单独的对映异构体可以使用合适的中间体(例如，化合物49或18)的手性HPLC拆分来制备。合适的柱包括用于拆分相关烷基化亚单位的那些例如CBI(J.Am.Chem.Soc.(1994)116,7996)，CTI(Bioorg.Med.Chem.Lett.(2009)19,6962)，iso-DSA(J.Am.Chem.Soc.(2009)131,1187)，CImI(Bioorg.Med.Chem.(2016)24,4779)。可以通过与针对外消旋体描述的那些方法类似的方法将拆分的中间体转化成有效负荷和药物-接头缀合物。
制备其中X＝保护的OH的2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的一般方法示于方案2中。该方案中的化合物5和7容易转化为2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位，其中X＝游离OH且X＝前药OH。
方案2
在该方案中，3,4-二羟基-5-硝基苯甲酸酯1用作原料。这些可以例如通过将3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛氧化成相应的酸，随后用醇ROH酯化来制备。或者，1可以通过4-羟基-3-甲氧基苯甲酸的硝化，随后使用试剂如HBr或BBr3使甲氧基脱烷基，随后用醇ROH酯化来制备。
通过暴露于合适的条件(例如在Pd或Pt催化剂上氢化，或在酸性条件下暴露于Fe(III)盐)将1的硝基还原成相应的胺，并且在酸性条件下用原乙酸三烷基酯(例如原乙酸三甲酯)处理产物以诱导环化为取代的2-甲基苯并噁唑2。
在合成的此时，可以引入各种X＝保护的-OH。例如，可以通过2与苄基溴或苄基氯在碱性条件下反应引入苄基保护基，得到3，其中X＝OBn。类似地，可以通过与MOMCl反应引入MOM保护基；可通过与MEMCl反应引入MEM保护基；可以通过与BOMCl反应引入BOM保护基；可以通过与TBDMSCl反应引入TBDMS保护基；可以通过与PMBCl反应引入PMB保护基；可以通过与SEMCl反应引入SEM保护基。对于不同的保护基，可以适当地选择不同的反应条件(例如碱、溶剂、温度、氯化物或溴化物试剂、添加剂如碘化物盐)以优化3的产率。
然后将3的酯在标准条件下水解，得到相应的酸，其转化为4的NHY基团。其中Y表示氨基甲酸酯保护基，这些步骤中的第二个可以方便地在单锅中使用二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)试剂与有机碱例如三甲胺和合适的醇组合进行。例如，DPPA和t-BuOH将得到4，其中Y＝Boc。类似地，使用苯甲醇将得到Y＝Cbz，使用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇将得到Y＝Teoc，并且使用2,2,2-(三氯)乙醇将得到Y＝Troc。或者，中间体异氰酸酯可以与水而不是醇反应以产生相应的未保护的胺。然后可以在标准条件下将其转化成保护形式，例如与三氟乙酸酐反应将得到Y＝COCF3，而与氯甲酸苄酯反应将得到Y＝Cbz。
化合物4可以通过与合适的试剂反应而在4-位被选择性卤化，例如NBS在4-位引入溴化物，而NIS在4-位引入碘化物。这些反应最好用单一当量的卤化剂进行以使4-和6-位的二卤化最小化。为了制备离去基团为氯的烷基化亚单位，即5，卤代中间体然后与1,3-二氯丙烯在合适的碱如NaH或K2CO3的存在下反应，该碱用于使NHY基团去质子化并将氯烯丙基化导向该位置。然后将该中间体用合适的试剂例如三丁基氢化锡或三(三甲基甲硅烷基)硅烷处理，以提取卤素原子并引发自由基介导的在侧氯烯丙基上的环化，其生成产物5。
其中离去基团是卤化物或磺酸酯的烷基化亚单位可以经由中间体6制备。化合物6可以通过修改上述步骤由4制备。使用烯丙基溴代替1,3-二氯丙烯，并且在自旋阱TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基)的存在下进行自由基介导的环化。这产生含有N-O键的产物，其通过暴露于Zn和酸如乙酸而裂解以产生6。通过使用标准试剂将6的伯醇转化成LG＝卤化物或磺酸酯，例如溴和三苯基膦可用于制备LG＝Br，而甲磺酰氯和三乙胺可用于制备LG＝OSO2Me。
X和Y的保护基可以在化合物5和7阶段被选择性地去除和替换。对于可能对化合物4后的合成步骤中使用的条件较不稳定的几个Y保护基，这可能是其引入的优选方法。例如，Y＝COCF3可能对烯丙基化反应中使用的碱性条件不稳定，但可以通过将5或7(其中例如Y＝Boc)脱保护，然后与三氟乙酸酐反应来引入。类似地，Y＝Fmoc也可能在相同的碱性条件下不稳定，而Y＝Alloc可能干扰自由基介导的环化。然而，这些替代的保护基可以在其中需要对不同反应条件的稳定性的5和7的后续反应中非常有用。这在以下作为其中X＝保护的NH2的烷基化亚单位的合成中举例说明。
对于5和7，基团X＝保护的OH也可以转化成游离OH(即下面的化合物8)，并由此转化成前药OH。后一转化经由成熟的合成方法进行。例如，8与4-烷基哌嗪羰基氯反应得到5和7，其中X＝哌嗪-1-羧酸酯，其中4-位的N被烷基取代。在另一个实例中，8的游离OH与通用结构R2NP(OR2)2的亚磷酰胺试剂反应，其中R是低级烷基，例如乙基或异丙基，R4是t-Bu、Bn或烯丙基。然后将中间产物用合适的试剂例如过氧化氢或有机过酸氧化，得到5和7，其中X＝OP(O)(OR2)2。
制备2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的一般方法如方案3所示，其中X＝NH2、保护的NH2、NHR1，或保护的NHR1，其中R1为(C1–C6)烷基。
方案3
使含有游离OH基团的化合物8与三氟甲磺酸酐和合适的碱如三乙胺反应，得到化合物9。使用合适的催化剂如Pd(OAc)2和配体如BINAP使该化合物与二苯甲酮亚胺反应以实现胺化并产生化合物10。将二苯甲酮亚胺在酸性条件下裂解以产生化合物11。所需的酸性条件意味着一些保护基Y比其它更合适。例如，Y＝COCF3比Y＝Boc更合适，因此一个方便的途径需要在化合物7的阶段将Y＝Boc交换为COCF3。保护基的其它组合也是可能的，并且可以提供不同的合成优点，这取决于具体的目标化合物。
化合物11可进一步转化为烷基化亚单位12，其X位置带有NHR1(其中R1为(C1–C6)烷基)取代基。例如11可以与乙酸甲酸酐反应以产生甲酰化中间体，其使用硼烷还原以产生12，其中R1＝Me。或者，11可以与醛R1CHO缩合，其中R1是(C1-C6)烷基，得到亚胺，用试剂如硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原，得到12，其中R1＝(C1-C6)烷基。化合物11和12可以使用如上所述的标准条件转化为受保护的类似物13和14，例如与三氟乙酸酐的反应将产生X＝NHZ和NZR1，其中Z＝COCF3并且R1为(C1–C6)烷基，而与芴基甲氧基羰基氯的反应将产生X＝NHZ和NZR1，其中Z＝Fmoc并且R1为(C1–C6)烷基。
制备掺入2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位和DNA小沟结合部分(DB)的DNA烷基化剂的一般方法示于方案4中。
方案4
在15含有X＝OH的情况下，通过适当的方法(例如，对于Y＝Boc，通过用HCl处理)除去保护基Y，并使得到的中间体与DNA小沟结合单元Ar1CO2H或Ar3CH＝CHCO2H在合适的酰胺偶联剂如EDCI或HOBt的存在下反应。也可以使用DNA小沟结合单元的其它活化形式，例如酰基氯。该方法直接产生其中X＝OH的17。
在15含有X＝保护的OH或保护的NH2或保护的NHR1的情况下，合成经由中间体16以2个步骤进行。本领域技术人员清楚的是，应适当选择X和Y中的保护基，以允许Y在X中使用的保护基存在下脱保护。例如，如果Y是Boc，则X不应是NHBoc或NRBoc，或任何其它对酸过于敏感的保护基，例如NHTeoc或NRTeoc。通过遵循上文所示的一般方案，正交保护基的合适组合是容易获得的。以与上述相同的一般方式进行酰胺偶联以形成化合物16，其中Y＝-C(O)Ar1或-C(O)-CH＝CH-Ar3，并且通过除去X中的保护基将16转化成17。在化合物17含有X＝NH2的情况下，则二苯甲酮亚胺可用作合适的保护的前体，即，15其中X＝N＝C(Ph)2。
相同的方法可用于制备有效负荷，其中侧链含有两个连接的芳环，通过取代适当的侧链酸，即通过使用Ar2C(O)NHAr1CO2H或Ar3CH＝CHC(O)NHAr1CO2H。
方案5显示了合成其中X为NH2的本发明化合物的预示性实例。
方案5
在方案5中提出的合成中，含有游离氨基的2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位(通用结构22)可以通过类似于所报道的开环-CBI化合物的方法(Bioorg.Med.Chem.(2016)24,6075)制备。特别地，使用三氟甲磺酸酐和三乙胺将化合物18转化成三氟甲磺酸酯19。使用二苯甲酮亚胺和Pd(OAc)2催化剂和BINAP配体胺化化合物19，得到20。使用甲醇中的HCl或二氯甲烷中的TFA选择性裂解Boc保护基，并使用EDCI作为偶联剂使所得中间体与合适的侧链酸反应，得到酰胺21。使用含水乙酸除去二苯甲酮保护基，得到所需产物22。该方法还可以应用于18的R和S对映异构体，得到22的相应R和S对映异构体。
具有合适取代基的许多DNA小沟结合单元酸Ar1CO2H或Ar3CH＝CHCO2H是可商购的化合物，或者可以容易地通过简单的官能团变化由可商购的化合物制备，例如酯和腈可以水解成羧酸，硝基取代基可以还原成氨基取代基，其可以进一步烷基化或酰化，和卤化物取代基可以经历一系列金属介导的反应和/或置换反应以获得各种所需的取代基。此外，用于制备合适的DNA小沟结合单元酸的许多其它芳基和杂芳基化合物是已知的化合物，或者可以通过已知合成方法的修改来制备。这些方法中的许多描述于“ComprehensiveHeterocyclic Chemistry III”，由A.R.Katritzky,C.A.Ramsden,E.F.V.Scriven和R.J.K.Taylor,Elsevier,2008编辑。例如，在3.03节(Vol 3，pp 269-351)中评述了吲哚的合成，在10.06节(Vol 10，pp 263-338)中评述了氮杂吲哚的合成，在3.07节(Vol 3，pp497-569)中评述了苯并呋喃的合成，并且在第3.11节(Vol 3，pp 834-930)中评述了苯并噻吩的合成，所有这些通过引用并入本文。关于取代的杂芳基化合物的合成还有许多其他综述，例如在以下出版物中综述了吲哚合成：Chem.Rev.(2006)106,2875；Chem.Rev.(2005)105,2873；Perkin Trans 1(2000),1045。
更具体地，对于作为DNA小沟结合单元酸的应用，已知产生在所需2-位具有羧酸酯取代基的杂芳基化合物的方法。这些中的许多包括在以上引用的评论中，但在此还给出了具体实例：对于吲哚-2-羧酸酯Org.Lett.(2016)18,3586；Org.Lett.(2004)6,2953；对于氮杂吲哚-2-羧酸酯WO 2009/030725；对于苯并呋喃-2-羧酸酯Org.Lett.(2013)15,3876；J.Chem.Soc.,Perkin Trans.2(1998)1063；和对于苯并噻吩-2-羧酸酯Org.Lett.(2013)15,3876；Org.Lett.(2012)14,5334。
这些方法中的许多已经用于合成用于制备倍癌霉素类似物的特定DNA小沟结合单元酸。例如，72种不同的取代的吲哚-2-羧酸酯的合成及其与开环-CBI烷基化亚单位的偶联描述于Bioorg.Med.Chem.(2003)11,3815中。用于制备倍癌霉素类似物的一系列取代的吲哚-2-羧酸酯的其它实例描述于J.Med.Chem.(2017)60,5834；ChemMedChem(2014)9,2193；Eur.J.Org.Chem.(2006)2314；和J.Am.Chem.Soc.(1997)119,4977；同时多种取代的肉桂酸的类似用途描述于J.Med.Chem.(1997)40,972。还已经报道了其中Ar1连接至芳基或杂芳基Ar3的类型的DNA小沟结合单元酸的合成，例如在WO 2011/133039；J.Med.Chem.(2003)46,634；和J.Org.Chem.(2001)66,6654(其描述了将吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吡咯、噻吩、咪唑和噻唑等环系结合在一起的这种侧链132的合成)。
本领域技术人员将认识到，Ar1与Ar2或Ar3连接的许多其它侧链可以通过使用标准方法和偶联试剂在含有氨基取代基的Ar1单元和含有羧酸取代基的Ar2或Ar3单元之间形成酰胺键，并使用适合于在具体实施例中涉及的其它取代基的适当保护基来制备。因此，有大量信息和先例描述了在本发明化合物的合成中，制备与DNA烷基化单元反应的酸Ar1CO2H或Ar3CH＝CHCO2H或Ar2CONHAr1CO2H或Ar3CH＝CHCONHAr1CO2H的一般和具体方法。
掺入2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位和小沟结合侧链的DNA烷基化剂可用作ADC的有效负荷。为此，必须使用接头将有效负荷连接至抗体。该接头可以以几种不同的方式连接到该有效负荷上。例如，接头可以在X位置连接，其可以经由氨基甲酸酯(-OC(O)NHR或-OC(O)NR2或-NHC(O)OR或-NRC(O)OR’)或经由醚(-OR)官能团。这些类型的接头需要在ADC代谢后片段化以释放X＝OH或NH2或NHR，一种类型的连接称为‘无痕’接头。合适的接头类型的若干实例是已知的，其通常并入自消耗间隔物，例如对-氨基苄基醚或对-氨基苄基氨基甲酸酯，其可以以影响其断裂速率的方式进一步取代，或连接至额外的可裂解间隔物，例如N,N-二烷基-1,2-二氨基乙烷。
以下示出了代表性药物-接头化合物的合成的说明性实例，所述代表性药物-接头化合物包含至X位置的无痕接头。
方案6概括了本发明的化合物的制备，其中接头通过酚氨基甲酸酯连接。
方案6
