具体实施方式

I.定义

为了可以更容易地理解本公开文本，在下文中定义所选定的术语。

本文所用的序列位置编号参考Kabat编号(Kabat,E.A.等,Sequences ofproteins of immunological interest.第5版-US Department of Health and HumanServices,NIH出版号91-3242,第662、680、689页,1991)。

如本文所用，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸(如a-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸)也可以是本文所述结合蛋白的多肽链的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸、c-N,N,N-三甲基赖氨酸、c-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、u-N-甲基精氨酸、以及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向并且右手方向是羧基末端方向。可以基于常见侧链特性将天然存在的残基分为多个类别(参见表1)。

表1-按照类别提供的氨基酸残基。

保守氨基酸取代可以涉及这些类别中一个类别的成员与同一类别中另一个成员的交换。保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，它们通常通过化学肽合成而不是通过生物系统合成而掺入。这些包括拟肽以及氨基酸残基的其他反转(reversed)或倒转(inverted)形式。非保守取代可以涉及这些类别中一个类别的成员与来自另一个类别的成员的交换。

如本文所用，术语“突变”或“突变的”是指通过缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸而对氨基酸序列的改变。特别地，所述术语是指取代。突变是关于给定序列(例如，特异性地识别第一抗原的VL1和/或VH1对的氨基酸序列)引入的。

如本文所用，“T192E(CH1)突变”是指在抗原结合蛋白的免疫球蛋白CH1重链恒定结构域中在Kabat位置192处将苏氨酸(T)残基取代为谷氨酸(E)残基。

如本文所用，“突变组”是指序列中存在的一组不同突变。

如本文所用，术语“变体”是指与衍生出它的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877,1993的数学算法来完成两个序列之间的同一性百分比的确定。这样的算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTN和BLASTP程序中。为了获得用于比较目的的空位化比对，利用空位化BLAST，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402中所述。当利用BLAST和空位化BLAST程序时，使用相应程序的默认参数。可替代地，也可以将变体定义为具有多达20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸取代，特别是保守氨基酸取代。保守取代是本领域熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。在上表1中给出了氨基酸的物理和化学特性的概述。在特定实施方案中，保守取代是用共同具有根据表1(即，第1栏和/或第2栏)的至少一种特性的氨基酸进行的取代。术语“变体”还包括片段。片段具有总计多达20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸的N末端和/或C末端缺失。另外地或可替代地，变体可以被修饰，例如通过总计多达50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个氨基酸的N末端和/或C末端氨基酸添加来修饰。

如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶标”是指分子或分子的一部分(例如，表位)，其能够被本文所述的结合蛋白特异性地结合，并且另外能够用于动物中以产生能够与该抗原的表位特异性地结合的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。关于由结合蛋白识别的每种靶抗原，结合蛋白能够与识别所述靶抗原的完整抗体竞争。

如本文所用，术语“表位”是指能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性地结合的任何决定簇，例如多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团(grouping)，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是由抗体或由抗体的抗原结合片段或由结合蛋白结合的抗原区域。在某些实施方案中，当结合蛋白在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，称结合蛋白特异性地结合抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数为<10^-8M时，当平衡解离常数为<1^-9M时，或者当解离常数为<10^-10M时，称结合蛋白特异性地结合抗原。

如本文所用，术语“抗原结合蛋白”或“结合蛋白”或“结合多肽”是指含有负责与感兴趣的靶抗原(例如，人抗原)选择性地结合的至少一个结合位点的多肽(例如，抗体或其片段)。示例性结合位点包括但不限于抗体可变结构域、受体的配体结合位点、或配体的受体结合位点。在某些方面，结合多肽包含多个(例如，两个、三个、四个或更多个)结合位点。在某些方面，结合蛋白不是治疗性酶。

如本文所用，“异二聚化结构域”或“HD”是指双特异性、三特异性或多特异性结合蛋白的亚基，所述亚基促进、引导或迫使轻链及其同源重链正确组装以在防止相应轻链或重链错误配对的同时产生所需的蛋白质。

如本文所用，“多特异性”结合蛋白是结合两种或更多种抗原、和/或两种或更多种不同表位的结合蛋白。结合两种抗原和/或两种不同表位的多特异性结合蛋白在本文中也被称为“双特异性”结合蛋白。结合三种抗原和/或三种不同表位的多特异性结合蛋白在本文中也被称为“三特异性”结合蛋白。

如本文所用，术语“异二聚化Fc”或“异二聚化Fc的功能片段”是指恒定结构域(例如，CH2-CH3或CH2-CH3-CH4)的突变体形式，所述突变体形式关于天然存在的Fc部分是突变的，其中其不再形成同二聚体，而是与对应的突变Fc部分形成异二聚体。因此，所述术语是指形成异二聚体的两条链的一部分。几个此类对是本领域已知的并且包含例如杵臼结构(knob-in-hole，KIH)变体或EV-RWT变体。

Ridgeway和同事通过以下方式产生有利于异二聚体组装的CH3界面：用较大侧链替代一个CH3界面上的小侧链以产生杵，并用较小侧链替代另一个CH3结构域上的大侧链以产生臼。测试此类变体展示出优先的异二聚化。通过噬菌体展示进一步扩展原始杵臼结构突变以鉴定另外的合适组合，所述组合用于产生双特异性IgG抗体，从而测试允许二硫键形成的另外的取代。杵臼结构变体进一步描述于美国专利号5,732,168和美国专利号8,216,805中，将所述专利通过引用并入本文。因此，在一个实施方案中，一个Fc结构域或异二聚化结构域的CH3结构域含有突变Y349C、T366S、L368A和Y407V，并且另一个FC结构域或异二聚化结构域的CH3结构域含有突变S354C和T366W(氨基酸位置通过参考IgG1序列来指示)。

如本文所用，术语“同二聚化结构域”是指介导两个相似结构域(例如，两条重链)的同二聚化的结构域。重链配对是由恒定区的最后一个结构域(即，IgG分子中的CH3)介导，所述最后一个结构域形成高亲和力同二聚体复合物(K_D为大约10pM)。另外的相互作用存在于负责重链组装后形成的两条重链的共价连接的铰链区中。CH3同二聚体中的相互作用涉及CH3-CH3界面处的大约16个残基，如针对人γ1CH3所示，其中由界面中心处的6个残基(T366、L368、F405、Y407和K409)形成的补丁(patch)强烈促进稳定性。同二聚化结构域包括但不限于Fc区及其效应子修饰的变体以及Fc区和其效应子修饰的变体中任一者的片段、CH2结构域或其片段、CH3结构域或其片段、CH4结构域或其片段等。

天然存在的抗体通常包含四聚体。每个这种四聚体通常由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一条全长“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。如本文所用，术语“重链”和“轻链”是指具有足以赋予对靶抗原的特异性的可变结构域序列的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包括约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域，所述可变结构域通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义负责效应子功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链IgG免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中所述VH结构域位于多肽的氨基末端并且所述CH3结构域位于羧基末端，并且全长轻链免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，其中所述VL结构域位于多肽的氨基末端并且所述CL结构域位于羧基末端。

在一些实施方案中，本公开文本的多特异性抗原结合蛋白包含来自在表2、3和4中列举的VH结构域序列中的任一个的一个或多个VH结构域。在一些实施方案中，本公开文本的多特异性抗原结合蛋白包含来自在表2、3和4中列举的VL结构域序列中的任一个的一个或多个VL结构域。在一些实施方案中，本公开文本的多特异性抗原结合蛋白包含来自在表2、3和4中列举的VH结构域序列中的任一个的一个或多个VH结构域，所述VH结构域与来自在表2、3和4中列举的VL结构域序列中的任一个的一个或多个VL结构域配对。

通常将人轻链分类为κ和λ轻链，并且通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多个亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。将IgA类似地细分为多个亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变结构域和恒定结构域通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，并且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如，Fundamental Immunology(Paul,W.编辑,Raven Press,第2版,1989)，出于所有目的将所述文献通过引用以其整体并入。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域通常展现出通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同总体结构。来自每一对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，这可以使得能够结合至特异性表位。从氨基末端到羧基末端，轻链和重链可变结构域二者通常均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

如本文所用，术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单一可变区中的一组三个CDR。这些CDR的确切边界已经根据不同系统以不同方式加以定义。由Kabat所述的系统(Kabat等,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(National Institutesof Health,Bethesda,MD(1987)和(1991))不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供定义三个CDR的准确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Affol.Biol.196:901-17；Chothia等,1989,Nature 342:877-83)发现，尽管在氨基酸序列水平上具有显著多样性，但是Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被命名为L1、L2和L3或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链区和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。与Kabat CDR重叠的定义CDR的其他边界已经描述于以下文献中：Padlan,1995,FASEB J.9:133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5):732-45；以及Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77。仍有其他CDR边界定义可能不严格遵循本文所述的系统，但仍然会与Kabat CDR重叠，不过鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，所述其他CDR边界可能会被缩短或延长。本文所用的方法可以利用根据这些系统中的任一个系统定义的CDR，但是某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。使用氨基酸序列鉴定预测的CDR是本领域熟知的，如在以下文献中：Martin,A.C.“Proteinsequence and structure analysis of antibody variable domains,”AntibodyEngineering,第2卷.Kontermann R.,Dikel S.编辑Springer-Verlag,Berlin,第33-51页(2010)。还可以通过其他常规方法(例如，通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较以确定具有序列超变性的区域)来检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列。可以通过目测，或通过采用比对程序(如CLUSTAL程序套件中的一种)来比对已编号的序列，如以下文献中所述：Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-80。常规地使用分子模型来正确描绘框架区和CDR区，并由此校正基于序列的比对。