在该方案中，化合物23与氯甲酸4-硝基苯基酯反应，然后产物与单Boc保护的N,N'-二甲基-1,2-二氨基乙烷反应，得到24。将24的Boc基团使用TFA脱保护，得到相应的TFA盐。活化马来酰亚胺-缬氨酸-瓜氨酸-PABA化合物25如(Mol.Pharm.(2015)12,1813)所述制备。TFA盐和25在微碱性条件下反应，得到药物-接头26。
方案7概述了其中接头经由酚醚连接的本发明化合物的制备。
方案7
在该方案中，使用合适的碱如MeLi将苯酚18去质子化，然后与已知的缬氨酸-丙氨酸-PAB-溴化物化合物27(WO 2018/035391)反应，得到化合物28。通过用TFA处理除去两个Boc保护基，随后在DIPEA存在下用(Boc)2O处理代替脂族胺上的Boc保护基，得到化合物29。使用EDCI作为偶联剂使该化合物与5-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-甲酸反应以产生30。用TFA除去Boc保护基，胺与市售NHS酯31反应，得到有效负荷-接头化合物32。
方案8概述了本发明化合物的制备，其中接头通过氨基甲酸酯连接。
方案8
化合物33与已知的二硫氯甲酸酯试剂34(ACS Med.Chem.Lett.(2016)7,988)在作为碱的吡啶的存在下反应，得到本发明的化合物35。
这些实施例还用于说明接头应含有用于体内选择性代谢或反应的特定官能团。实例包括被溶酶体酶识别的二肽(例如，为组织蛋白酶的识别裂解位点的缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-丙氨酸二肽)或在暴露于高水平的细胞内还原剂如谷胱甘肽时被裂解的二硫键。该接头还应该含有允许与抗体连接的官能团，例如选择性地与硫醇反应的马来酰亚胺，例如通过还原抗体链内二硫键产生的那些，或在位点选择性修饰的抗体中改造的半胱氨酸残基上的那些。
用于将有效负荷连接至接头的替代位点是在侧链Y内的官能团处。当X＝OH或X＝前药OH时，可使用该方法。在后一种情况下，通常在连接侧链之前将前药引入烷基化亚单位，如以下方案9中所示。
方案9
方案9概述了本发明化合物的制备，其中接头经由氨基甲酸酯连接至侧链。在该方案中，烷基化亚单位的酚被保护为氨基甲酸酯前药。使化合物18与4-甲基哌嗪甲酰氯在DMAP的存在下反应，得到化合物36。使用HCl除去Boc保护基，并使用EDCI作为偶联剂使中间体与5-(2-(甲基氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-甲酸反应，得到化合物37。与上述活化的接头25反应，得到药物-接头38。
当前药为磷酸酯OP(O)(OH)2时，合成优选使用磷酸酯中间体OP(O)(OR4)2进行直至磷酸酯脱保护的最后步骤。在连接至侧链Y时，关于接头如何连接至侧链存在许多灵活性。该连接可以是无痕的，如以上方案中所示，对于其合适的侧链官能团包括醇(用于氨基甲酸酯连接)、伯胺和仲胺(用于氨基甲酸酯连接)、叔胺(用于季盐连接)和硫醇(用于二硫化物连接)。这些官能团可以在任何确定的取代基位置处连接至侧链。该连接也可以是没有痕迹的连接，即在从ADC裂解之后，有效负荷仍然包含接头的片段。当接头片段的结构和位置不干扰有效负荷对DNA的烷基化，即不有害地影响释放的物质的细胞毒性时，该方法是合适的。在该限制内，非无痕接头可以连接至已经定义的任何类型的侧链反应性部分RM。
5.4本发明化合物的用途
本发明的化合物包含用于制备ADC和其它生物活性化合物的高细胞毒性有效负荷或有效负荷组分。
其中2-甲基苯并噁唑亚单位与DNA小沟结合单元连接的本发明化合物可通过经由接头连接抗体或其它配体结合基团转化为ADC。接头可以通过羟基或氨基X直接连接到DNA烷基化亚单位，或通过DNA小沟结合单元间接连接到DNA烷基化亚单位。
可以针对ADC旨在用于的特定临床应用来选择结合配体(例如抗体)和适当的接头。接头的性质可影响缀合物的药代动力学性质，因此应针对与待使用的结合配体的相容性和缀合物作为整体的药理学要求进行选择。接头可以包括延伸单元、间隔单元和增加溶解度的部分。
这样的接头基团、延伸单元和间隔单元的实例包括但不限于在US7,964,566B2和US2017/0232108A1中描述的那些，其通过引用整体并入本文。
在一个方面，本发明提供式I、Ia、II、IIa、III或IIIa的化合物在制备ADC中的用途。
在另一方面，本发明提供了制备ADC或ADC组分的方法，其包括使式I、Ia、II、IIa、III或IIIa的化合物与接头或接头-抗体部分反应。
新的2-甲基苯并噁唑DNA烷基化单元的亲脂性比存在于许多倍癌霉素类似物中的广泛使用的CBI烷基化单元小得多，如实施例6和24所示。
这将使得相应的ADC更容易制造，因为有效负荷组分将更易溶于用于缀合抗体-接头组分的水性溶剂中。亲脂性较低的有效负荷还将导致ADC聚集较少，这将进一步简化制造。减少的聚集将降低体内免疫应答的风险，并且较低亲脂性的ADC将具有从血流中更长的清除并且因此具有更大的总体暴露。总之，基于2-甲基苯并噁唑的有效负荷将产生更容易制备、更安全和更有效的ADC。
基于倍癌霉素的2-甲基苯并噁唑类似物的DNA烷基化剂是高度细胞毒性的化合物。这在实施例7和25中证明，实施例7和25描述了将本发明的化合物与开环-CBI-TMI进行比较的细胞毒性测试。后者被广泛认为具有足够的细胞毒性效力以用作ADC有效负荷。用化合物23进行开环-CBI-TMI与本发明的化合物之间的最接近的比较。因为化合物23共享相同的小沟结合侧链(即TMI)可以对这两种化合物进行直接的头对头比较，这证明了相等的细胞毒性效力。本发明化合物的高细胞毒性是非常令人惊奇的。2-甲基苯并噁唑类似物在结构上与已知的COI倍癌霉素类似物(Bioorg.Med.Chem.Lett.(2010)20,1854)密切相关。如开环-COI-TMI所示，这些结构之间的唯一差异是噁唑环稠合的取向和2-取代基的性质(Me相对于CO2Me)。然而，COI倍癌霉素类似物的细胞毒性比CBI类似物低数百倍，使得COI类似物不适合用作ADC有效负荷。
本发明的2-甲氧基苯并噁唑倍癌霉素类似物的另一个优点是它们在生理条件下在水性缓冲液中经历快速水解以形成无活性产物，如实施例8和26中所示。
这意味着它们不太可能在循环中持续非常长的时间，因此，如果发生从ADC的全身释放，则它们不太可能引起相关的离机制毒性(off-mechanism toxicity)。这种稳定性也是非常令人惊奇的，因为已经发现倍癌霉素类似物的细胞毒性和水稳定性是相关的。换言之，所有先前报道的细胞毒性最强的类似物(包括CBI)也是最稳定的，因此所有先前报道的类似物如果释放到体循环中，具有引起不期望的副作用的潜能。
虽然本发明的化合物主要用作待并入ADC中的有效负荷，但在一些实施方案中，它们可在其自身的权利中用作治疗剂。因此，本发明还涉及包含式I、Ia、II、IIa、III或IIIa的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
术语“药学上可接受的载体”是指可以与式I、Ia、II、IIa、III或IIIa的化合物一起施用给受试者的载体(例如佐剂或媒介物)，其通常是安全的，无毒的，并且既不是生物学上也不是其它方面不合需要的，包括适用于兽医以及人类药物用途的载体。
可用于组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)(例如生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、用于药物剂型的表面活性剂(例如吐温或其它类似的聚合物递送基质)、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲液物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精如α-、β-和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-3-环糊精，或其它溶解的衍生物也可有利地用于增强递送。油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似分散剂，其通常用于调配医药学上可接受的剂型，例如乳液和/或悬浮液。
本发明的药物组合物可以作为单一剂量或在多剂量方案中作为单独的治疗剂或与一种或多种另外的治疗剂组合同时、顺序或分开施用。所述一种或多种另外的治疗剂将取决于待治疗的疾病或病症或其它期望的治疗益处。如本领域技术人员已知的，一种或多种另外的治疗剂可以针对特定药剂指示或批准的治疗量使用。
该药物组合物被配制为允许通过任何选择的途径施用给受试者，包括但不限于口服或肠胃外(包括局部、皮下、肌内和静脉内)施用。在一些实施方案中，组合物被配制用于口服、静脉内、皮下、肌内、经皮、腹膜内或其它药理学上可接受的途径施用。例如，组合物可以与根据预期的施用途径和标准药学实践选择的合适的药学上可接受的载体(包括赋形剂、稀释剂、助剂及其组合)一起配制。例如，组合物可以作为粉末、液体、片剂或胶囊口服施用，或作为软膏剂、乳膏剂或洗剂局部施用。合适的制剂可以根据需要含有另外的试剂，包括乳化剂、抗氧化剂、调味剂或着色剂，并且可以适于立即释放、延迟释放、修饰释放、持续释放、脉冲释放或控制释放。
组合物可以通过肠胃外途径施用。肠胃外剂型的实例包括水溶液、等渗盐水或活性剂的5％葡萄糖，或其它熟知的药学上可接受的赋形剂。例如，环糊精或本领域技术人员熟知的其它增溶剂可用作递送治疗剂的药物赋形剂。
适于口服施用的剂型的实例包括但不限于片剂、胶囊、锭剂等形式，或能够提供治疗有效量的组合物的任何液体形式如糖浆剂、水溶液、乳剂等。胶囊可以含有任何标准的药学上可接受的材料，例如明胶或纤维素。片剂可根据常规程序通过压制活性成分与固体载体和润滑剂的混合物来配制。固体载体的实例包括淀粉和糖膨润土。活性成分还可以以含有粘合剂(例如乳糖或甘露醇)、常规填充剂和压片剂的硬壳片剂或胶囊的形式施用。
适于透皮施用的剂型的实例包括但不限于透皮贴剂、透皮绷带等。
适用于组合物的局部施用的剂型的实例包括任何洗剂、棒、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、凝胶等，无论是直接施用于皮肤还是经由媒介物例如垫、贴剂等。
适于栓剂施用组合物的剂型的实例包括插入身体孔口的任何固体剂型，特别是经直肠、阴道和尿道插入的那些。
适于注射组合物的剂型的实例包括通过大丸剂递送，例如通过静脉内注射、皮下、真皮下和肌内施用或口服施用的单次或多次施用。
适合于组合物的贮库施用的剂型的实例包括丸剂或固体形式，其中活性剂被截留在可生物降解的聚合物、微乳液、脂质体的基质中或被微囊化。
用于组合物的输注装置的实例包括用于提供所需数量的剂量或稳态施用的输注泵，并且包括可植入的药物泵。用于组合物的可植入输注装置的实例包括任何固体形式，其中活性物质被包封在或分散在整个可生物降解的聚合物或合成聚合物如硅酮、硅酮橡胶、硅橡胶或类似聚合物中。
适于组合物的经粘膜递送的剂型的实例包括用于灌肠剂、阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫、雾化溶液、粉末和类似制剂的存放溶液，其除了活性成分之外还含有本领域已知的合适的载体。这类剂型包括适于吸入或吹入组合物的形式，包括包含在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物和/或粉末中的溶液和/或悬浮液的组合物。组合物的经粘膜施用可利用任何粘膜，但通常利用鼻、颊、阴道和直肠组织。适于鼻施用组合物的制剂可以以液体形式施用，例如鼻喷剂、滴鼻剂，或通过喷雾器通过气雾剂施用，包括聚合物颗粒的水性或油性溶液。制剂可以制备成水溶液，例如在盐水中的溶液、使用苯甲醇或其它合适的防腐剂的溶液、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其它增溶或分散剂。
适于组合物颊或舌下施用的剂型的实例包括锭剂、片剂等。适合于该组合物的眼科施用的剂型的实例包括插入物和/或包含在药学上可接受的水性或有机溶剂中的溶液和/或悬浮液的组合物。
组合物制剂的实例可以发现于例如Sweetman,S.C.(Ed.).Martindale.TheComplete Drug Reference,33rd Edition,Pharmaceutical Press,Chicago,2002,2483pp.；Aulton,M.E.(Ed.)Pharmaceutics.The Science of Dosage FormDesign.Churchill Livingstone,Edinburgh,2000,734pp.；和Ansel,H.C,Allen,L.V.和Popovich,N.G.Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,7th Ed.,Lippincott 1999,676pp。在本领域技术人员已知的各种出版物中描述了用于制造药物递送系统的赋形剂，包括例如Kibbe,E.H.Handbook of Pharmaceutical Excipients,3rdEd.,American Pharmaceutical Association,Washington,2000,665pp。USP还提供了缓释口服剂型的示例，包括配制为片剂或胶囊的那些。参见，例如，The United StatesPharmacopeia 23/National Formulary 18,The United States PharmacopeialConvention,Inc.,Rockville MD,1995(下文中称为“USP”)，其还描述了确定延长释放和延迟释放片剂和胶囊的药物释放能力的具体测试。用于延长释放和延迟释放制品的药物释放的USP测试基于药物相对于经过的测试时间从剂量单位的溶出。各种测试装置和程序的描述可以在USP中找到。F.D.A.提供了关于缓释剂型分析的进一步指导。(参见Guidance forIndustry.Extended release oral dosage forms:development,evaluation,andapplication of in vitro/in vivo correlations.Rockville,MD:Center for DrugEvaluation and Research,Food and Drug Administration,1997)。