在一些实施方案中，基于IMGT定义来确定免疫球蛋白轻链或重链的CDR/FR(Lefranc等Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1):55-77；网址：imgt.org)。

在一些实施方案中，本公开文本的多特异性抗原结合蛋白包含来自在表2、3和4中列举的可变重链序列中的任一个的3个可变重链CDR(HCDR)。在一些实施方案中，本公开文本的多特异性抗原结合蛋白包含来自在表2、3和4中列举的可变轻链序列中的任一个的3个可变轻链CDR(LCDR)。在一些实施方案中，本公开文本的多特异性抗原结合蛋白包含来自在表2、3和4中列举的可变重链序列中的任一个的3个HCDR以及来自在表2、3和4中列举的可变轻链序列中的任一个的3个LCDR。来自表2、3和4的重链和轻链可变序列的CDR序列可由本领域的技术人员使用业内公认的鉴定CDR序列的方法容易地确定。

如本文所用，术语“Fc”是指包含由抗体消化产生或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子(所述分子呈单体或多聚体形式)，并且可以含有铰链区。虽然在示例性实施方案中使用IgG1和IgG2，但是天然Fc的原始免疫球蛋白来源通常是人起源的，并且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由可通过共价(即，二硫键)和非共价结合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目范围为1至4，这取决于类(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。Fc的一个例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键键合的二聚体。如本文所用，术语“天然Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。

Fab片段通常包括一条轻链以及一条重链的VH和CH1结构域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分不能与另一个重链多肽形成二硫键。如本文所用，Fab片段还可以包括含有被氨基酸接头隔开的两个可变结构域和一个CL结构域的一条轻链，以及含有被氨基酸接头隔开的两个可变结构域和一个CH1结构域的一条重链。

F(ab′)片段通常包括一条轻链和含有更多恒定区的一条重链的一部分(在CH1与CH2结构域之间)，使得可以在两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。

如本文所用，术语“结合蛋白”是指与至少一种靶抗原特异性地结合的非天然存在的(或重组的、工程化的或取代的)分子。

如本文所用，术语“Tm”是指结合蛋白、抗原结合蛋白、抗体的熔解温度，并且是抗原结合蛋白的热稳定性的关键参数。Tm一般涉及Fv片段(即，可变区重链和轻链(VH/VL))的热稳定性。Tm可以通过差式扫描量热法(DSC)或差式扫描荧光测定法(DSF)来测量。

本公开文本的一个实施方案提供结合蛋白，其具有对介于一个与四个之间的靶抗原的生物和免疫特异性和/或对介于一个与四个之间的靶表位的特异性。本公开文本的另一个实施方案提供核酸分子，其包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列。本公开文本的另一个实施方案提供包含核酸分子的表达载体，所述核酸分子包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列。本公开文本的又另一个实施方案提供宿主细胞，其表达此类结合蛋白(即，包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)。

如本文所用，术语“接头”是指0-100个连续的氨基酸残基。接头是存在的或不存在的，并且是相同的或不同的。蛋白质或多肽中所包含的接头可以全部都具有相同的氨基酸序列或者可以具有不同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肽接头包含以下序列：EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:X)。

在一些实施方案中，术语“接头”是指1-15个连续的氨基酸残基。通常，接头提供两个氨基酸之间或两个多肽结构域之间的柔性和空间分离。可以根据分子的形式将接头插入VH、VL、CH和/或CL结构域之间，以为轻链和重链的结构域提供足够的柔性和运动性，例如以折叠成交叉双可变区免疫球蛋白。在氨基序列水平上，通常分别在可变结构域之间、在可变结构域与敲除结构域之间或者在可变结构域与恒定结构域之间的过渡处插入接头。由于免疫球蛋白结构域的大致尺寸已被充分理解，因此可以鉴定结构域之间的过渡。结构域过渡的准确位置可以通过定位没有形成(如通过实验数据所证明或者如通过建模或二级结构预测的技术可以确定的)二级结构元件(如β片层或α螺旋)的肽延伸段来确定。在某些示例性实施方案中，可以将接头插入Fab结构域之间以产生串联Fab抗体。在特定实施方案中，可以将接头插入第一Fab的VH结构域的N末端与第二Fab的CH1结构域的C末端之间。

接头中氨基酸残基的身份和序列可根据接头中需要实现的一种或多种二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸对于具有最大柔性的接头是合适的。如果需要刚性更强且延长的接头，则甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的某些组合是有用的。根据所需特性，必要时可将任何氨基酸残基与其他氨基酸残基的组合视为接头，以构建较大肽接头。

在一些实施方案中，接头包含：单一甘氨酸(Gly)残基；二甘氨酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:x)；具有五个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:x)；具有六个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:x)；具有七个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:x)；和具有八个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；SEQ ID NO:x)。

在一些实施方案中，接头包含小氨基酸，如Gly、Ala或Ser。

在一些实施方案中，接头包含Gly(G)和Ser(S)，或者GS、GGS、GGGS或GGGGS。在一些实施方案中，接头包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂(即，(GGGGS)₂)。在一些实施方案中，接头包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃(即，(GGGGS)₃)。

在一些实施方案中，接头包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)、肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)和肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)。

在一些实施方案中，接头包含单一Ser残基；单一Val残基；选自以下的二肽：Arg-Thr、Gln-Pro、Ser-Ser、Thr-Lys和Ser-Leu；或选自以下的多肽：Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQID NO:x)、Thr-Val-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)、Gln-Pro-Lys-Ala-Ala(SEQ ID NO:x)、Gln-Arg-Ile-Glu-Gly(SEQ ID NO:x)、Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:x)、Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQ ID NO:x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ IDNO:x)、His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys(SEQ ID NO:x)和Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ IDNO:x)。

在一些实施方案中，两个串联Fab通过(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂接头连接。

在具有CODV-Fab部分的一些实施方案中，其中L1和L2位于轻链上并且L3和L4位于重链上，L1的长度为3至12个氨基酸残基，L2的长度为3至14个氨基酸残基，L3的长度为1至8个氨基酸残基，并且L4的长度为1至3个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为5至10个氨基酸残基，L2的长度为5至8个氨基酸残基，L3的长度为1至5个氨基酸残基，并且L4的长度为1至2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为7个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为1个氨基酸残基，并且L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为10个氨基酸残基，L2的长度为10个氨基酸残基，L3的长度为0个氨基酸残基，并且L4的长度为0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自具有0至15个氨基酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的独立选择的长度，其中至少两个接头具有1至15个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)的长度。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4是Asp-Lys-Thr-His-Thr(SEQ ID NO:x)。在一些实施方案中，一个或多个接头包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO:x)，L3包含序列Ser，并且L4包含序列Arg-Thr。在一些实施方案中，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)。在一些实施方案中，L1包含序列Ser，L2包含序列Arg-Thr，L3包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ IDNO:x)，并且L4包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg(SEQ ID NO:x)。

在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自独立地包含选自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(其中n是在0与5之间的整数；SEQ ID NO:x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ IDNO:x)，L2包含序列Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:x)，L3包含序列Ser，并且L4包含序列Arg-Thr。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)，L2包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)，L3的长度为0个氨基酸，并且L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)，L2包含序列Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)，L3的长度为0个氨基酸，并且L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)，L2的长度为0个氨基酸，L3包含序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)，并且L4的长度为0个氨基酸。在一些实施方案中，L1和L2的长度为零个氨基酸，并且L3和L4各自包含独立地选自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(SEQ ID NO:x)(其中n是在0与5之间的整数；SEQ IDNO:x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:x)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)。在一些实施方案中，L3和L4的长度为零个氨基酸，并且L1和L2各自包含独立地选自以下的序列：(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(其中n是在0与5之间的整数；SEQ ID NO:x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQID NO:x)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO:x)、Ser、Arg-Thr、Thr-Lys-Gly-Pro-Ser(SEQ ID NO:x)、Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro(SEQ ID NO:x)和Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)。

在一些实施方案中，一个或多个接头包含从天然存在的序列衍生的序列，所述天然存在的序列位于抗体可变结构域与抗体恒定结构域之间的接合处(例如，如WO 2012/135345中所述，将所述专利通过引用并入)。例如，在一些实施方案中，接头包含在内源VH结构域与CH1结构域之间或在内源VL结构域与CL结构域(例如，κ或λ)之间的过渡处发现的序列。在一些实施方案中，接头包含在内源人VH结构域与CH1结构域之间或在内源人VL结构域与CL结构域(例如，人κ或λ)之间的过渡处发现的序列。

上文列出的例子并不意图以任何方式限制本公开文本的范围，并且包含随机选择的氨基酸的接头适合用于在本文所述的结合蛋白中使用，所述随机选择的氨基酸选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。关于接头序列的另外描述，参见例如WO 2012/135345、WO2017/180913，将所述专利通过引用并入。

如本文所用，术语“化合价”是指结合蛋白、表位、抗原结合蛋白或抗体的结合位点数量。例如，术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。术语“二价结合蛋白”是指具有两个结合位点的结合蛋白。术语“三价结合蛋白”是指具有三个结合位点的结合蛋白。术语“四价结合蛋白”是指具有四个结合位点的结合蛋白。在特定实施方案中，二价结合蛋白可以结合一种抗原靶标。在其他实施方案中，二价结合蛋白可以结合两种不同的抗原靶标。在特定实施方案中，三价结合蛋白可以结合一种抗原靶标，即是单特异性的。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合两种不同的抗原靶标，即是双特异性的。在其他实施方案中，三价结合蛋白可以结合三种不同的抗原靶标，即是三特异性的。在特定实施方案中，四价结合蛋白可以结合一种抗原靶标，即是单特异性的。在其他实施方案中，四价结合蛋白可以结合两种不同的抗原靶标，即是双特异性的。在其他实施方案中，四价结合蛋白可以结合三种不同的抗原靶标，即是三特异性的。在其他实施方案中，四价结合蛋白可以结合四种不同的抗原靶标，即是四特异性的。

如本文所用，术语“特异性”是指结合蛋白、表位、抗原结合蛋白或抗体的结合特异性数量。例如，术语“单特异性结合蛋白”是指与一种抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。术语“双特异性结合蛋白”是指与两种不同的抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。术语“三特异性结合蛋白”是指与三种不同的抗原靶标特异性地结合的结合蛋白。术语“四特异性结合蛋白”是指与四种不同的抗原靶标特异性地结合的结合蛋白，如此等等。

如本文所用，术语“选择性识别位点”是指结合蛋白中的修饰，所述修饰允许由与选择性识别位点结合的亲和试剂选择性地识别。选择性识别位点的例子包含免疫球蛋白的Fc部分中针对蛋白质A的结合位点。

如本文所用，术语“亲和试剂”是指含有配体的试剂，所述配体固定在基质上并且与分子的表面基团如氨基酸或糖侧链特异性地结合，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。亲和试剂是亲和色谱中的工具，在亲和色谱中通过配体与产物之间的特异性相互作用而使得能纯化。作为亲和试剂的例子的“蛋白质L”是指重组蛋白L，其被固定在基质上以形成对免疫球蛋白κ轻链的可变结构域的亚组具有亲和力的配体。此类基质可以是树脂。亲和试剂的另一个例子是“KappaSelect”，它是指重组的骆驼衍生的13kDa单链抗体，其被固定在基质上以形成对人免疫球蛋白κ轻链的恒定结构域具有亲和力的配体。亲和试剂的另一个例子是蛋白质A。蛋白质A是最初在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁上发现的42 kDa表面蛋白。已经经由晶体学精细化显示，蛋白质A的主要结合位点位于Fc区上，在CH2结构域与CH3结构域之间。另外，已经显示蛋白质A结合含有来自人VH3基因家族的IgG F(ab′)2片段的人IgG分子。蛋白质A能以强亲和力与某些物种的免疫球蛋白的Fc部分结合。

例如，可以通过表面等离子体共振确定结合蛋白的解离常数(KD)。通常，表面等离子体共振分析通过表面等离子体共振(SPR)使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；新泽西州皮斯卡塔韦)测量配体(生物传感器基质上的靶抗原)与分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。表面等离子体分析还可以通过固定分析物(生物传感器基质上的结合蛋白)并呈递配体(靶抗原)来进行。如本文所用，术语“KD”是指特定结合蛋白与靶抗原之间的相互作用的解离常数。

如本文所用，术语“特异性地结合”是指结合蛋白或其抗原结合片段以至少约1x10^-6M、1x10^-7M、1x10^-8M、1x10^-9M、1x10^-10M、1x10^-11M、1x10^-12M或更大的Kd结合含有表位的抗原的能力，和/或以比所述结合蛋白或其抗原结合片段对非特异性抗原的亲和力大至少两倍的亲和力结合表位的能力。可以使用BIAcore仪器通过表面等离子体共振(SPR)来进行抗原对结合蛋白或抗体的结合亲和力。

如本文所用，术语“核酸”是指对于所有已知的生命形式都是必需的聚合或寡聚大分子或者生物大分子。包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的核酸是由称为核苷酸的单体制得。大多数天然存在的DNA分子由两条互补的生物聚合物链组成，所述生物聚合物链围绕彼此盘绕以形成双螺旋。DNA链还被称为由核苷酸组成的多核苷酸。每个核苷酸由含氮核碱基以及称为脱氧核糖或核糖的单糖和磷酸基团构成。天然存在的核碱基包含鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。核苷酸在链中通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸之间的共价键彼此接合，从而产生交替的糖-磷酸骨架。如果糖是脱氧核糖，则聚合物是DNA。如果糖是核糖，则聚合物是RNA。通常，多核苷酸是通过单独核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成的。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。应理解，包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。此类修饰包括碱基修饰(如溴尿苷)、核糖修饰(如阿糖胞苷和2′,3′-二脱氧核糖)以及核苷酸间连接修饰(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate))。术语“多核苷酸”具体地包括DNA的单链和双链形式。

“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合的多核苷酸，所述分离的多核苷酸：(1)不与在自然界中发现其所在的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)与在自然界中其并不连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。

“分离的多肽”是如下多肽，其：(1)不含通常与其一起被发现的至少一些其他多肽，(2)基本上不含来自相同来源(例如，来自相同物种)的其他多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经从至少约50％的在自然界中与所述分离的多肽结合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(5)不与在自然界中与所述“分离的多肽”结合的多肽的部分(通过共价或非共价相互作用)结合，(6)与在自然界中不与所述分离的多肽结合的多肽可操作地(通过共价或非共价相互作用)结合，或(7)在自然界中不存在。这种分离的多肽可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或具有合成来源的其他RNA或其任何组合来编码。在示例性实施方案中，分离的多肽基本上不含在其自然环境中发现的会干扰其应用(治疗、诊断、预防、研究或其他应用)的多肽或其他污染物。

如本文所用，术语“表达载体”还被称为表达构建体，通常是指设计用于细胞中的蛋白质表达的质粒或病毒。术语“载体”是指能够被引入细胞中或者能够将其中所包含的蛋白质和/或核酸引入细胞中的蛋白质或多核苷酸或其混合物。载体的例子包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。特别地，使用载体将感兴趣的基因产物(如例如，外来或异源DNA)转运至合适的宿主细胞中。载体可以含有促进载体在宿主细胞中的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外来DNA被定义为异源DNA，所述异源DNA是并非在宿主细胞中天然发现的DNA，所述异源DNA例如复制载体分子，编码可选择或可筛选标记，或编码转基因。一旦进入宿主细胞，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生几个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以含有必需元件，所述必需元件允许将插入的DNA转录成mRNA分子或者以其他方式导致插入的DNA复制到多个拷贝的RNA中。载体可进一步涵盖调节感兴趣的基因的表达的“表达控制序列”。通常，表达控制序列是多肽或多核苷酸，例如但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子或阻遏物。在包含编码感兴趣的一种或多种基因产物的多于一种多核苷酸的载体中，可通过一种或多种表达控制序列一起或单独控制表达。更具体地，载体上所包含的每种多核苷酸可以通过单独的表达控制序列来控制，或者载体上所包含的所有多核苷酸可以通过单一表达控制序列来控制。通过单一表达控制序列控制的单一载体上所包含的多核苷酸可以形成开放阅读框。一些表达载体另外含有与插入的DNA相邻的序列元件，所述序列元件增加所表达的mRNA的半衰期和/或允许将mRNA翻译成蛋白质分子。因此可快速地合成由插入的DNA编码的许多mRNA和多肽分子。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指其中已经引入了重组表达载体的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞意图不仅是指特定的受试细胞，而且是指这种细胞的子代。因为后代中可能由于突变或环境影响而发生某些修饰，所以这种子代可能实际上与亲代细胞不同，但是此类细胞仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。众多种宿主细胞表达系统可以用于表达结合蛋白，所述表达系统包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适的细菌表达载体的例子是pUC19。为了重组表达结合蛋白，用携带编码结合蛋白多肽链的DNA片段的一种或多种重组表达载体转化或转染宿主细胞，使得在所述宿主细胞中表达所述多肽链并且在示例性实施方案中分泌到培养所述宿主细胞的培养基中，从而可以从所述培养基回收所述结合蛋白。

如本文所用，术语“药物组合物”是指当适当地施用给受试者(例如，人类受试者)时能够诱导所需治疗效果的化合物或组合物。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适合用于实现或增强结合蛋白的递送的一种或多种配制材料。

术语“有效量”和“治疗有效量”当关于包含一种或多种结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的药物组合物使用时是指足以产生所需治疗结果的量或剂量。更具体地，治疗有效量是结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的足以将与所治疗病症相关的一种或多种临床上定义的病理过程抑制一定时间段的量。有效量可以根据所使用的特定抗体样结合蛋白而变化，并且还取决于与所治疗患者和障碍严重程度相关的多种因素和状况。例如，如果要在体内施用结合蛋白或多特异性结合蛋白，则诸如患者的年龄、体重和健康状况以及在临床前动物工作中获得的剂量反应曲线和毒性数据等因素将属于所考虑的那些因素。给定的药物组合物的有效量或治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

如本文所用，术语“产生结合蛋白的方法”是指使用本领域熟知的技术进行的蛋白质表达的重组方法。

II.促进配对的CH1/CL突变

在某些实施方案中，可以在CH1和CL界面中进行突变以促进特异性配对并防止CH1/CL错误配对。此类突变在下文有描述，并且进一步详细描述于以下文献中：WO 2013/005194和Golay等(2016)J.Immunol.第196卷.第3199-3211页，将所述专利和文献中的每一个通过引用并入本文。

可以对CH1和CL结构域中的相互作用极性界面氨基酸对进行第一组突变。可以将所述极性氨基酸交换为中性和成盐氨基酸对。在某个实施方案中，第一组突变可以包含T192E CH1突变以及N137K、S114A CLκ突变。T192E CH1突变和N137K CLκ突变形成可以加强缔合特异性的盐桥，然而不希望的配对应该通过缺乏野生型与变体CH1和CLκ结构域之间的空间和电荷互补性来避免。另外，进行CLκ结构域上的S114A突变以避免与较大的赖氨酸侧链的空间冲突。可替代地，CH1 T192E和CL N137K/S114A突变组可以被称为“CR3”突变组。