本文所述的剂型可以是适于用作待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位的形式，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质。
可以改变药物组合物中活性成分的剂量水平，以提供对于特定患者、组合物和施用模式有效实现所需治疗效果而对患者无毒性的活性成分的量(有效量)。
所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所使用的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所使用的本发明的特定化合物的排泄速率，与所使用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质，年龄、性别、体重、状况、所治疗的患者的一般健康和先前病史，以及医学领域熟知的类似因素。通常，每日量或方案应在约0.01mg至约2000mg本发明化合物/千克(kg)体重的范围内。
6.实施例
一般方法和材料
所有试剂均以试剂级购得且不经进一步纯化即使用。用于反应的溶剂在使用前根据标准程序蒸馏。石油醚是指沸点为40-60℃的馏分，根据标准程序，即通过无水Na2SO4或MgSO4干燥溶剂。柱色谱法在硅胶(Merck 230-400目)上进行。
NMR光谱在Bruker Avance 400MHz仪器上记录1H和100MHz的13C光谱化学位移以百万分率(ppm)报告，并在1H光谱中校准到作为内标的四甲基硅烷(0ppm)，在13C光谱中校准到残留溶剂。多重性报告如下：br＝宽，s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，dt＝双三重峰，ddd＝双二重峰的双重峰。使用Bruker microTOF-Q II或Agilent 6530B Accurate Mass Q-TOF质谱仪获得高分辨率质谱(HRMS)。LRMS用SurveyorMSQ质谱仪进行。
除非给出替代的一般方法和材料，否则以上一般材料和方法适用于以下所有实例。
实施例1. 6-甲基-4-氧代-8,8a-二氢-1H-环丙烷并[c]噁唑并[4,5-e]吲哚-2(4H)-羧酸叔丁酯(50)
方案10
将NaH2PO4·2H2O(4.29g，27.5mmol)的H2O(10mL)溶液加入3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛39(5.03g，27.5mmol)的DMSO(25mL)溶液中。在50分钟内向搅拌的混合物中滴加NaClO2(80％，4.35g，38.5mmol)的H2O(25mL)溶液，保持内部温度低于45℃。将深红色-棕色混合物在室温搅拌16h，然后倒入NaHCO3水溶液(5％，80mL)中。将混合物用CH2Cl2(×2)洗涤并且将水相用c.HCl酸化以得到pH～1。将混合物用EtOAc(×3)萃取，并将合并的萃取物用盐水洗涤，然后干燥并蒸发，得到3,4-二羟基-5-硝基苯甲酸(40)，为黄褐色固体(5.12g，94％)；1HNMR(d6-DMSO)δ13.02(br s,1H),10.80(br s,2H),7.87(d,J＝2.0Hz,1H),7.57(d,J＝2.0Hz,1H)。
将40(3.99g，20.0mmol)在MeOH(60mL)和c.H2SO4(1.5mL)中的混合物在回流下搅拌19h，然后冷却并蒸发。将残余物在EtOAc和盐水(×2)之间分配。将EtOAc萃取物干燥并蒸发，并将得到的固体从H2O中重结晶，得到3,4-二羟基-5-硝基苯甲酸甲酯(41)，为橙棕色结晶固体(3.30g，77％)；mp 137℃至139℃；1H NMR(d6-DMSO)δ10.84(br s,2H),7.89(d,J＝2.1Hz,1H),7.57(d,J＝2.1Hz,1H),3.83(s,3H)。
将在二噁烷中的HCl(4M，2.94mL，11.8mmol)和Pd/C(10％，0.25g)添加至41(2.51g，11.8mmol)的EtOH(35mL)溶液中。将混合物用氮气脱气，用氢气冲洗，然后在氢气球下搅拌直至还原完成(～8h)。将混合物通过硅藻土过滤，用EtOH洗涤，蒸发滤液，得到3-氨基-4,5-二羟基苯甲酸甲酯盐酸盐(42)，为浅黄色固体(3.0g)，将其直接用于下一步骤。Anal.(C8H10NO4)计算为[M+H]+184.1；实测值184.1。
将原乙酸三甲酯(13.6mL，107mmol)加入到一部分如上所述制备的42(2.71g)中。将悬浮液在回流下搅拌1h，然后冷却并用石油醚稀释。滤出沉淀物并干燥，得到7-羟基-2-甲基苯并[d]噁唑-5-甲酸甲酯(43)，为浅褐色固体(2.02g，91％，得自41)；1H NMR(d6-DMSO)δ10.76(s,1H),7.66(d,J＝1.5Hz,1H),7.43(d,J＝1.5Hz,1H),3.85(s,3H),2.62(s,3H)；13CNMR(d6-DMSO)δ166.1,165.0,143.0,142.2,141.9,126.5,112.1,111.1,52.2,14.1。Anal.(C10H9NO4)计算为[M+H]+208.06043；实测值208.06061。
将苄基溴(98％，1.24mL，10.2mmol)和K2CO3(1.48g，10.7mmol)加入到43(2.02g，9.75mmol)的DMF(20mL)溶液中，并将混合物在室温下搅拌18小时。将混合物用H2O稀释，滤出固体并干燥，得到7-(苄氧基)-2-甲基苯并[d]噁唑-5-甲酸甲酯(44)(2.81g，97％)，为浅褐色固体；1H NMR(d6-DMSO)δ7.83(d,J＝1.3Hz,1H),7.63(d,J＝1.3Hz,1H),7.54-7.49(m,2H),7.46-7.34(m,3H),5.36(s,2H),3.87(s,3H),2.63(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ165.9,165.4,143.0,142.8,142.6,136.1,128.5,128.2,128.0,126.7,113.2,109.5,70.5,52.4,14.1。Anal.(C17H15NO4)计算为[M+H]+298.10738；实测值298.10834。
将KOH(1.62g，29.1mmol)的H2O(15mL)溶液添加至44(2.79g，9.38mmol)的MeOH(60mL)悬浮液中并且将混合物在70℃下搅拌40min。将MeOH蒸发并且将水性剩余物在0℃下用HCl水溶液(2N，12mL)酸化。滤出沉淀的固体并干燥，得到7-(苄氧基)-2-甲基苯并[d]噁唑-5-甲酸(45)，为灰白色固体(2.62g，98％)；1H NMR(d6-DMSO)δ13.06(br s,1H),7.81(d,J＝1.3Hz,1H),7.62(d,J＝1.3Hz,1H),7.53-7.48(m,2H),7.46-7.34(m,3H),5.36(s,2H),2.63(s,3H)。Anal.(C16H13NO4)计算为[M+H]+284.09173；实测值284.09164。
将Et3N(1.54mL，11.1mmol)和DPPA(97％，2.25mL，10.1mmol)添加至45(2.61g，9.21mmol)的无水叔丁醇(80mL)悬浮液中，并将混合物在回流下搅拌3小时。蒸发溶剂，残余物经柱色谱纯化(石油醚：EtOAc9：1，然后4：1)，得到(7-(苄氧基)-2-甲基苯并[d]噁唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(46)，为乳白色固体(2.44g，75％)；1H NMR(d6-DMSO)δ9.37(s,1H),7.52-7.47(m,2H),7.44-7.33(m,4H),7.21(s,1H),5.21(s,2H),2.56(s,3H),1.48(s,9H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.1,152.8,142.8,142.4,136.8,136.3,135.1,128.5,128.2,128.1,100.72,100.67,79.1,70.3,28.1,14.1。Anal.(C20H22N2O4)计算为[M+H]+355.1652；实测值355.1668。从EtOAc/石油醚重结晶样品，得到白色针状物，mp 150-152℃。
在0℃经10分钟将NBS(1.16g，6.52mmol)分批添加至46(2.31g，6.52mmol)的CH3CN(100mL)溶液中。将混合物在室温搅拌3h，然后蒸发溶剂。将残余物溶于EtOAc，用H2O(×2)，然后用盐水洗涤溶液，然后干燥并蒸发。将所得乳白色固体用EtOAc/石油醚重结晶，得到(7-(苄氧基)-4-溴-2-甲基苯并[d]噁唑-5-基)氨基甲酸叔丁酯(47)，为白色固体(2.15g，76％)；mp 154-156℃；1H NMR(CDCl3)δ8.01(s,1H),7.53-7.47(m,2H),7.43-7.32(m,3H),7.03(s,1H),5.27(s,2H),2.65(s,3H),1.55(s,9H)；13C NMR(CDCl3)δ165.0,152.9,143.0,142.0,136.4,136.1,133.9,128.8,128.6,128.3,102.2,92.4,81.4,71.6,28.5,14.8。Anal.(C20H21 79BrN2O4)计算为[M+H]+433.0757；实测值433.0762；(C20H21 81BrN2O4)计算为[M+H]+435.0740；实测值435.0745。将母液蒸发并将残余物通过柱色谱法(石油醚：EtOAc 4：1)纯化以得到更多的47(0.60g，21％)。
将1,3-二氯丙烯(混合异构体，90％，1.92mL，18.6mmol)和K2CO3(4.3g，31mmol)添加至47(2.69g，6.21mmol)的DMF(12mL)溶液中并且将混合物在80℃下搅拌7h。蒸发DMF，残余物在EtOAc和H2O之间分配。水层用EtOAc(×2)再次萃取，合并的EtOAc层用盐水(×3)洗涤，然后干燥并蒸发，得到粗(7-(苄氧基)-4-溴-2-甲基苯并[d]噁唑-5-基)(3-氯烯丙基)氨基甲酸叔丁酯(48)，为浅棕色胶状物(3.21g，100％)；1H NMR(CDCl3)(E和Z异构体与Boc旋转异构体的混合物)δ7.50-7.32(m,5H),6.85-6.66(m,1H),6.05-5.88(m,2H),5.34-5.15(m,2H),4.52-4.44,4.42-4.26,4.06-4.03,3.89-3.80(4×m,2H),2.69(s,3H),1.56(s,9H)。Anal.(C23H24 79BrClN2O4)计算为[M+H]+507.06807；实测值507.06909。
在氮气下，将Bu3SnH(97％，1.09mL，3.92mmol)和AIBN(64mg，0.39mmol)加入到48(995mg，1.96mmol)的无水甲苯(15mL)溶液中，并将混合物在回流下搅拌。1.5小时和3小时后加入另外部分的Bu3SnH(97％，0.54mL，2.0mmol)和AIBN(32mg，0.2mmol)。4小时后，蒸发甲苯，残余物在CH3CN和石油醚之间分配。用CH3CN(×2)再次萃取石油醚层，用石油醚(×2)洗涤合并的萃取物，然后蒸发。将残余物通过柱色谱法(石油醚：EtOAc 9：1，然后6：1)纯化以给出呈白色泡沫的粗产物。将其与石油醚(8mL)一起搅拌，得到4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-甲酸叔丁酯(49)，为白色固体(668mg，80％)；mp 142-143℃；1H NMR(CDCl3)δ7.78(br s,1H),7.52-7.45(m,2H),7.43-7.31(m,3H),5.26(s,2H),4.21(dd,J＝11.5,9.7Hz,1H),4.15-3.96(m,3H),3.65(t,J＝9.9Hz,1H),2.62(s,3H),1.57(s,9H)；13C NMR(CDCl3)δ165.0,152.6,143.7,141.4,139.3,136.9,136.4,128.8,128.4,128.1,111.6,97.6,81.2,71.4,53.2,46.8,40.9,28.7,14.8。Anal.(C23H25ClN2O4)计算为[M+H]+429.15756；实测值429.15735。
在氮气下在0℃将NH4HCO2水溶液(25％，3.9mL，15.4mmol)和Pd/C(10％，用53％H2O润湿，0.13g)添加至48(660mg，1.54mmol)的THF(10mL)溶液中，将混合物在该温度下剧烈搅拌。3小时后加入另外部分的NH4HCO2水溶液(25％，3.9mL，15.4mmol)和Pd/C(10％，用53％H2O润湿，0.13g)。7小时后，将混合物通过硅藻土过滤，用EtOAc洗涤。将来自滤液的EtOAc层用盐水洗涤，然后干燥并蒸发。残余物用EtOAc/石油醚重结晶，得到8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-甲酸叔丁酯(18)，为白色固体(444mg，85％)；mp234-238℃；1H NMR(CDCl3)δ7.66(br s,1H),7.63(br s,1H),4.18(dd,J＝11.5,9.6Hz,1H),4.11-3.95(m,3H),3.63(表观t,J＝9.9Hz,1H),2.62(s,3H),1.56(s,9H)；13C NMR(CDCl3)δ165.2,153.0,141.1,140.9,139.2,136.1,111.1,99.9,81.7,53.3,46.9,40.8,28.7,14.8。Anal.(C16H19ClN2O4)计算为[M+H]+339.11061；实测值339.11149。