可以对CH1和CLκ结构域中的相互作用疏水性和极性界面氨基酸残基对进行第二组突变。一个突变可以构成从疏水性相互作用到极性相互作用的开关。在某个实施方案中，第二组突变可以包含L143Q、S188V CH1突变以及V133T、S176V CLκ突变。L134Q CH1突变和V133T CLκ突变构成从疏水性相互作用到极性相互作用的开关。同时存在的S188V CH1突变和S176V CLκ突变构成从极性相互作用到疏水性相互作用的开关。预期界面相互作用的极性/疏水性特征的交换使突变的CH1与CLκ结构域之间的亲和力保持不变，同时降低它们对其他野生型对应物CH1和CLκ结构域的相应亲和力，由此借助在错配的(变体/野生型)结构域上出现的不利相互作用来防止错误配对。可替代地，CH1 L143Q/S188V和CL V133T/S176V突变组可以被称为“MUT4”突变组。

第三组和第四组突变是“杵臼结构”突变。更具体地，在第三组突变(KH1)中，进行L124A、L143E CH1突变并进行V133W CLκ突变。在第四组突变(KH2)中，进行V190A CH1突变并进行L135W、N137A CLκ突变。第一组、第二组、第三组和第四组突变进一步详细描述于WO2013/005194 A1中。

可以进行第五组和第六组突变以交换CH1和CLκ结构域中的静电电荷。在某个实施方案中，第五组突变可以包含K221E CH1突变以及E123K CLκ突变。可替代地，第五组突变可以被称为“K221E/E123K相反电荷”突变组或“NN1”突变组。在某个实施方案中，第六组突变可以包含K228D CH1突变以及D122K CLκ突变。可替代地，第六组突变可以被称为“K228D/D122K相反电荷”突变组或“NN2”突变组。第五组和第六组突变进一步详细描述于WO 2007/147901 A1中。在某些实施方案中，可以将“K221E/E123K相反电荷”突变组和“K228D/D122K相反电荷”突变组进行组合。因此，所述组合可以包含K221E和K228D CH1突变对以及E123K和D122K CLκ突变对。可替代地，组合的突变组可以被称为“K221E:K228D/E123K:D122K相反电荷”突变组或“NN3”突变组。

可以进行第七组和第八组突变以交换CH1结构域和CLκ结构域中的静电电荷。在某个实施方案中，第七组突变可以包含L143E、L143D、L143R、L143K或L143H CH1突变以及S176E、S176D、S176R、S176K或S176H CLκ突变，条件是CH1突变与CLκ突变带相反电荷。可替代地，第七组突变可以被称为“L143/S176相反电荷”突变组。在某些实施方案中，CH1 L143E或L143D突变可以与CL S176R或S176K突变配对，并且可以被称为“CM3”突变组。在某些实施方案中，CH1 L143R或L143K突变可以与CL S176E或S176D突变配对，并且可以被称为“CM4”突变组。在某个实施方案中，第八组突变可以包含L124E、L124D、L124R、L124K或L124H CH1突变以及V133E、V133D、V133R、V133K或V133H CLκ突变，条件是CH1突变与CLκ突变带相反电荷。可替代地，第八组突变可以被称为“L124/V133相反电荷”突变组。在某些实施方案中，CH1 L124E或L124D突变可以与CL V133R或V133K突变配对，并且可被称为“CM5”突变组。在某些实施方案中，CH1 L124R或L124K突变可以与CL V133E或V133D突变配对，并且可以被称为“CM6”突变组。

在另外的实施方案中，上文所提及的突变中的任何一个或多个可以相互组合和/或与下文所述的突变组合。作为例子，第一Fab的CH1结构域包含T192E、K221E突变，并且第一Fab的CLκ结构域包含E123K、N137K、S114A突变。第二Fab的CH1结构域可以进一步包含L143Q、S188V突变，并且第二Fab的CLκ结构域可以包含V133T、S176V突变。可替代地，第二Fab可以是野生型的。

本文关于CH1结构域和CLκ结构域使用的序列位置编号参考Kabat编号(Kabat,E.A.等,Sequences of proteins of immunological interest.第5版-US Department ofHealth and Human Services,NIH出版号91-3242,第662、680、689页,1991)。

III.促进配对的VH/VL相反电荷突变

在某些实施方案中，可以在VH和VL界面中进行突变以促进特异性配对并防止VH/VL错误配对。在特定实施方案中，对VH和VL结构域进行的突变引入带相反电荷的氨基酸残基以通过静电相互作用促进异二聚化。

在某个实施方案中，一组相反电荷突变可以包含在VH结构域中在Kabat位置39处的突变和在VL结构域中在Kabat位置38处的突变。可以在VH Kabat位置39处引入任何已知的带正电荷或带负电荷的残基，条件是在VL Kabat位置38处引入的突变带相反电荷。例如，一个可能的突变对包含VH K39突变残基(引入正电荷)和VL E38突变残基(引入负电荷)。可替代地，可以进行回复突变组，其中引入VH E39突变残基(引入负电荷)和VL K38突变残基(引入正电荷)。在某些实施方案中，VH结构域可以在Kabat位置39处包含突变为E、D、K、R或H的残基，并且VL结构域可以在Kabat位置38处包含突变为E、D、K、R或H的残基，条件是VH结构域中的突变残基与VL结构域中的突变残基带相反电荷。例如，当VH结构域在Kabat位置39处包含突变残基E或D时，则VL结构域在Kabat位置38处包含突变残基K、R或H。可替代地，当VH结构域在Kabat位置39处包含突变残基K、R或H时，则VL结构域在Kabat位置38处包含突变残基E或D。在其中两个VH/VL对不在同一多肽链中的某个实施方案中，如果一个VH/VL对包含VH39中的正电荷(例如E或D)和VL38中的负电荷(例如K、R或H)，则另一个VH/VL对可以包含VH39中的负电荷(例如K、R或H)和VL38中的正电荷(例如E或D)。例如，如果第一VH/VL对包含VH39K和VL38E突变，则第二VH/VL对可以包含VH39E和VL38K突变。可替代地，这组相反电荷突变可以被称为“VH39/VL38相反电荷”突变组。这组带相反电荷的突变进一步详细描述于以下文献中：Tan等,Biophysical Journal.第75卷.第1473-1482页.1998。

在某个实施方案中，一组相反电荷突变可以包含VH结构域中的Q39突变和VL结构域中的Q38突变。可以在VH Q39位置处引入任何已知的带正电荷或带负电荷的残基，条件是在VL Q38位置处引入的突变带相反电荷。例如，一个可能的突变对包含VH Q39K突变(引入正电荷)和VL Q38E突变(引入负电荷)。可替代地，可以进行回复突变组，其中引入VH Q39E突变(引入负电荷)和VL Q38K突变(引入正电荷)。在某些实施方案中，VH结构域可以包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL结构域可以包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，条件是VH结构域中的突变与VL结构域中的突变带相反电荷。

在另外的实施方案中，上文所提及的突变中的任何一个或多个可以相互组合和/或与下文所述的突变组合。

IV.VH/VL二硫键稳定突变

在某些实施方案中，可以在VH和VL界面中进行突变以改进VH/VL界面之间的稳定性。VH结构域和VL结构域中特定的氨基酸突变组可以通过引入形成二硫桥的非天然半胱氨酸残基来改进稳定性。

可以对VH和VL结构域中的氨基酸残基进行第一组二硫键稳定突变。在某个实施方案中，第一组二硫键稳定突变可以包含VH结构域中的44C突变和VL结构域中的100C突变。可替代地，第一组二硫键稳定突变可以被称为“VH44C/VL100C”突变组。第一组二硫键稳定突变进一步详细描述于以下文献中：Reiter等Nature Biotechnology.第14卷.第1239-1245页.1996，出于所有目的将所述文献通过引用并入本文。

可以对VH和VL结构域中的氨基酸残基进行第二组二硫键稳定突变。在某个实施方案中，第二组二硫键稳定突变可以包含VH结构域中的105C突变和VL结构域中的43C突变。可替代地，第二组二硫键稳定突变可以被称为“VH105C/VL43C”突变组。第二组二硫键稳定突变进一步详细描述于美国专利号9,527,927中，出于所有目的将所述专利通过引用并入本文。

V.抗体突变组合

在某些实施方案中，突变组的组合可以位于CH1和CLκ界面中和/或位于VH和VL界面中，以进一步促进配对和改进稳定性。

在特定实施方案中，抗体中的第一Fab结构域可以包含CR3和MUT4突变组中的一个或两个与VH/VL相反电荷突变组的组合。在另外的实施方案中，抗体中的第二Fab结构域可以包含CR3和MUT4突变组中的一个或两个与VH/VL相反电荷突变组的组合。

在特定实施方案中，第一Fab结构域可以包含CR3和MUT4突变组中的一个或两个与VH/VL相反电荷突变组和二硫键稳定突变组的组合。在另外的实施方案中，抗体中的第二Fab结构域可以包含CR3和MUT4突变组中的一个或两个与VH/VL相反电荷突变组和二硫键稳定突变组的组合。

上文实施方案中的任一个可以进一步包含CH1/CL界面中的相反电荷突变组。例如，第一Fab可以包含K221E CH1突变和E123K CLκ突变。第二Fab可以包含K221E CH1突变和E123K CLκ突变。

VI.抗体形式和其中的突变组

上文列举的突变组及其组合的任一种可以应用于本文所述的多特异性抗原结合蛋白。

交叉双可变

在特定实施方案中，“交叉双可变”或“CODV”是指与至少一种靶抗原或至少一种靶表位特异性地结合的抗原结合结构域，并且包含形成至少两个抗原结合位点的至少两条多肽链，其中至少一条多肽链包含由下式表示的结构：

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

并且至少一条多肽链包含由下式表示的结构：

VH2-L3-VH1-L4-CH1[II]