将K2CO3(41mg，0.3mmol)加入到18(67mg，0.2mmol)的DMF(1mL)溶液中，并将混合物在室温下搅拌3.5小时，然后用EtOAc和H2O稀释。用盐水(×3)洗涤EtOAc层，然后干燥并蒸发。残余物通过柱色谱(石油醚：EtOAc 2：3，然后1：4)纯化，得到50，为无色油状物(22mg，37％)；1H NMR(CDCl3)δ6.72(s,1H),4.05(d,J＝11.4Hz,1H),3.99(dd,J＝11.4,5.0Hz,1H),2.94-2.88(m,1H),2.57(s,3H),2.01(dd,J＝7.8,4.0Hz,1H),1.55(s,9H),1.46(dd,J＝4.9,4.4Hz,1H)；13C NMR(CDCl3)δ175.1,165.5,158.6,151.7,148.1,145.8,109.8,83.6,53.7,33.1,28.3,24.9,23.4,14.6。Anal.(C16H18N2O4)计算为[M+H]+303.13393；实测值303.13458。
实施例2.(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-基)甲酮(23)
方案11
将49(51mg，0.12mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温下搅拌3h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.5mL)中并加入5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-甲酸(31.4mg，0.13mmol)和EDCI.HCl(46mg，0.24mmol)。将混合物在室温搅拌1h，然后加入稀NaHCO3水溶液。将沉淀的固体滤出，用H2O洗涤，并干燥。将粗产物从EtOAc重结晶，得到(4-(苄氧基)-8-(氯甲基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-基)甲酮(51)，为灰白色固体(34mg，51％)；mp 225-227℃；1H NMR(d6-DMSO)δ11.44(d,J＝1.4Hz,1H),8.04(br s,1H),7.53-7.47(m,2H),7.45-7.33(m,3H),7.03(d,J＝2.0Hz,1H),6.97(s,1H),5.27(s,2H),4.74(t,J＝10.2Hz,1H),4.40(dd,J＝10.9,5.3Hz,1H),4.25-4.16(m,1H),4.13(dd,J＝10.9,3.1Hz,1H),4.06-4.00(m,1H),3.93(s,3H),3.83(s,3H),3.78(s,3H),2.64(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ165.2,160.1,149.2,142.3,141.5,139.9,139.1,138.5,136.7,136.3,130.8,128.6,128.2,127.9,125.3,123.2,113.1,106.1,70.5,61.1,61.0,56.0,54.6,46.8,40.7,14.2。Anal.(C30H28ClN3O6)计算为[M+H]+562.17394；实测值562.17311。
在氮气下在0℃下将NH4HCO2水溶液(25％，0.14mL，0.55mmol)和Pd/C(10％，用53％H2O润湿，34mg)添加至51(31mg，0.055mmol)的THF(20mL)溶液中，并且将混合物在此温度下剧烈搅拌。1小时后加入更多的NH4HCO2水溶液(25％，0.28mL，1.1mmol)和Pd/C(10％，用53％H2O润湿，35mg)。2小时后，将混合物通过硅藻土过滤，用THF洗涤，并将滤液在30℃蒸发至干燥。残余物用H2O研磨，滤出固体并干燥。用EtOAc进一步研磨得到23，为白色固体(21mg，81％)；mp 285℃(dec)；1H NMR(d6-DMSO)δ11.39(d,J＝1.6Hz,1H),10.45(s,1H),7.84(s,1H),7.01(d,J＝2.1Hz,1H),6.96(s,1H),4.71(t,J＝10.1Hz,1H),4.36(dd,J＝10.9,5.1Hz,1H),4.17-4.09(m,2H),3.97(dd,J＝11.2,7.8Hz,1H),3.94(s,3H),3.82(s,3H),3.78(s,3H),2.61(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.8,156.0,149.2,141.3,141.2,139.8,139.1,138.6,136.2,131.0,125.2,123.2,111.0,105.9,101.4,98.0,61.1,61.0,56.0,54.7,46.9,40.7,14.2。Anal.(C23H22ClN3O6)计算为[M+H]+472.12699；实测值472.12694。
实施例3.(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5-(2-(二甲氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-基)甲酮(52)
方案13
将18(33mg，0.097mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温下搅拌4h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入5-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-甲酸盐酸盐(34mg，0.12mmol)、EDCI.HCl(65mg，0.34mmol)和无水甲苯磺酸(3.3mg，0.019mmol)。将混合物在室温搅拌1.5h，然后在冰浴中冷却。加入EtOAc(50mL)和H2O(10mL)，用饱和NaHCO3水溶液将pH调节至8-9。分离EtOAc层，用水洗涤，然后干燥并蒸发。残余物通过柱色谱法纯化(CH2Cl2:MeOH 10:1)得到52(34mg，75％)；mp 206-210℃(dec)；1HNMR(d6-DMSO)δ11.59(br s,1H),10.46(br s,1H),7.91(s,1H),7.38(d,J＝8.9Hz,1H),7.17(d,J＝2.3Hz,1H),7.05(d,J＝1.7Hz,1H),6.92(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),4.76(t,J＝10.2Hz,1H),4.48-4.40(m,1H),4.22-4.06(m,4H),4.04-3.95(m,1H),2.80(poorlyresolved t,J＝5.3Hz,2H),2.61(s,3H),2.34(s,6H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.7,159.8,152.8,141.28,141.25,138.6,136.2,131.6,131.0,127.5,115.7,113.1,111.0,105.1,103.3,101.6,65.6,57.4,54.5,46.9,45.1,40.8,14.2。Anal(C24H25ClN4O4)计算为[M+H]+469.1637；实测值469.1642。
实施例4.N-(2-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羰基)-1H-吲哚-5-基)-5-(2-(二甲氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(53)
方案14
将18(33mg，0.097mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温下搅拌4h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入5-(5-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-甲酰胺基)-1H-吲哚-2-甲酸盐酸盐(43mg，0.097mmol)、EDCI.HCl(65mg，0.34mmol)和无水甲苯磺酸(3.3mg，0.019mmol)。将混合物在室温搅拌1.5h，然后在冰浴中冷却。加入EtOAc(150mL)和H2O(50mL)，用饱和NaHCO3水溶液将pH调节至8-9。分离EtOAc层，用水洗涤，然后干燥并蒸发。残余物通过柱色谱法纯化(CH2Cl2:MeOH 10:1然后5:1)得到53(46mg，75％)；mp231℃(dec)；1H NMR(d6-DMSO)δ11.70(br s,1H),11.59(br s,1H),10.47(br s,1H),10.13(s,1H),8.21(d,J＝1.5Hz,1H),7.93(s,1H),7.57(dd,J＝8.9,1.9Hz,1H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.41-7.27(m,2H),7.22-7.11(m,2H),6.87(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),4.80(t,J＝10.2,1H),4.53-4.43(m,1H),4.24-3.98(m,5H),2.77(poorly resolved t,J＝5.4Hz,2H),2.62(s,3H),2.34(s,6H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.8,159.8,159.5,152.8,141.3,141.2,138.6,138.6,136.3,133.2,132.3,132.1,131.3,127.4,127.1,119.3,115.1,113.2,112.9,112.2,111.1,105.6,103.2,103.1,101.6,65.6,57.5,54.5,46.9,45.2,40.8,39.5,14.2。Anal(C33H31ClN6O5)计算为[M+H]+627.2117；实测值627.2119。
实施例5.N-(2-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羰基)咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)-4-羟基苯甲酰胺(57)
方案15
将6-氨基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯(54)(50mg，0.24mmol)、4-羟基苯甲酸(68mg，0.49mmol)、EDCI.HCl(163mg，0.85mmol)和无水甲苯磺酸(8.7mg，0.05mmol)的DMA(1mL)溶液在室温下搅拌2小时。将混合物用H2O稀释并用EtOAc萃取。将EtOAc层干燥并蒸发，并将残余物通过柱色谱纯化(仅EtOAc，然后EtOAc:MeOH 10:1)，得到6-(4-羟基苯甲酰胺基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯(55)，为绿色-琥珀色固体(41mg，52％)；mp 263-266℃；1H NMR(d6-DMSO)δ10.17,10.16(部分重叠s,2H),9.40-9.35(m,1H),8.64(s,1H),7.93-7.84(m,2H),7.62(d,J＝9.7Hz,1H),7.55(dd,J＝9.8,1.9Hz,1H),6.93-6.84(m,2H),4.30(q,J＝7.1Hz,2H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ165.3,162.7,160.8,142.3,135.6,129.8,127.6,124.5,123.5,118.9,117.5,117.2,115.0,60.1,14.3。Anal(C17H15N3O4)计算为[M+H]+326.1135；实测值326.1125。
将固体KOH(171mg，3.05mmol)加入55(198mg，0.61mmol)的THF(6mL)、甲醇(6mL)和H2O(3mL)溶液中，并将混合物在室温搅拌1h，然后蒸发。将残余物用水(10mL)稀释并用HCl水溶液(5M)酸化至pH<1。滤出固体，用H2O洗涤，干燥，得到6-(4-羟基苯甲酰氨基)咪唑并[1,2-a]吡啶-2-甲酸(56)，为黄色固体(143mg，79％)，mp 268-271℃；1H NMR(d6-DMSO)δ10.17(s,2H),9.40(s,1H),8.59(s,1H),7.95-7.84(m,2H),7.63(d,J＝9.7Hz,1H),7.56(dd,J＝9.7,1.9Hz,1H),6.96-6.83(m,2H),1H not observed；13C NMR(d6-DMSO)δ165.3,163.9,160.8,142.0,136.1,129.8,127.6,124.6,123.5,118.8,117.3,117.2,115.0。Anal(C15H11N3O4)计算为[M+H]+298.0822；实测值298.0818。
将18(38mg，0.11mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温搅拌3h15min，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入56(28mg，0.093mmol)、EDCI.HCl(63mg，0.33mmol)和无水甲苯磺酸(3.3mg，0.019mmol)。将混合物在室温搅拌1.5h。加入EtOAc(150mL)和H2O(50mL)，分离EtOAc层，用H2O(×2)洗涤，然后干燥并蒸发。残余物用MeOH研磨，得到57(30mg，63％)；mp 232-235℃；1H NMR(d6-DMSO)δ10.41(s,1H),10.17(s,2H),9.42(br s,1H),8.62(s,1H),7.97(br s,1H),7.88(d,J＝8.7Hz,2H),7.69(d,J＝9.7Hz,1H),7.56(dd,J＝9.7,2.0Hz,1H),6.90(d,J＝8.7Hz,2H),4.93(t,J＝10.7Hz,1H),4.73-4.62(m,1H),4.18-4.07(m,2H),4.03-3.92(m,1H),2.61(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ165.3,164.7,161.4,160.8,141.4,141.3,141.2,140.9,138.6,136.2,129.8,127.5,124.6,123.0,118.6,117.4,117.1,115.0,111.1,101.5,54.8,46.9,40.7,14.2。Anal(C26H20ClN5O5)计算为[M+H]+518.1226；实测值518.1223。