其中：

VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；并且

L1、L2、L3和L4是氨基酸接头，并且

其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。

在特定实施方案中，CODV抗原结合结构域与至少一种靶抗原或至少一种靶表位特异性地结合，并且包含形成四个抗原结合位点的四条多肽链，其中两条多肽链各自包含由下式表示的结构：

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

并且两条多肽链各自包含由下式表示的结构：

VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc[II]

其中：

VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

Fc是免疫球蛋白铰链区以及CH2和CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；并且

L1、L2、L3和L4是氨基酸接头，并且

其中式I的所述多肽和式II的所述多肽形成交叉轻链-重链对，

其中VH1/VL1对包含第一抗原结合特异性，并且VH2/VL2对包含第二抗原结合特异性。

在特定实施方案中，本文所述的抗原结合蛋白是三特异性和/或三价抗原结合蛋白，其包含形成与一种或多种不同的抗原靶标特异性地结合的三个抗原结合位点的四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：

VL2-L1-VL1-L2-CL[I]

第二多肽链包含由下式表示的结构：

VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3[II]

第三多肽链包含由下式表示的结构：

VH3-CH1-铰链-CH2-CH3[III]

并且第四多肽链包含由下式表示的结构：

VL3-CL[IV]，

其中：

VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；

VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；

CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；

CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；

铰链是连接所述CH1结构域和所述CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且

L1、L2、L3和L4是氨基酸接头，并且

其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。

在某些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链具有形成两个不同抗原结合位点的交叉取向。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合对并形成第一抗原结合位点。在一些实施方案中，VH2和VL2形成结合对并形成第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第三多肽和第四多肽形成第三抗原结合位点。在一些实施方案中，VH3和VL3形成结合对并形成第三抗原结合位点。

这种抗原结合蛋白包含至少三个抗原结合位点。所述抗原结合蛋白至少是三价抗原结合分子。在特定实施方案中，所述抗原结合蛋白与一种抗原靶标特异性地结合，即，所述抗原结合蛋白是单特异性抗原结合分子。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白与两种不同抗原靶标特异性地结合，即，所述抗原结合蛋白是双特异性抗原结合分子。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白与三种不同抗原靶标特异性地结合，即，所述抗原结合蛋白是三特异性抗原结合分子。

上文列出的例子并不意图以任何方式限制本发明的范围，并且已经显示包含选自以下的随机选择的氨基酸的接头在本文所述的抗体样结合蛋白中是合适的：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸。

CODV抗体形式、CODV抗体形式的各种排列以及关于接头的其他细节进一步描述于WO 2012/135345A1和WO 2017/180913A2中，将所述专利通过引用以其整体并入本文。

串联Fab

在特定实施方案中，“串联Fab”是指抗原结合蛋白，其中第一Fab结构域的一个CH1区的C末端与第二Fab结构域的VH区的N末端可操作地连接。在某些实施方案中，串联fab抗体可以是四价和单特异性的(四个Fab中的每一个结合相同抗原)。在某些实施方案中，串联fab抗体可以是四价和双特异性的(四个Fab中的两个结合第一抗原或表位，而另两个fab结合第二抗原或表位)。

串联fab可以用本领域用于连接两个或更多个抗原结合结构域的任何已知肽接头可操作地连接。在特定实施方案中，肽接头是Gly-Ser接头，即，仅包含一个或多个甘氨酸氨基酸和一个或多个丝氨酸氨基酸的接头。在特定实施方案中，肽接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(SEQ ID NO:x)接头，其中n是1至5的任何整数。在特定实施方案中，肽接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃(SEQ ID NO:x)接头。在特定实施方案中，肽接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂(SEQ ID NO:x)接头。

可替代地，或者与上文列举的Gly-Ser接头组合，肽接头可以包含选自IgA、IgG和IgD的一种或多种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。下文指出了人IgG、IgA和IgD的铰链区的序列：

IgA1(SEQ ID NO:X)：

Val-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser。

IgA2(SEQ ID NO:X)：

Val-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro。

IgD(SEQ ID NO:X)：Glu-Ser-Pro-Lys-Ala-Gln-Ala-Ser-Ser-Val-Pro-Thr-Ala-Gln-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Ser-Leu-Ala-Lys-Ala-Thr-Thr-Ala-Pro-Ala-Thr-Thr-Arg-Asn-Thr-Gly-Arg-Gly-Gly-Glu-Glu-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu-Gln-Glu-Glu-Arg-Glu-Thr-Lys-Thr-Pro。

IgG1(SEQ ID NO:X)：

Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro。

IgG2(SEQ ID NO:X)：

Glu-Arg-Lys-Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro。

IgG3：

Glu-Leu-Lys-Thr-Pro-Leu-Gly-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Arg-Cys-Pro(SEQ ID NO:X)，随后是Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Thr-Pro-Pro-Pro-Cys-Pro-Arg-Cys-Pro的0或1至4个重复(SEQ ID NO:X)。

IgG4：

Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO:X)。

所述肽接头可以包含仅一种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，所述免疫球蛋白可以与从其衍生出相邻CH1结构域的免疫球蛋白属于相同的同种型和亚类，或者属于不同的同种型或亚类。

可替代地，所述肽接头可以包含不同的同种型或亚类的至少两种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，直接跟在CH1结构域之后的肽接头的N末端部分可以由免疫球蛋白的铰链区的全部或部分组成，所述免疫球蛋白与从其衍生出所述CH1结构域的免疫球蛋白属于相同的同种型和亚类。任选地，所述肽接头可以进一步包含免疫球蛋白的CH2结构域的2至15个或5至10个N末端氨基酸的序列。

在某些实施方案中，可以使用来自天然铰链区的序列。在其他实施方案中，可以向这些序列引入点突变，特别是用丙氨酸或丝氨酸替代天然IgG1、IgG2或IgG3铰链序列中的一个或多个半胱氨酸残基，以便避免不希望的链内或链间二硫键。

可以用于本公开文本的抗原结合蛋白中的肽接头的非限制性例子是具有以下序列的肽接头：Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly(SEQID NO:x)。所述肽接头由以下组成：人IgG1铰链的全长序列，随后是人IgG1 CH2的9个N末端氨基酸(Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser，SEQ ID NO:X)，随后是人IgA1铰链的一部分序列(Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser，SEQ ID NO:X)，并且随后是被添加以向所述接头提供补充柔性的二肽GG。在特定实施方案中，肽接头Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:x)可以有一个或多个半胱氨酸残基被替代以消除二硫键形成。在特定实施方案中，肽接头包含以下序列：Glu-Pro-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Ser-Pro-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:X)。铰链衍生的肽接头进一步描述于WO 2013/005 194 A2中，将所述专利通过引用以其整体并入本文。

VII.示例性抗体突变和抗体形式组合

上文列举的抗体突变中的任一种可以与上文列举的抗体形式中的任一种组合。

在特定实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白可以包含CODV抗体形式，所述CODV抗体形式具有CR3突变组、MUT4突变组、L143/S176相反电荷突变组和L124/V133相反电荷突变组中的一个或多个。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个VH/VL相反电荷突变组。所述一个或多个VH/VL相反电荷突变组包括但不限于VH39/VL38相反电荷突变组。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个VH/VL二硫键稳定突变组。所述一个或多个VH/VL二硫键突变组包括但不限于VH44C/VL100C突变组和VH105C/VL43C突变组。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个CH1/CL相反电荷突变组。所述一个或多个CH1/CL相反电荷突变组可以包括但不限于K221E/E123K相反电荷突变组。

在特定实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白包含两条多肽链并形成两个抗原结合位点，其中一条多肽链具有由下式表示的结构：

VL1-L1-VL2-L2-CL[I]

并且一条多肽链具有由下式表示的结构：

VH2-L3-VH1-L4-CH1[II]

其中：

VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；

VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；

VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；

VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；

CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；

CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；并且

L1、L2、L3和L4是氨基酸接头，

其中式I的所述多肽和式II的所述多肽形成交叉轻链-重链对，

其中VH1和VH2中的一个或两个包含VH44C突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含VL100C突变以形成二硫键，

其中VH1和VH2中的一个或两个包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，其中在VH1和VH2中的一个或两个中的所述突变与在VL1和VL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷，并且

其中CH1结构域包含T192E、L143Q和S188V突变中的一个或多个，并且CL结构域包含N137K、S114A、V133T和S176V突变中的一个或多个。

在特定实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白可以包含串联Fab抗体形式，所述串联Fab抗体形式具有CR3突变组、MUT4突变组、L143/S176相反电荷突变组和L124/V133相反电荷突变组中的一个或多个。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个VH/VL相反电荷突变组。所述一个或多个VH/VL相反电荷突变组包括但不限于VH39/VL38相反电荷突变组。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个VH/VL二硫键稳定突变组。所述一个或多个VH/VL二硫键突变组包括但不限于VH44C/VL100C突变组和VH105C/VL43C突变组。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个CH1/CL相反电荷突变组。所述一个或多个CH1/CL相反电荷突变组可以包括但不限于K221E/E123K相反电荷突变组。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含：

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含：

(3)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；和

(4)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)，

其中CH1-1的C末端与VH2的N末端可操作地连接，并且

其中VH1和VH2中的一个或两个包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，其中在VH1和VH2中的一个或两个中的所述突变与在VL1和VL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷，并且

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含T192E、L143Q和S188V突变中的一个或多个，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含N137K、S114A、V133T和S176V突变中的一个或多个，

其中在CH1-1和CL1中促进配对的突变与在CH1-2和CL2中促进配对的突变是不同的。

在特定实施方案中，本公开文本的抗原结合蛋白可以包含传统的Y形抗体形式，所述传统的Y形抗体形式具有CR3突变组、MUT4突变组、L143/S176相反电荷突变组和L124/V133相反电荷突变组中的一个或多个。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个VH/VL相反电荷突变组。所述一个或多个VH/VL相反电荷突变组包括但不限于VH39/VL38相反电荷突变组。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个VH/VL二硫键稳定突变组。所述一个或多个VH/VL二硫键稳定突变组包括但不限于VH44C/VL100C突变组和VH105C/VL43C突变组。抗原结合蛋白可以进一步包含一个或多个CH1/CL相反电荷突变组。所述一个或多个CH1/CL相反电荷突变组可以包括但不限于K221E/E123K相反电荷突变组。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中VH1和VH2中的一个或两个包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，其中在VH1和VH2中的一个或两个中的所述突变与在VL1和VL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含T192E、L143Q和S188V突变中的一个或多个，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含N137K、S114A、V133T和S176V突变中的一个或多个，并且

其中在CH1-1和CL1中促进配对的突变与在CH1-2和CL2中促进配对的突变是不同的。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中VH1和VH2中的一个或两个包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，其中在VH1和VH2中的一个或两个中的所述突变与在VL1和VL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含T192E、L143Q和S188V突变中的一个或多个，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含N137K、S114A、V133T和S176V突变中的一个或多个，并且

其中在CH1-1和CL1中促进配对的突变与在CH1-2和CL2中促进配对的突变是不同的，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个进一步包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个进一步包含E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中VH1和VH2中的一个或两个包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，其中在VH1和VH2中的一个或两个中的所述突变与在VL1和VL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含L143E、L143D、L143K、L143R或L143H突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含S176E、S176D、S176K、S176R或S176H突变，并且其中在CH1-1或CH1-2中的一个或两个中的所述突变与在CL1和CL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中VH1和VH2中的一个或两个包含Q39E、Q39D、Q39K、Q39R或Q39H突变，并且VL1和VL2中的一个或两个包含Q38E、Q38D、Q38K、Q38R或Q38H突变，其中在VH1和VH2中的一个或两个中的所述突变与在VL1和VL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含L124E、L124D、L124K、L124R或L124H突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含V133E、V133D、V133K、V133R或V133H突变，并且其中在CH1-1或CH1-2中的一个或两个中的所述突变与在CL1和CL2中的一个或两个中的所述突变带相反电荷。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中VH1结构域包含VH39E突变，并且VL1结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39E突变，并且VL1结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变，

其中VH1结构域包含VH39E突变，并且VL1结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176E或S176D突变，

其中VH1结构域包含VH39E突变，并且VL1结构域包含VL38K突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域包含L143E或L143D突变，并且CH1-2结构域包含L143R或L143K突变，并且CL1结构域包含S176R或S176K突变，并且CL2结构域包含S176E或S176D突变，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变。

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39E突变，并且VL1结构域包含VL38K突变，

在特定实施方案中，本公开文本的多特异性抗体可以包含：

a)第一轻链(LC1)/重链(HC1)对，所述第一轻链(LC1)/重链(HC1)对包含

(1)第一VL区(VL1)，所述第一VL区(VL1)与第一VH区(VH1)配对以形成第一抗原结合位点；

(2)与VH1可操作地连接的第一恒定重链区1(CH1-1)和与VL1可操作地连接的第一恒定轻链区(CL1)；和

(3)第一异二聚化结构域(HD1)；以及

b)第二轻链(LC2)/重链(HC2)对，所述第二轻链(LC2)/重链(HC2)对包含

(4)第二VL区(VL2)，所述第二VL区(VL2)与第二VH区(VH2)配对以形成第二抗原结合位点；

(5)与VH2可操作地连接的第二恒定重链区1(CH1-2)和与VL2可操作地连接的第二恒定轻链区(CL2)；和

(6)第二异二聚化结构域(HD2)；

其中HD1和HD2异二聚化，

其中CH1-1结构域和CH1-2结构域中的一个或两个包含K221E和K228D突变，并且CL1结构域和CL2结构域中的一个或两个包含D122K和E123K突变，

其中VH1结构域包含VH39K突变，并且VL1结构域包含VL38E突变，

其中VH2结构域包含VH39E突变，并且VL2结构域包含VL38K突变。

VIII.配制品/药物组合物

在某些实施方案中，提供药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的本文所述的抗原结合蛋白。一些实施方案包括药物组合物，其包含与针对与施用方式的适合性选择的药学上或生理学上可接受的配制剂混合的治疗有效量的任一种如本文所述的结合蛋白或结合蛋白-药物缀合物。

可接受的配制材料在所用剂量和浓度下对接受者通常是无毒的。

在一些实施方案中，药物组合物可以含有用于改良、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。合适的配制材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(如钠)、防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronics)；PEG；脱水山梨糖醇酯；聚山梨酯(如聚山梨酯20或聚山梨酯80)；曲通(triton)；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)、张力增强剂(如碱金属卤化物(例如，氯化钠或氯化钾)或甘露醇山梨醇)、递送媒介物、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见例如，出于任何目的通过引用并入本文的REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版,A.R.Gennaro编辑,MackPublishing Company 1990)及其后续版本)。

在一些实施方案中，最佳药物组合物将由技术人员根据例如预期施用途径、递送形式和所需剂量来决定。此类组合物可能影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在一些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体的性质可以是水性或非水性的。例如，适合于注射的媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，它们可以进一步包括山梨醇或合适的取代物。在本公开文本的一个实施方案中，结合蛋白组合物可以通过将具有所选纯度的组合物与呈冻干饼或水溶液形式的任选配制剂混合来制备用于储存。此外，可以使用适当赋形剂如蔗糖将结合蛋白配制为冻干物。

在一些实施方案中，可以选择本公开文本的药物组合物用于肠胃外递送或皮下递送。可替代地，可以选择组合物用于吸入或用于经消化道递送，如口服。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。

在一些实施方案中，配制组分以施用部位可接受的浓度存在。例如，使用缓冲液将组合物维持在生理pH或略低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。

在考虑肠胃外施用时，所用治疗组合物可以呈无热原的肠胃外可接受的水溶液形式，其包含在药学上可接受的媒介物中的所需结合蛋白。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，在其中将结合蛋白配制为适当保存的无菌等渗溶液。又另一种制备可以涉及用提供产物的受控或持续释放的试剂(如可注射微球、生物蚀解性颗粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体)配制所需分子，然后可将所述分子经由积存注射来递送。还可使用透明质酸，并且这可具有促进在循环中的持久持续时间的作用。用于引入所需分子的其他合适的手段包括可植入的药物递送装置。

在一个实施方案中，可以将药物组合物配制用于吸入。例如，可以将结合蛋白配制为吸入用干粉。结合蛋白吸入溶液也可以用用于气溶胶递送的推进剂来配制。在又另一个实施方案中，可以将溶液雾化。

还考虑到可以将某些配制品口服施用。在本公开文本的一个实施方案中，可以将以这种方式施用的多特异性结合蛋白用或不用在固体剂型(如片剂和胶囊)的混配中通常使用的那些载体来配制。例如，胶囊可以设计为在胃肠道中在生物利用度最大化且前系统性降解最小化时释放配制品的活性部分。可以包括其他试剂以有利于结合蛋白的吸收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。

另一种药物组合物可以涉及在具有适合于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的有效量的多特异性结合蛋白。通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当媒介物中，可以按单位剂量形式制备溶液。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或者结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或者润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

本公开文本的另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的，所述药物组合物包括在持续或受控递送配制品中包含结合蛋白的配制品。用于配制多种其他持续或受控递送手段(如脂质体载体、生物蚀解性微粒或多孔珠和积存注射)的技术也是本领域技术人员已知的。持续释放制剂的另外的例子包括呈成型物品(例如薄膜)或微胶囊形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟丁酸。持续释放组合物还可以包括脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的几种方法中的任何方法来制备。

在一些实施方案中，将用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过经无菌滤膜过滤来实现。在将组合物冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用这种方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外，通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器中，所述容器是例如静脉输液袋或具有可以由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。

一旦已经配制药物组合物，可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。可以将此类配制品以即用形式或以需要在施用前重构的形式(例如，冻干)储存。

本公开文本还涵盖用于产生单一剂量施用单元的试剂盒。试剂盒可以各自含有具有干燥的多特异性结合蛋白的第一容器和具有水性配制品的第二容器二者。本公开文本的范围内还包括含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干剂注射器(lyosyringe))的试剂盒。

将治疗性地采用的结合蛋白药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员将认识到，治疗的适当剂量水平将因此部分根据以下而变：所递送的分子、结合蛋白所用于的适应证、施用途径以及患者的大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)。因此，临床医师可以逐步调整剂量并修改施用途径以获得最佳治疗效果。

给药频率将取决于所用配制品中结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师将施用组合物直至达到实现所需效果的剂量为止。因此，可以将组合物作为单一剂量、作为随时间的两个或更多个剂量(它们可以含有或不含等量的所需分子)或作为连续输注经由植入装置或导管来施用。适当剂量的进一步改进是由本领域普通技术人员以常规方式进行，并且在本领域普通技术人员常规进行的任务范围内。适当剂量可以通过使用适当的剂量-反应数据来确定。

药物组合物的施用途径与已知方法一致，例如，口服；通过经静脉内、腹膜内、大脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过持续释放系统；或者通过植入装置。在需要的情况下，组合物可以通过推注注射来施用，或者通过输注连续施用，或者通过植入装置来施用。

在一些实施方案中，还可以将组合物经由已经使所需分子吸附或包封于其上的膜、海绵状物或其他适当材料的植入局部施用。在使用植入装置的情况下，可以将所述装置植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可以经由扩散、定时释放推注或连续施用来进行。

VIII.治疗/使用方法

本公开文本的另一方面是如本文所述用作药物的多特异性抗体和/或抗原结合蛋白。

在特定实施方案中，提供治疗抗原活性是有害的障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的抗原结合蛋白。