实施例6：本发明的化合物的亲脂性
使用ChemDraw Professional v.17.0.0软件包(Perkin Elmer InformaticsInc)计算本发明的代表性化合物的亲脂性。结果提供在图1中。
本发明化合物携带多种DNA小沟结合侧链：侧链A为倍癌霉素天然产物中发现的5,6,7-三甲氧基吲哚结构；侧链B已用于ADC BMS-936561(Biopharm.Drug Disp.(2016)37,93)中的有效负荷；并且侧链C已经用于ADC SYD985(Mol.Pharm.(2015)12,1813)中的有效负荷开环-DUBA。
在每种情况下，含有2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的化合物具有比并入开环-CBI烷基化亚单位的那些显著更低的计算logP(大约1.5个单元)，并且这适用于烷基化亚单位是苯酚(X＝OH)还是胺(X＝NH2)的形式。
有效负荷亲脂性的这些实质性降低非常可能导致结合2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的药物-接头和ADC的有利性质。
表1：亲脂性比较
实施例7：细胞毒性
通过测量两种人肿瘤细胞系、宫颈癌SiHa和卵巢癌SKOV3的增殖抑制来测定本发明的有效负荷的细胞毒性。将对数期单层在96孔板中连续暴露于有效负荷5天，然后用磺基罗丹明B染色。IC50通过内插法测定，作为将细胞密度抑制至相同板上未处理对照的50％所需的药物浓度。每个板含有参考化合物开环-CBI-TMI作为内部对照。
表2中给出的数据显示，含有2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的DNA烷基化剂是高度细胞毒性的化合物，IC50在nM或亚-nM范围内，即在认为适合于ADC应用的范围内。
重要的是，化合物23和开环-CBI-TMI具有相同的TMI小沟结合侧链，从而允许头对头比较烷基化亚单位对细胞毒性的作用。在该比较中，2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位产生与开环-CBI相同的细胞毒性，这是值得注意的，因为后者是倍癌霉素-型烷基化亚单位的所有已知变体中最有效的一种(J.Med.Chem.(2009)52,5771)。
23的显著细胞毒性是令人惊奇的，因为密切相关的化合物开环-COI-TMI(其仅在噁唑环稠合的取向和2-取代基的性质上不同)的细胞毒性比相关参照化合物(Bioorg.Med.Chem.Lett.(2010)20,1854)低几百倍。
表2：细胞毒性比较
实施例8：稳定性
通过LC-MS分析研究23和参比化合物开环-CBI-TMI的水稳定性。在37℃下在含有10％DMF的Tris缓冲液(pH 7.4)中以4μM的浓度含有有效负荷的样品以规律的间隔在300-500 min内监测。
如图1所示，开环-CBI-TMI经历了向环丙基形式(CBI-TMI)的清洁转化，其在这些条件下是稳定的。这些观察结果与所报道的行为一致(ChemBioChem(2014)15,1998；J.Am.Chem.Soc.(1994)116,7996)。
相反，如图2所示，虽然23也经历了向相应的环丙基形式的转化(通过特征性UV-可见吸收光谱和质谱鉴定)，但是该化合物在这些条件下不稳定并且快速转化成各种产物。主要产物的紫外可见吸收光谱和质谱与水解一致，即通过加入水开环环丙烷。这样的产物不能将DNA烷基化并且可以被认为是无毒的。衍生自2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的环丙基中间体的不稳定性是非常令人惊讶的，因为在溶剂分解稳定性和细胞毒性效力之间存在良好确定的相关性，并且据报道所有其它已知的与CBI一样具有细胞毒性的烷基化亚单位在中性pH下对水解都是稳定的(J.Med.Chem.(2009)52,5771)。通过用作任何全身释放的有效负荷的解毒机制，含有2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的有效负荷的不稳定性在ADC应用中是有利的。
实施例9.(E)-1-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)-3-(4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(58)
方案16
将18(31.3mg，0.092mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温搅拌4h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.5mL)中并加入4-甲氧基肉桂酸(18mg，0.10mmol)和EDCI.HCl(53mg，0.28mmol)。将混合物在室温搅拌19h。缓慢加入水，滤出沉淀的固体，干燥，得到58，为浅棕色固体(10mg，27％)；1H NMR(d6-DMSO)δ10.39(s,1H),7.96(s,1H),7.80-7.70(m,2H),7.60(d,J＝15.3Hz,1H),7.07-6.97(m,3H),4.63-4.54(m,1H),4.32-4.25(m,1H),4.17-4.08(m,2H),3.98(dd,J＝10.8,7.5Hz,1H),3.31(s,3H),2.60(s,3H)。Anal(C21H19ClN2O4)计算为[M+H]+399.1106；实测值399.1108。
实施例10.(E)-1-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙-2-烯-1-酮(59)
方案17
将18(30.1mg，0.089mmol)和HCl在二噁烷(4M，1mL)中的混合物在室温搅拌4h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入3-羟基-4-甲氧基肉桂酸(19mg，0.10mmol)和EDCI.HCl(51mg，0.27mmol)。将混合物在室温搅拌3h，然后用水稀释并用EtOAc(×2)萃取。将合并的萃取物用水(×3)和盐水洗涤，然后干燥并蒸发。将残余物用少量的EtOAc(ca.1mL)纯化，得到59，为非常淡的绿色固体(7.7mg，21％)；1H NMR(d6-DMSO)δ10.41(s,1H),9.14(s,1H),7.96(s,1H),7.51(d,J＝15.3Hz,1H),7.24(d,J＝2.0Hz,1H),7.16(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.96(d,J＝8.4Hz,1H),6.91(d,J＝15.3Hz,1H),4.63-4.54(m,1H),4.31-4.24(m,1H),4.16-4.06(m,2H),3.95(dd,J＝11.0,7.8Hz,1H),3.83(s,3H),2.60(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.6,163.5,149.6,146.6,142.4,141.3,141.2,138.6,136.0,127.8,121.2,117.2,114.2,111.9,110.7,101.1,55.6,52.8,47.0,40.3,14.2。Anal(C21H19ClN2O5)计算为[M+H]+415.1055；实测值415.1060。
实施例11.(E)-N-(2-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羰基)-1H-吲哚-5-基)-3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(63)
方案18
将5-氨基吲哚-2-甲酸乙酯(60)(354mg，1.73mmol)、4-甲氧基肉桂酸(309mg，1.73mmol)和EDCI.HCl(0.67g，3.46mmol)的DMA(4mL)溶液的混合物在室温下搅拌18小时。加入水，滤出沉淀的固体，用水洗涤，干燥。将粗产物用热EtOH(40mL)搅拌并将悬浮液冷却。滤出固体并干燥，得到(E)-5-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰氨基)-1H-吲哚-2-甲酸乙酯(61)，为乳白色固体(506mg，80％)；mp 244-247℃；1H NMR(d6-DMSO)δ11.82(s,1H),10.03(s,1H),8.15(s,1H),7.58(d,J＝8.6Hz,2H),7.53(d,J＝15.6Hz,1H),7.48-7.37(m,2H),7.12(s,1H),7.02(d,J＝8.6Hz,2H),6.70(d,J＝15.6Hz,1H),4.34(q,J＝7.1Hz,2H),3.80(s,3H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H)。Anal(C21H20N2O4·1/4H2O)计算为C,68.37；H,5.60；N,7.59％；实测值C,68.56；H,5.53；N,7.66％。
将KOH(0.40g，7.1mmol)的水(6mL)溶液加入到61(480mg，1.32mmol)的乙醇(15mL)悬浮液中，并将混合物在回流下加热5分钟。将溶液冷却至室温并用HCl水溶液(2N，5mL)酸化。用水稀释所得悬浮液，滤出固体，用水洗涤，干燥，得到(E)-5-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰氨基)-1H-吲哚-2-甲酸(62)，为浅褐色固体(414mg，93％)；mp 276-279℃；1H NMR(d6-DMSO)δ12.90(br s,1H),11.68(s,1H),10.01(s,1H),8.14(s,1H),7.57(d,J＝8.8Hz,2H),7.53(d,J＝15.6Hz,1H),7.45-7.35(m,2H),7.06(d,J＝1.8Hz,1H),7.01(d,J＝8.8Hz,2H),7.21(d,J＝15.6Hz,1H),3.80(s,3H)。Anal(C19H16N2O4)计算为C,67.85；H,4.79；N,8.33％；实测值C,68.09；H,4.77；N,8.39％。
将18(30.0mg，0.089mmol)和HCl在二噁烷(4M，1mL)中的混合物在室温搅拌4h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入62(33mg，0.10mmol)和EDCI.HCl(51mg，0.27mmol)。将混合物在室温搅拌3h。缓慢加入水，滤出沉淀的固体并干燥。将粗产物用EtOAc研磨，得到63，为浅褐色固体(24mg，49％)；1H NMR(d6-DMSO)δ11.67(s,1H),10.46(s,1H),10.04(s,1H),8.20(s,1H),7.91(s,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,2H),7.54(d,J＝15.6Hz,1H),7.43-7.36(m,2H),7.15(d,J＝2.1Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,2H),6.72(d,J＝15.6Hz,1H),4.80(t,J＝10.2Hz,1H),4.47(dd,J＝10.9,5.1Hz,1H),4.23-4.10(m,2H),4.06-3.99(m,1H),3.80(s,3H),2.62(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.8,163.5,160.5,159.8,141.3,141.2,139.1,138.6,136.3,133.0,132.3,131.3,129.2,127.5,127.2,120.2,118.1,114.5,112.3,111.5,111.1,105.6,101.6,55.3,54.5,46.9,40.8,14.2。Anal(C30H25ClN4O5)计算为[M+H]+557.1586；实测值557.1593。
实施例12.(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5-甲氧基苯并呋喃-2-基)甲酮(64)
通过与实施例3和4中所述相同的通用方法由18制备化合物64，并分离为灰色固体；1H NMR(d6-DMSO)δ10.50(s,1H),7.85(br s,1H),7.65(d,J＝9.2Hz,1H),7.63(s,1H),7.30(d,J＝2.6Hz,1H),7.10(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),4.79(t,J＝10.4Hz,1H),4.46(dd,J＝11.2,5.1Hz,1H),4.20-4.09(m,2H),4.02(dd,J＝10.7,7.2Hz,1H),3.33(s,3H),2.62(s,3H)。Anal(C21H17ClN2O5)计算为[M+H]+413.0899；实测值413.0899。
实施例13.(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-基)甲酮(65)
方案19