结合蛋白可以用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心式测定以及免疫沉淀测定，所述测定方法用于一种或多种靶抗原的检测和定量。结合蛋白将以适合于所用测定方法的亲和力结合所述一种或多种靶抗原。

对于诊断应用，在一些实施方案中，可以用可检测部分标记结合蛋白。可检测部分可以是能够直接或间接产生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素，如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、¹²⁵I、⁹⁹Tc、¹¹¹In或⁶⁷Ga；荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或者酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。

结合蛋白也可用于体内成像。可以将用可检测部分标记的结合蛋白施用给动物，例如施用至血流中，并且测定宿主中经标记的抗体的存在和位置。可以用在动物中通过核磁共振、放射学或本领域已知的其他检测手段可检测的任何部分标记结合蛋白。

对于临床或研究应用，在一些实施方案中，可以将结合蛋白与细胞毒性剂缀合。与细胞毒性剂偶联的多种抗体(即，抗体-药物缀合物)已经用于将细胞毒性有效负载靶向特异性肿瘤细胞。细胞毒性剂和将所述药剂与抗体缀合的接头是本领域已知的；参见例如，Parslow,A.C.等(2016)Biomedicines 4:14和Kalim,M.等(2017)DrugDes.Devel.Ther.11:2265-2276。

本公开文本还涉及包括结合蛋白和可用于检测生物样品中的靶抗原水平的其他试剂的试剂盒。此类试剂可以包括可检测标记、封闭血清、阳性和阴性对照样品以及检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，所述组合物包含本文所述的任何结合蛋白、多核苷酸、载体、载体系统和/或宿主细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含容器以及在所述容器上或与所述容器相连的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV输液袋等。容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料制成。容器容纳组合物，所述组合物(其本身或与另一种组合物组合)可有效治疗、预防和/或诊断病症，并且容器可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉输液袋或具有可以由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，标签或包装说明书指示，所述组合物用于预防、诊断和/或治疗所选病症。可替代地或另外地，制品或试剂盒可以进一步包含含有药学上可接受的缓冲液(如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。所述制品或试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

在一些实施方案中，将本公开文本的结合蛋白施用给有需要的患者用于治疗或预防癌症。在一些实施方案中，本公开文本涉及预防和/或治疗增殖性疾病或障碍(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的至少一种本文所述的结合蛋白或与其相关的药物组合物。在一些实施方案中，患者是人。

在一些实施方案中，将所述至少一种结合蛋白与一种或多种抗癌疗法(例如，本领域已知的任何抗癌疗法，如化学治疗剂或疗法)组合施用。在一些实施方案中，将所述至少一种结合蛋白在所述一种或多种抗癌疗法之前施用。在一些实施方案中，将所述至少一种结合蛋白与所述一种或多种抗癌疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述至少一种结合蛋白在一种或多种抗癌疗法之后施用。

实施例

在下文详细描述本发明之前，应理解，本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由随附权利要求限定。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在特定实施方案中，本文所用的术语如以下文献中所述来定义：“A multilingualglossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations),”Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Kolb,H.编(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland。除非本文另外定义，否则本文所用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文所提供的定义优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式如“包括”(“includes”和“included”)的使用不是限制性的。如本文所用，除非另外说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个提及物。因此，例如，提及“一个/一种蛋白质”时包括多个/多种蛋白质分子。

此外，除非另外指示，否则本文所述的实验使用本领域技术范围内的常规分子和细胞生物学和免疫学技术。此类技术是熟练工作者所熟知的，并且在文献中已充分解释。参见例如，Ausubel等编辑,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2008)，包括所有增补本，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版)MR Green和J.Sambrook，以及Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,第14章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(2013，第2版)。

在本说明书的整个正文中引用了若干文献。本文在上文或下文中引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导等)都是通过引用以其整体特此并入。本文的任何内容都不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于此类披露内容。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素是用具体实施方案来列出，然而，应理解，这些具体实施方案可以以任一方式和以任一数量组合以产生另外的实施方案。差异性描述的实施例和特定实施方案不应视为将本发明限制于仅明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数目的所公开要素的实施方案。此外，除非上下文另外指示，否则应当考虑本申请的说明书公开本申请中所有所述要素的任何排列和组合。

通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的术语是本领域熟知并且一般使用的术语。除非另外指示，否则本文所提供的方法和技术通常是根据本领域熟知并且如本说明书通篇引用和讨论的各个通用和更具体参考文献中所述的常规方法来进行的。根据制造商的说明书来进行酶反应和纯化技术，如本领域通常所实现的或如本文所述。关于本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域熟知且常用的那些。将常规技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

Fab组装是通过VH/VL和CH1/CL结构域相互作用驱动的。产生多种多特异性构建体，它们具有含有不同Fab界面突变的不同结构。研究CH1/CL和VH/VL界面内组合的突变对引导正确配对的能力并描述在下文实施例中。

实施例1：通用表达和纯化方案

双特异性和三特异性分子的表达

使用聚乙烯亚胺转染试剂用所指示的轻链编码质粒和重链编码质粒转染在F17无血清悬浮培养液(Invitrogen)中生长的HEK 293-FS细胞。在37℃下培养7天之后，通过离心去除细胞，并使上清液通过0.22μm过滤器以去除颗粒。

对于纯化，在MabSelect SuRe柱(目录号：11-0034-93，GE Healthcare)上捕获抗体并用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱，并使用HiPrep 26/10脱盐柱(目录号：17-05087-02，GE Healthcare)直接脱盐。在通过尺寸排阻色谱(SEC)使用Superdex200 26/60(GE)精细纯化(polishing)蛋白质和最终的超滤浓缩步骤之后，将蛋白质用于进一步表征。

分析型尺寸排阻色谱(SEC)

使用BioSECcurity仪器(PSS Polymer)用TSKgel SuperSW3000柱(4,6mm x300mm)和TSKgel SuperSW HPLC保护柱(Tosoh Bioscience)在25℃下进行分析型SEC。所述分析是以0.25ml/min的流速使用250mM NaCl、100mM磷酸钠(pH 6.7)来运行，在280nm和260nm下检测。在436nm下检测静态光散射。将5μl蛋白质样品(1mg/ml)施加至柱。使用WinGPC软件8.1版(PSS Polymer)进行数据评价。对于分子量的估计，用分子量范围为6.5至670kDa的蛋白质标准品校准SEC柱。

分析型疏水性相互作用色谱(HIC)

使用LC10 HPLC仪器(Shimadzu)用TSKgel Ether-5PW(10μm，2x75mm)(TosohBioscience)在25℃下进行分析型HIC。所述分析是以0.1ml/min的流速来运行，在280nm下检测。将5μg未稀释的蛋白质样品施加至柱。梯度洗脱是从0至30min(0％至100％B)，随后是10min的100％B和15min的再平衡。缓冲液A由1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。缓冲液B由25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。使用LabSolutions软件5.85版(Shimadzu)进行数据评价。

质谱(MS)

通过LC-MS分析蛋白质完整性。用12.5μg蛋白质(在用0.5μl PNGaseF(无甘油，NewEngland Biolabs)处理的D-PBS缓冲液中稀释至0.5mg/ml)将蛋白质样品在37℃下脱糖基15小时。使用6540UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS仪器(Agilent)进行LC-MS分析。使用Poroshell 300SB-C8(5μm，75x0.5mm)(Agilent)和保护柱Poroshell 300SB-C8(5μm，2.1x12.5mm)(Agilent)以180μL/min进行反相(RP)色谱。洗脱剂是LC水、0.1％甲酸(A)，以及90％乙腈、10％LC水、0.1％甲酸(B)。将2μg蛋白质注射到柱上，并使用在13分钟内从0％至100％B的线性梯度进行洗脱。使用MassHunter软件B.06(Agilent)进行数据分析。使用GPMAW软件9.13a2版(Lighthouse Data)基于蛋白质的氨基酸序列计算分子质量。

表面等离子体共振(SPR)

使用表面等离子体共振(SPR)用BIAcore 3000仪器(GE Healthcare)和HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)测量抗原与抗体构建体的结合。在研究级CM5芯片(GE LifeSciences)上使用标准程序经由伯胺基团(11000RU)固定抗人Fc捕获抗体(人抗体捕获试剂盒，GE Life Sciences)。以导致30RU的最大分析物结合的经调整的RU值以10μl/min的流速捕获配体。将所测试的抗体构建体用作分析物，并在300秒的解离时间和30μL/min的流速下以100nM浓度注射240秒。通过注射3nM至100nM的分析物的两倍连续稀释液使用捕获的抗体进行结合动力学测量。通过用捕获试剂盒所提供的再生缓冲液的2min注射使芯片表面再生。用空白芯片表面和HBS-EP缓冲液空白对传感图进行双重参照。使用BIAevaluation软件4.1版进行数据分析。

差式扫描荧光测定法(DSF)

使用差式扫描荧光测定法(DSF)确定熔点Tm数据。将样品在白色96孔半裙板(BIORAD)中在D-PBS缓冲液(Invitrogen)中稀释至0.2μg/μl的最终浓度，包括SYPRO-Orange染料(Invitrogen，DMSO中的5000x原液)在D-PBS中的4x浓缩溶液。所有测量都是使用MyiQ2实时PCR仪器(BIORAD)一式双份地进行的。在iQ5软件2.1版(BIORAD)中生成熔解曲线的负一阶导数曲线(-d(RFU)/dT)。然后将数据导出至Excel中进行Tm确定和数据的图形显示。