将18(40.0mg，0.12mmol)和HCl在二噁烷(4M，2mL)中的混合物在室温搅拌1.5h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.5mL)中并加入5-甲氧基苯并[b]噻吩-2-甲酸(25mg，0.12mmol)、EDCI.HCl(68mg，0.36mmol)和甲苯磺酸(4mg，0.024mmol)。将混合物在室温搅拌3h。缓慢加入水，滤出沉淀的固体并干燥。将粗产物用EtOAc研磨，得到65，为乳白色固体(35mg，69％)；1H NMR(d6-DMSO)δ10.49(s,1H),8.02(s,1H),7.94(d,J＝8.9Hz,1H),7.79(brs,1H),7.53(d,J＝2.5Hz,1H),7.14(dd,J＝8.9,2.5Hz,1H),4.74(t,J＝10.0Hz,1H),4.40(dd,J＝10.8,5.2Hz,1H),4.20-4.08(m,2H),4.05-3.98(m,1H),3.85(s,3H),2.62(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.9,160.7,157.4,141.3,140.8,140.21,140.17,138.6,136.5,132.2,126.5,123.3,117.1,111.4,106.9,101.5,55.3,55.1,46.7,40.8,14.2。Anal(C21H17ClN2O4S)计算为[M+H]+429.0670；实测值429.0677。
实施例14.(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5-(2-甲氧基乙氧基)-1H-吲哚-2-基)甲酮(66)
方案20
将18(36mg，0.106mmol)和HCl在二噁烷(4M，1mL)中的混合物在室温搅拌4h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入5-(2-甲氧基乙氧基)吲哚-2-甲酸(27.5mg，0.12mmol)，EDCI.HCl(61mg，0.32mmol)和甲苯磺酸(3.7mg，0.021mmol)。将混合物在室温搅拌2h。缓慢加入水，滤出沉淀的固体，用水洗涤，干燥。将粗产物用EtOAc研磨，得到66，为灰色固体(28mg，58％)；1H NMR(d6-DMSO)δ11.58(d,J＝1.5Hz,1H),10.45(s,1H),7.92(s,1H),7.39(d,J＝8.9Hz,1H),7.16(d,J＝2.3Hz,1H),7.04(d,J＝1.7Hz,1H),6.90(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),4.78(t,J＝10.1Hz,1H),4.45(dd,J＝10.8,5.1Hz,1H),4.21-4.06(m,2H),4.04-3.97(m,1H),3.71-3.66(m,2H),2.62(s,3H)(一个3H s被δ3.3处的水峰遮蔽)；13C NMR(d6-DMSO)δ164.8,159.9,152.9,141.3,141.2,138.6,136.3,131.6,131.0,127.5,115.7,113.2,111.0,105.2,103.1,101.6,70.6,67.2,58.2,54.6,46.9,40.9,14.2。Anal(C23H22ClN3O5)计算为[M+H]+456.1321；实测值456.1323。
实施例15.N-(2-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羰基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)乙酰胺(70)
方案21
在0℃下，将乙酰氯(0.12mL，1.7mmol)添加至5-氨基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(67)(165mg，0.86mmol)和Et3N(0.36mL，2.6mmol)在CH2Cl2(8mL)和THF(10mL)中的混合物中。除去冰浴，将混合物搅拌1h，然后用水稀释。蒸发有机溶剂，留下水性悬浮液。滤出固体并干燥，得到5-乙酰氨基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(68)，为白色固体(178mg，89％)；1H NMR(d6-DMSO)δ12.42(s,1H),10.07(s,1H),8.42(s,2H),7.15(s,1H),3.87(s,3H),2.07(s,3H)。Anal(C11H11N3O3)计算为[M+H]+234.0873；实测值234.0868。
将KOH(205mg，3.6mmol)的水(3mL)溶液添加至68(167mg，0.72mmol)的MeOH(6mL)悬浮液中，并将混合物在回流下加热2min，然后冷却至室温。加入HCl水溶液(2N，1.6mL)，滤出沉淀的固体，干燥，得到5-乙酰胺基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(69)，为乳白色固体(134mg，85％)；1H NMR(d6-DMSO)δ13.08(br s,1H),12.21(s,1H),10.04(s,1H),8.40(d,J＝2.3Hz,1H),8.38(d,J＝2.3Hz,1H),7.06(d,J＝2.0Hz,1H),2.07(s,3H)。Anal(C10H9N3O3)计算为[M+H]+220.0717；实测值220.0712。
将18(39mg，0.12mmol)和HCl的二噁烷(4M，2mL)溶液的混合物在室温下搅拌1.5h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入69(25mg，0.12mmol)、EDCI.HCl(66mg，0.36mmol)和甲苯磺酸(15mg，0.09mmol)。将混合物在室温搅拌3h。缓慢加入水，滤出沉淀的固体，用水洗涤，干燥。将粗产物用EtOAc研磨，得到70，为褐色固体(31mg，61％)；1H NMR(d6-DMSO)δ12.15(s,1H),10.47(s,1H),10.06(s,1H),8.42(d,J＝2.4Hz,1H),8.40(d,J＝2.3Hz,1H),7.87(br s,1H),7.11(d,J＝2.1Hz,1H),4.74(t,J＝10.1Hz,1H),4.40(dd,J＝10.9,5.1Hz,1H),4.20-4.08(m,2H),4.05-3.96(m,1H),2.62(s,3H),2.08(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ168.4,164.8,159.7,144.7,141.3,141.0,139.5,138.6,136.3,132.0,129.8,120.1,118.7,111.2,103.8,101.5,54.6,46.8,40.7,23.7,14.2。Anal(C21H18ClN5O4)计算为[M+H]+440.1120；实测值440.1123。
实施例16.N-(2-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羰基)咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)乙酰胺(74)
方案22
在室温下，将乙酰氯(0.11mL，1.6mmol)加入到6-氨基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯(71)(161mg，0.78mmol)和Et3N(0.33mL，2.3mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液的混合物中。搅拌5分钟后，用水稀释混合物，蒸发有机溶剂，留下含水悬浮液。滤出固体并干燥，然后用EtOAc研磨，得到6-乙酰胺基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-羧酸乙酯(72)，为浅绿色固体(99mg，51％)；1H NMR(d6-DMSO)δ10.14(s,1H),9.25(s,1H),8.62(s,1H),7.58(d,J＝9.7Hz,1H),7.24(dd,J＝9.7,2.0Hz,1H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),2.08(s,3H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H)。Anal(C12H13N3O3)计算为[M+H]+248.1030；实测值248.1021。
将KOH(122mg，2.2mmol)的水(3mL)溶液添加至72(96mg，0.39mmol)的MeOH(5mL)悬浮液中并且将混合物在室温下搅拌4h。蒸发MeOH，残余物水溶液用HCl(2N，1.0mL)酸化。滤出沉淀的固体并干燥，得到6-乙酰胺基咪唑并[1,2-a]吡啶-2-甲酸(73)，为浅棕色固体(71mg，83％)；1HNMR(d6-DMSO)δ10.13(s,1H),9.25(s,1H),8.55(s,1H),7.58(d,J＝9.7Hz,1H),7.23(dd,J＝9.7,2.0Hz,1H),2.09(s,3H)(未观察到CO2H质子)。Anal(C10H9N3O3)计算为[M+H]+220.0717；实测值220.0709。
将18(43mg，0.13mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温下搅拌3.5h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入73(27.8mg，0.13mmol)、EDCI.HCl(73mg，0.39mmol)和甲苯磺酸(4.4mg，0.03mmol)。将混合物在室温搅拌3h。缓慢加入水，得到乳液。加入NaHCO3水溶液，混合物用EtOAc(×4)萃取。将合并的萃取物用水和盐水洗涤，然后干燥并蒸发。残余物用EtOAc研磨，得到74，为灰白色固体(25.5mg，46％)；1H NMR(d6-DMSO)δ10.41(s,1H),10.15(s,1H),9.29(d,J＝1.0Hz,1H),8.58(s,1H),7.95(br s,1H),7.67(d,J＝9.7Hz,1H),7.25(dd,J＝9.7,2.0Hz,1H),4.96-4.87(m,1H),4.66(dd,J＝12.2,5.0Hz,1H),4.16-4.06(m,2H),4.01-3.93(m,1H),2.60(s,3H),2.10(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ168.6,164.7,161.4,141.4,141.2,140.8,138.6,136.2,127.2,121.8,118.6,117.8,116.0,111.1,101.5,54.8,46.9,40.7,23.7,14.2(一种C未观察到)。Anal(C21H18ClN5O4)计算为[M+H]+440.1120；实测值440.1139。
实施例17. 4-乙酰氨基-N-(2-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羰基)-1H-吲哚-5-基)-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酰胺(79)
方案23
将Pd/C(10％，90mg)添加至1-甲基-4-硝基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(75)(254mg，1.28mmol)的EtOH(25mL)溶液中并且将混合物在50psi下氢化2h。将混合物通过硅藻土过滤，用EtOAc洗涤，并将滤液蒸发。将残余物溶解于CH2Cl2(6mL)中并将溶液在冰浴中冷却。加入Et3N(0.54mL，3.8mmol)和乙酰氯(0.18mL，2.6mmol)，除去冰浴。将混合物搅拌10min，然后用水稀释并用CH2Cl2(×2)萃取。萃取物用稀HCl水溶液和水洗涤，然后干燥并蒸发。将残余物从EtOH中重结晶，得到4-乙酰胺基-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(76)，为浅黄色固体(65mg，24％)；mp 165-168℃。将来自液-液萃取的水相用NaHCO3水溶液碱化并用EtOAc(×4)萃取。将萃取物干燥，与来自重结晶的母液合并，并蒸发。残余物通过柱色谱(EtOAc:石油醚1:1，然后4:1，然后仅EtOAc)纯化，得到更多的76(139mg，52％)；1H NMR(CDCl3)δ7.91(brs,1H),7.47(s,1H),4.41(q,J＝7.1Hz,2H),3.99(s,3H),2.14(s,3H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H)。Anal(C9H13N3O3)计算为[M+H]+212.1030；实测值212.1026。
将KOH(218mg，3.9mmol)的水(2mL)溶液加入到76(185mg，0.88mmol)的MeOH(4mL)溶液中，并将混合物在室温下搅拌30分钟。蒸发MeOH，水层用HCl水溶液(2N，1.3mL)中和，然后蒸发至干。加入氨基吲哚60(179mg，0.88mmol)、EDCI.HCl(0.50g，2.6mmol)和DMA(2mL)，并将混合物在室温下搅拌29小时。将混合物用水稀释并用EtOAc(×2)萃取。将萃取物用水(×3)洗涤，然后干燥并蒸发。用EtOAc研磨残余物，得到5-(4-乙酰氨基-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酰胺基)-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(77)，为奶白色固体(59mg，超过2个步骤18％)；1H NMR(d6-DMSO)δ11.85(s,1H),10.36(s,1H),9.74(s,1H),8.13(d,J＝1.7Hz,1H),7.49(dd,J＝8.9,2.0Hz,1H),7.47(s,1H),7.41(d,J＝8.9Hz,1H),7.12(d,J＝1.3Hz,1H),4.33(q,J＝7.1Hz,2H),3.97(s,3H),2.03(s,3H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H)。Anal(C18H19N5O4)计算为[M+H]+370.1510；实测值270.1505。
将KOH(89mg，1.6mmol)的水(1mL)溶液添加至77(54mg，0.15mmol)的MeOH(8mL)悬浮液中并且将混合物在50℃下搅拌3h并且然后在回流下搅拌1.5h。将混合物冷却，蒸发MeOH，并将含水残余物用HCl水溶液(2N，0.8mL)酸化。滤出沉淀的固体并干燥，得到5-(4-乙酰胺基-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酰胺基)-1H-吲哚-2-甲酸(78)，为灰色固体(46mg，92％)；1HNMR(d6-DMSO)δ12.95(br s,1H),11.71(s,1H),10.37(s,1H),9.72(s,1H),8.11(s,1H),7.50-7.43(m,2H),7.39(d,J＝8.9Hz,1H),7.06(d,J＝1.6Hz,1H),3.97(s,3H),2.02(s,3H)。Anal(C16H15N5O4)计算为[M+H]+342.1197；实测值342.1204。
将18(39.4mg，0.12mmol)和HCl的二噁烷(4M，1mL)溶液的混合物在室温下搅拌3.5h，然后蒸发。将残余物悬浮于DMA(1.0mL)中并加入78(39.7mg，0.12mmol)、EDCI.HCl(67mg，0.36mmol)和甲苯磺酸(4mg，0.02mmol)。将混合物在室温搅拌5h。缓慢加入水，滤出沉淀的固体，用水洗涤，干燥。用EtOAc研磨粗产物以得到79，为灰白色固体(36mg，55％)；1HNMR(d6-DMSO)δ11.71(s,1H),10.46(s,1H),10.37(s,1H),9.75(s,1H),8.12(d,J＝1.7Hz,1H),7.92(s,1H),7.54(dd,J＝8.9,2.0Hz,1H),7.48-7.43(m,2H),7.15(d,J＝1.7Hz,1H),4.80(t,J＝10.2Hz,1H),4.46(dd,J＝10.9,5.1Hz,1H),4.22-4.10(m,2H),4.05-3.99(m,1H),3.97(s,3H),2.63(s,3H),2.04(s,3H)；13C NMR(d6-DMSO)δ167.2,164.8,159.8,156.8,141.3,141.2,138.6,136.3,134.0,133.3,131.4,131.0,127.1,118.8,114.0,112.4,112.3,111.1,105.5,101.6,54.5,46.9,40.8,35.0,22.7,14.2。Anal(C27H24ClN7O5)计算为[M+H]+562.1600；实测值562.1579。
实施例18.(S)-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-基)甲酮(82)和(R)-(8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-基)(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-基)甲酮(83)
方案24
化合物18(334mg)通过制备型手性HPLC(Daicel Chiralpak IA 250×21mm柱，EtOH：己烷15：85洗脱剂，6mL/min流速，1.43)拆分，得到两种对映异构体的基线分离。合并含有较快洗脱的对映异构体的部分(RT9.4min)并蒸发，得到(S)-8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-甲酸酯(80)，为白色固体(131mg，39％)；[]D＝-31°(c 0.584,CH2Cl2)；1H NMR(CDCl3)与18所述相同。合并含有较慢洗脱的对映异构体的部分(RT 13.4min)并蒸发，得到(R)-8-(氯甲基)-4-羟基-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-6-羧酸叔丁酯(81)，为白色固体(130mg，39％)；[]D＝+24°(c 0.586,CH2Cl2)；1HNMR(CDCl3)与18所述相同。在分析柱(Daicel Chiralpak IA 150×4.6mm柱)上的再分析证实了每种对映异构体的100％ee。
通过所述的通用方法将化合物80转化成82，得到白色固体。Anal(C23H22ClN3O6)计算为[M+H]+472.12699；实测值472.12721。通过所述的通用方法将化合物81转化成83，得到白色固体；1H NMR(d6-DMSO)与23所述相同。Anal(C23H22ClN3O6)计算为[M+H]+472.12699；实测值472.12719。
实施例19.8-(氯甲基)-2-甲基-6-(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-羰基)-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)乙烷-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(26)
方案25
在0℃下，将对硝基氯甲酸苯酯(97％，20mg，0.10mmol)和Et3N(34μL，0.25mmol)添加至23(23mg，0.049mmol)的无水THF(5mL)和DMF(1.5mL)溶液中。1.5小时后，再加入对硝基氯甲酸苯酯(97％，10mg，0.05mmol)和Et3N(17μL，0.12mmol)，再过50分钟后，加入(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁基甲酯(95％，40mg，0.21mmol)。除去冰浴，将混合物再搅拌20h，然后蒸发至干。用柱色谱纯化残余物(EtOAc：石油醚1：4，然后1：3、1：1、3：1)，得到叔丁基(8-(氯甲基)-2-甲基-6-(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-羰基)-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基)乙烷-1,2-二基双(甲基氨基甲酸酯)(24)，为无色油状物(31mg，94％)；1HNMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ9.37(s,1H),8.24和8.23(2s,1H),6.97(d,J＝2.3Hz,1H),6.87(s,1H),4.77(t,J＝9.6Hz,1H),4.61(dd,J＝10.7,4.6Hz,1H),4.29-4.21(m,2H),4.091和4.090(2s,3H),3.95(s,3H),3.92(s,3H),3.76-3.34(m,5H),3.21和3.08(2s,3H),3.01-2.84(m,3H),2.65(s,3H),1.53-1.42(m,9H)。Anal(C33H40ClN5O9)计算为[M+H]+686.2587；实测值686.2573。
在0℃下，将TFA(0.7mL，9.1mmol)添加至24(31mg，0.045mmol)的CH2Cl2(0.7mL)溶液中。30分钟后，将混合物在室温下蒸发至干，将残余物溶于CH2Cl2并再次蒸发。将残余物溶解于DMF(0.5mL)中并将溶液在冰浴中冷却。加入4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(25)(36.7mg，0.050mmol)和Et3N(32μL，0.23mmol)。除去冰浴，将混合物搅拌18h，然后在室温蒸发至干。将残余物通过柱色谱法(CH2Cl2，仅然后CH2Cl2：MeOH 100：1，然后50：1、30：1、15：1)纯化，得到回收的23(6mg，28％)和粗产物。将后者通过柱色谱法(EtOAc:MeOH9:1)纯化以得到26，为浅黄色玻璃状物(22mg，41％)；1H NMR(d6-DMSO)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ11.48-11.37(m,1H),9.99-9.90(m,1H),8.08和8.06(2s,1H),8.05-7.97(m,1H),7.81和7.79(2s,1H),7.60-7.46(m,2H),7.36-7.16(m,2H),7.07-7.02(m,1H),7.00(s,2H),6.96(s,1H),5.96(t,J＝5.5Hz,1H),5.40(s,2H),5.08-4.95(m,2H),4.81-4.72(m,1H),4.48-4.25(m,3H),4.21-4.06(m,3H),3.93(s,3H),3.32(s,3H),3.28(s,3H),3.67-3.44(m,4H),3.36(t,J＝7.1Hz,2H),3.14-2.85(m,8H),2.67-2.57(m,3H),2.23-2.06(m,2H),2.01-1.90(m,1H),1.74-1.31(m,8H),1.24-1.13(m,2H),0.87-0.76(m,6H)。Anal(C57H70ClN11O15)计算为[M+H]+1184.4814；实测值1184.4840。
实施例20. 8-(氯甲基)-2-甲基-6-(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-羰基)-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(87)
方案26
在0℃下，将对硝基氯甲酸苯酯(97％，39mg，0.18mmol)和Et3N(64μL，0.46mmol)添加至23(43.5mg，0.092mmol)的DMF(4mL)溶液中。45分钟和2小时后加入另外部分的对硝基氯甲酸苯酯(97％，19mg，0.18mmol)，70分钟后加入更多的Et3N(32μL，0.28mmol)。2.5小时后，加入(2-((2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(84)(73mg，0.28mmol)的DMF(1mL)溶液，除去冰浴。将混合物搅拌18小时，然后蒸发至干。残余物用CH2Cl2研磨，滤出固体，干燥，得到回收23(23mg，53％)。将滤液蒸发并将残余物通过柱色谱法(EtOAc：石油醚1：1，然后3：1，然后仅EtOAc，然后EtOAc：MeOH 20：1)纯化，得到8-(氯甲基)-2-甲基-6-(5,6,7-三甲氧基-1H-吲哚-2-羰基)-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(85)，为无色油状物(20mg，29％)；1H NMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ9.39(s,1H),8.36,8.34和8.29(3s,1H),6.97(d,J＝2.3Hz,1H),6.87(s,1H),4.82-4.74(m,1H),4.64-4.57(m,1H),4.29-4.20(m,2H),4.09(s,3H),3.95(s,3H),3.92(s,3H),3.85-3.44(m,14H),2.99-2.86(m,3H),2.66(s,3H),1.54-1.42(m,9H)。Anal(C36H46ClN5O11)计算为[M+H]+760.2955；实测值760.2940。
将化合物85(31mg，0.041mmol)用CH2Cl2(0.7mL)和TFA(0.7mL，9.1mmol)的混合物在0℃处理15min。将混合物在室温下蒸发至干并将残余物溶解于CH2Cl2中并再次蒸发。将残余物溶解于DMF(0.5mL)中并将溶液在冰浴中冷却。加入((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(86)(23mg，0.041mmol)和Et3N(28μL，0.21mmol)并除去冰浴。2.5小时后，将混合物蒸发并将残余物通过柱色谱(EtOAc：石油醚2：3，然后3：2，然后仅EtOAc，然后EtOAc：MeOH 20：1)纯化，得到回收的23(4.3mg，22％)和87，为无色玻璃状物(24.8mg，56％)；1H NMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ9.64-9.44(m,1H),8.96-8.74(m,1H),8.28-8.02(m,1H),7.63-7.46(m,2H),7.36-7.23(m,1H),6.97(s,1H),6.90-6.80(m,2H),5.19-5.06(m,2H),4.80-4.72(m,1H),4.67-4.56(m,2H),4.28-4.20(m,2H),4.08(s,3H),4.02-3.93(m,1H),3.94(s,3H),3.91(s,3H),3.84-3.41(m,13H),3.05-2.95(m,3H),2.66-2.61(m,3H),2.21-2.11(m,1H),1.44(s,12H),0.98-0.89(m,6H)。Anal(C52H67ClN8O15)计算为[M+H]+1079.4487；实测值1079.4489。
实施例21. 8-(氯甲基)-6-(5-(2-(二甲氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-羰基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(89)
方案27
在0℃下，将对硝基氯甲酸苯酯(97％，34.5mg，0.16mmol)和Et3N(88μL，0.63mmol)添加至52(59.3mg，0.126mmol)的THF(6mL)和DMF(1.5mL)溶液中。30分钟后，加入更多的对硝基氯甲酸苯酯(97％，34.5mg，0.16mmol)，2.5小时后，加入84(66mg，0.32mmol)的THF(1mL)溶液。除去冰浴，将混合物搅拌18h，然后蒸发至干。残余物用CH2Cl2研磨，滤出固体，干燥，得到回收的52，为盐酸盐(21mg，32％)。蒸发滤液，残余物通过柱色谱法纯化(仅EtOAc，然后EtOAc：MeOH 10：1，然后5：1，然后3：2)，得到8-(氯甲基)-6-(5-(2-(二甲氨基)乙氧基)-1H-吲哚-2-羰基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(88)，为无色油状物(30mg，31％)；1H NMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ9.52-9.41(m,1H),8.26和8.23(2s,1H),7.34(d,J＝8.9Hz,1H),7.14(d,J＝2.2Hz,1H),7.03(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H),6.97(d,J＝1.4Hz,1H),4.81-4.74(m,1H),4.64-4.57(m,1H),4.28-4.16(m,4H),3.83-3.41(m,14H),2.97-2.85(m,5H),2.65(s,3H),2.45(s,6H),1.52-1.42(m,9H)。Anal(C37H49ClN6O9)计算为[M+H]+757.3322；实测值757.3332。
将化合物88(30mg，0.040mmol)用CH2Cl2(0.7mL)和TFA(0.7mL，9.1mmol)的混合物在0℃处理15min。将混合物在室温下蒸发至干并将残余物溶解于CH2Cl2中并再次蒸发。将残余物溶解于DMF(0.5mL)中并将溶液在冰浴中冷却。加入化合物86(22mg，0.040mmol)和Et3N(33μL，0.24mmol)，除去冰浴。搅拌2小时后，蒸发混合物并通过柱色谱(CH2Cl2：MeOH 50：1，然后20：1、10：1、8：1；然后用第二柱洗脱，其中EtOAc：MeOH 10：1，然后5：1、3：1、3：2)纯化，得到89，为无色玻璃状物(7.8mg，18％)；1H NMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ10.01-9.47(m,1H),8.95-8.61(m,1H),8.27-8.06(m,1H),7.61-7.44(m,2H),7.41-7.19(m,2H),7.14(d,J＝2.2Hz,1H),7.06-6.95(m,2H),5.19-4.99(m,2H),4.83-4.73(m,1H),4.71-4.57(m,2H),4.28-4.17(m,2H),4.14(t,J＝5.7Hz,2H),4.02-3.92(m,1H),3.83-3.34(m,14H),3.05-2.93(m,3H),2.80(t,J＝5.7Hz,2H),2.67-2.61(m,3H),2.38(s,6H),2.23-2.14(m,1H),1.47-1.38(m,12H),1.00-0.90(m,6H)。Anal(C53H70ClN9O13)计算为[M+H]+1076.4854；实测值1076.4857。
实施例22. 8-(氯甲基)-6-(5-(2-甲氧基乙氧基)-1H-吲哚-2-羰基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(91)
方案28
在0℃下，将对硝基氯甲酸苯酯(96％，160mg，0.76mmol)和Et3N(0.37mL，2.7mmol)添加至66(242mg，0.53mmol)的THF(8mL)溶液中。75分钟后，加入84(279mg，1.1mmol)的THF(1.5mL)溶液。除去冰浴，将混合物搅拌5.5h，然后蒸发至干。将残余的黄褐色泡沫溶解在最小量的CH2Cl2中并且将该溶液在4℃下静置过夜。滤出固体，用CH2Cl2洗涤，蒸发滤液。将残余物通过柱色谱法(EtOAc：石油醚1：1，然后3：1，然后仅EtOAc，然后EtOAc：MeOH 20：1)纯化，得到8-(氯甲基)-6-(5-(2-甲氧基乙氧基)-1H-吲哚-2-羰基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(90)，为无色油状物(90mg，23％)；1H NMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ9.43(s,1H),8.26和8.24(2s,1H),7.34(d,J＝8.9Hz,1H),7.14(d,J＝2.3Hz,1H),7.05(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.98(d,J＝1.5Hz,1H),4.81-4.74(m,1H),4.65-4.57(m,1H),4.28-4.13(m,4H),3.85-3.51(m,15H),3.48(s,3H),2.98-2.85(m,3H),2.65(s,3H),1.53-1.42(m,9H)。Anal(C36H46ClN5O10)计算为[M+H]+744.3006；实测值744.3014。
将不溶于CH2Cl2的固体与来自柱色谱的匹配部分合并，得到回收66(142mg，59％)。
在0℃下将TFA(0.7mL，9.1mmol)添加至90(90mg，0.12mmol)的CH2Cl2(2.0mL)溶液中且在此温度下搅拌混合物40分钟。将混合物在室温下蒸发至干并将残余物溶解于CH2Cl2中并再次蒸发。将残余物溶解于DMF(1mL)中并将溶液在冰浴中冷却。加入化合物86(67.5mg，0.12mmol)和Et3N(84μL，0.6mmol)，除去冰浴。3小时后，将混合物蒸发并将残余物通过柱色谱(EtOAc：石油醚2：3，然后1：1、3：1，然后仅EtOAc，然后EtOAc：MeOH 50：1，然后25：1、15：1)纯化，得到回收的66，为白色固体(11mg，20％)和91，为白色玻璃状物(58mg，45％)；1H NMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂)δ9.95-9.40(m,1H),8.91-8.55(m,1H),8.27-8.05(m,1H),7.61-7.45(m,2H),7.40-7.20(m,2H),7.15(d,J＝2.2Hz,1H),7.06(dd,J＝8.9,2.2Hz,1H),7.00(s,1H),6.72-6.53(m,1H),5.21-4.94(m,3H),4.84-4.74(m,1H),4.72-4.56(m,2H),4.28-4.16(m,4H),4.01-3.92(m,1H),3.84-3.35(m,15H),3.47(s,3H),3.06-2.94(m,3H),2.66-2.60(m,3H),2.24-2.13(m,1H),1.48-1.37(m,12H),1.01-0.90(m,6H)。Anal(C52H67ClN8O14)计算为[M+H]+1063.4538；实测值1063.4546。
从柱中还获得较不纯的另一部分91，为白色玻璃(14mg，粗品收率11％)。
实施例23. 8-(氯甲基)-6-(5-(2-甲氧基乙氧基)-1H-吲哚-2-羰基)-2-甲基-7,8-二氢-6H-噁唑并[4,5-e]吲哚-4-基(2-((((4-((2S,5S)-13-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7-二氧代-8,11-二氧杂-3,6-二氮杂十三烷酰氨基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙基)(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(93)
方案29
在0℃下，将TFA(0.2mL，2.6mmol)添加至91(14mg，0.013mmol)的CH2Cl2(1.0mL)溶液中并且将该溶液在该温度下保持3h。将混合物在室温下蒸发至干并将残余物溶解于CH2Cl2中并再次蒸发。将残余物溶解于DMF(0.5mL)中并将溶液在冰浴中冷却。加入2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙基(4-硝基苯基)碳酸酯(92)(4.6mg，0.013mmol)和Et3N(9μL，0.065mmol)，除去冰浴。19小时后，将混合物蒸发并将残余物通过柱色谱法(仅EtOAc，然后EtOAc：MeOH 20：1)纯化，得到93，为无色油状物(8.3mg，54％)；1HNMR(CDCl3)(一些信号由于旋转异构体而分裂，未观察到2个可交换质子)δ9.94-9.46(m,1H),8.87-8.57(m,1H),8.31-8.00(m,1H),7.63-7.46(m,2H),7.43-7.22(m,2H),7.16-6.93(m,4H),6.68(s,2H),5.40-5.32(m,1H),5.16-5.04(m,2H),4.83-4.56(m,3H),4.35-3.98(m,7H),3.83-3.36(m,21H),3.47(s,3H),3.05-2.94(m,3H),2.66-2.60(m,3H),2.30-2.20(m,1H),1.46-1.36(m,3H),1.03-0.90(m,6H)。Anal(C56H68ClN9O17)计算为[M+H]+1174.4494；实测值1174.4516。
实施例24.额外的亲脂性数据
小分子化合物的亲脂性可以以许多不同的方式计算(综述于例如J.Pharm.Sci.(2009)98,861)为了补充实施例6中提供的数据，使用四种不同的软件包，即ChemDrawProfessional(Perkin Elmer Informatics Inc)，如实施例6，ACD/logP(AdvancedChemistry Development)、XLOGP3(上海有机化学研究所)和MLOGP(Talete SRL,Milano,Italy)，将本发明的几种化合物的计算亲脂性与具有相同小沟结合侧链的开环-CBI类似物的亲脂性进行比较，后三种通过SwissADME(http://swissadme.ch/,Swiss Institute ofBioinformatics)获得。显示了化合物的结构(其中DNA结合单元A、D、E和F，当与2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位连接时，分别代表化合物23、59、66和74)，并且计算的logP值收集在表3中。
从表3清楚地看出，尽管绝对logP值根据所使用的计算程序而变化，但是在每种情况下，当将2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位与开环-CBI烷基化亚单位(ΔlogP在0.98-1.48的范围内)进行比较时，logP均有一致的和显着的降低。这适用于计算程序是基于性质(例如MLOGP)还是基于子结构(基于片段的例如ACD或基于原子的例如XLOG3)。
如已经指出的，有效负荷亲脂性的这些实质性降低非常可能导致结合2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的药物-接头和ADC的有利性质。
表3：本发明的化合物的亲脂性
实施例25.额外的细胞毒性数据
按照实施例7中描述的一般程序，通过测量两种人肿瘤细胞系、宫颈癌SiHa和卵巢癌SKOV3的增殖抑制来测定本发明的有效负荷的细胞毒性。在新的测定中，在加入到96-孔板的含细胞的孔中之前，将有效负荷在DMSO中的储备溶液连续稀释。将细胞毒性测定重复数次(取决于化合物和细胞系，n＝3-7)并将结果收集在表4中。
新数据加强了表2中呈现的信息，显示含有2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的DNA烷基化剂可以是高细胞毒性化合物，IC50在nM或亚-nM范围内，即在认为适合于ADC应用的范围内。它们还显示适当选择小沟结合侧链可用于调节有效负荷的细胞毒性，其中表4中的实施例在所检查的2个细胞系中跨越超过100倍范围的IC50。表4中的数据进一步允许2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的两种对映异构体形式之间的比较。化合物82和83在SiHa中显示93倍的差别细胞毒性效力，在SKOV3中显示110倍的差别细胞毒性效力。这些观察与倍癌霉素的其它类似物的行为一致，因为尽管两种对映异构体由于烷基化DNA而具有细胞毒性，但是天然对映异构体通常更具有细胞毒性。
重要的是，在IC50测量的误差内，再次发现共有相同小沟结合侧链的化合物23和开环-CBI-TMI具有相同的细胞毒性效力。这意味着2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位可以被认为是倍癌霉素型烷基化亚单位的所有已知变体中最有效的一种，令人惊奇地不同于密切相关的开环-COI烷基化亚单位。
表4：本发明化合物的细胞毒性
实施例26.额外的稳定性数据
通过HPLC分析研究了化合物52、59和66的水稳定性。条件与实施例8中描述的那些相同，即样品在37℃下在含有10％DMF的Tris缓冲液(pH7.4)中含有浓度为4μM的有效负荷。在该实验中，在8小时内以每小时的间隔监测溶液。
如图3-5所示，基于紫外-可见吸收光谱的特征位移，将所有三种有效负荷化合物转化成被鉴定为相应环丙基形式的中间体。在所有三种情况下，环丙基中间体对于在水性缓冲液中的进一步反应是不稳定的，产生多种产物，其中两种主要的水解产物占主导。该行为与对于实施例8中的化合物23观察到的稳定性和产物分布紧密匹配(参见图2)，但与参考化合物开环-CBI-TMI的延长的稳定性显著对比(参见图1)。因此，似乎不寻常的不稳定性是2-甲基苯并噁唑烷基化亚单位的一般性质。它不明显依赖于DNA小沟结合侧链的性质。换句话说，水解作为任何全身释放的有效负荷的解毒机制的潜在优点可以合理地假设为所有本发明新化合物共有的性质。
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