选择的串联Fab抗体、三特异性CODV抗体和双特异性Y形抗体的序列列举于下文表2、表3和表4中。

表2-选择的串联Fab抗体的氨基酸序列。

表3–三特异性CODV抗体的氨基酸序列。

表4–双特异性Y形抗体的氨基酸序列。

实施例2：CODV形式中的使得能异二聚化的突变

针对表达、产量和同质性探索CODV抗体形式的三种不同的突变体。第一形式包含如下CODV抗体，所述CODV抗体具有Fc结构域中的杵臼结构突变以及CODV-Fab中的CH1/κMUT4突变(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab2中的CH1/κCR3突变(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)(图1A)。第二形式包含如下CODV抗体，所述CODV抗体具有Fc结构域中的杵臼结构突变以及第一形式的MUT4/CR3突变，与在CODV-Fab和Fab2二者中的静电突变VH39E/VL38K组合(图1B)。第三形式包含如下CODV抗体，所述CODV抗体具有Fc结构域中的杵臼结构突变以及第二形式的MUT4/CR3突变和静电突变，与CODV-Fab上的二硫键稳定突变VH44C/VL100C组合(图1C)。

可变区中的静电突变和二硫键形成突变的概述示于表4中。CH1/CLκ突变的概述示于表5中。表达和纯化方案的详细描述如实施例1所述。图2A-图2G以图的形式描绘了来自所测试的各种CODV抗体形式的数据。

下文表5概述了对在([OX40 x PD1]+GITR)三特异性CODV抗体上测试的各种CODV抗体形式的表征的结果。CH1/Ck突变：CODV-Fab(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)。CM(带电荷的突变)：CODV-Fab(VH39E/VL38K)和Fab2(VH39K/VL38E)。ds(二硫键稳定突变)：VH44Cys/VL100Cys。如下文在表5中所示，在CH1/CL界面内引入突变增加起始熔点(Tm起始)，从而指示热稳定性的增加。进一步掺入VH/VL修饰显著增加正确配对，如通过HIC和MS所示(参见图2A-图2G)。CH1/CLκ突变组(CR3和MUT4)与二硫键稳定突变的组合示出了有前景的结果，展示出高的HIC单体含量和增加的热稳定性。CH1/CLκ突变组(CR3和MUT4)、二硫键稳定突变和相反电荷突变的组合也示出了有前景的结果。

表5–含有不同Fab界面突变的([OX40 x PD1]+GITR)三特异性CODV抗体的表达和生物物理学表征的概述。

实施例3：串联Fab形式中的使得能异二聚化的突变

探索了串联Fab抗体的两种构象。针对有效表达、纯化和同质性进一步测试每种构象。第一形式由串联Fab的开放构象组成，其中Y形抗体通过VH结构域上的柔性接头附接至另一个Fab片段(参见图3A和图3B)。第二串联Fab由串联fab的闭合构象组成，其中上述VH结构域中的接头可以形成二硫键(参见图3C和图3D)。

针对有效表达、纯化和同质性探索两种突变体，开放-串联Fab构象和闭合-串联Fab构象各一种。第一突变体由仅具有MUT4和CR3突变的开放fab组成(图3A)。第二突变体由具有MUT4和CR3突变与带相反电荷的突变的组合的开放fab组成(图3B)。

针对有效表达、纯化和同质性探索两种突变体，每种具有闭合-串联Fab构象。第一突变体由仅具有MUT4和CR3突变的闭合fab组成(图3C)。第二突变体由具有MUT4和CR3突变与带相反电荷的突变的组合的闭合fab组成(图3D)。

如下文表6中所示，与其中仅引入CH1/CL修饰的实施例相比，CH1/CL突变与VH/VL界面突变的组合增加靶标HIC谱。因此，组合突变减少错误配对种类的量并增加正确配对分子(靶标HIC峰)的量。配对结果的强度取决于抗体序列和结构域比对。

表6–串联Fab抗体的产量、SEC、HIC和结合亲和力数据。

仅具有MUT4/CR3突变的开放构型串联Fab产生大约68％正确配对。然而，观察到引入带相反电荷的突变将正确多肽的产量和同质性从68％增加至96％(图4)。

用抗CD40 x抗PD-L1抗体并排比较开放构型和闭合构型。如在图5A-图5D中可见，如通过HIC所测量，与开放构型相比，闭合构型导致较低的产量和纯度。与CH1/CLκ突变(CR3/MUT4)组合的带相反电荷的突变的添加也改进了纯度。抗PD-1x抗OX40抗体支持这些作用，如图6A-图6C中所示。开放构型导致较高的产量和纯度。包括相反电荷突变进一步改进了产量和纯度。

实施例4：Y形抗体突变

具有Y形结构的双特异性抗体中的正交Fab设计是通过将杵臼结构突变(杵：S354C、T366W；臼：Y349C、T366S、L368A、Y407V)引入相应重链的CH3结构域中来实现。两个不同的Fab臂含有如图8A和图8B中所述的突变，以及在下文表7-9中所示的突变。图8A中的突变是Fab1中的CH1/κMUT4突变(CH1：L143Q、S188V；Ck：V133T、S176V)和Fab2中的CH1/κCR3突变(CH1：T192E；Ck：N137K、S114A)。图8B中的突变是图8A的MUT4/CR3突变，与Fab1和Fab2二者中的静电突变VH39E/VL38K组合。

测试具有多种突变的抗PD-1x抗OX40抗体。下文表7提供了对PD-1x OX40双特异性抗体的变体的表达和生物物理学表征的概述，所述变体的Fab界面突变是变化的。仅CH1/CL的修饰或仅VH/VL的修饰对于防止错误配对是无效的。所提出的CH1/CL突变与VH39/VL38界面突变的组合显著影响引导的配对，如通过HIC和MS所确定(参见图9A-图9C)。

表7–抗PD-1x抗OX40 Y形抗体的变体的表达和生物物理学表征。

测试具有多种突变的抗CD40 x抗PD-L1抗体。下文表8提供了对CD40 x PD-L1双特异性抗体的变体的表达和生物物理学表征的概述，所述变体的Fab界面突变是变化的。仅CH1/CL的修饰或仅VH/VL的修饰对于防止错误配对是无效的。CH1/CL突变与VH39/VL38界面突变的组合显著影响引导的配对，如通过HIC和MS所确定。

表8–抗CD40 x抗PD-L1 Y形抗体的变体的表达和生物物理学表征。

测试与先前抗PD-1x抗OX40抗体具有不同的多种突变的抗PD-1x抗OX40抗体。下文表9提供了对PD1 x OX40双特异性抗体的变体的表达和生物物理学表征的概述，所述变体具有变化的Fab界面突变。如表9中所示，与位置VH38/VL39处的VH/VL界面突变组合的成对CH1/CL突变L143/S176或L124/V133显著增加正确配对种类的量，如通过HIC谱所观察和通过MS分析所验证(图9A-图9C和图10A-图10L)。

表9–抗PD-1x抗OX40 Y形抗体的变体的表达和生物物理学表征。

为了在构建体之间更好地比较，表7-9中SPR数据中的抗原结合水平是相对于所捕获的抗体水平(RU抗原/RU Fc捕获)来报告的。表7-9中的SPR数据显示，所测试的所有抗体构建体都以相当的结合水平与其相应抗原结合。

实施例5：用于实施例6和实施例7的通用表达和纯化方案

分析型尺寸排阻色谱(SEC)

使用BioSECcurity仪器(PSS Polymer)用AdvanceBio 300柱(4.6mm x 300mm)和AdvanceBio 300保护柱(Agilent Technologies)在25℃下进行分析型SEC。所述分析是以0.5ml/min的流速使用2x浓缩的D-PBS缓冲液(Thermo Fisher Scientific)来运行，在280nm下检测。将10μl蛋白质样品(1mg/ml)施加至柱。使用WinGPC软件8.1版(PSS Polymer)进行数据评价。对于分子量的估计，用蛋白质校准标准混合物(Agilent Technologies)校准SEC柱。

分析型疏水性相互作用色谱(HIC)

使用配备有TSKgel Butyl-NPR柱(2.5μm，4.6x35mm)(Tosoh Bioscience)的LC10HPLC仪器(Shimadzu)或Vanquish HPLC仪器(Thermo Fisher Scientific)在25℃下进行分析型HIC。所述分析是以1ml/min的流速来运行，在280nm下检测。将5μg未稀释的蛋白质样品施加至柱。梯度洗脱是在7min内从15％B至85％B，随后是1min至100％B，然后1min至15％B，然后3分钟在15％B下平衡。缓冲液A由1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。缓冲液B由25mM磷酸钠(pH 7.0)构成。使用LabSolutions软件5.85版(Shimadzu)或Chromeleon 7软件(Thermo Fisher Scientific)进行数据评价。

质谱(MS)

通过LC-质谱(LC-MS)分析异二聚体构建体的蛋白质完整性和潜在错误配对。用12.5μg蛋白质(在用0.5μl PNGaseF(无甘油，New England Biolabs)处理的LC-MS级水(Thermo Scientific)中稀释至0.17mg/ml)将蛋白质样品在37℃下脱糖基16小时。使用Thermo Fisher Orbitrap Lumos LC/MS仪器进行LC-MS分析。使用MabPac RP HPLC柱(分析型4μm粒径，2.1x100mm)(Thermo Scientific)以300μL/min进行反相(RP)色谱。洗脱剂是LC水、0.1％甲酸(A)，以及90％乙腈、10％LC水、0.1％甲酸(B)。将2μg蛋白质注射到柱上，并使用在12分钟内从0％至95％B的线性梯度进行洗脱。使用Expressionist软件13.0.3(Genedata)进行数据分析。使用GPMAW软件10.32b1版(Lighthouse data)基于蛋白质的氨基酸序列计算分子质量。

表面等离子体共振(SPR)

使用表面等离子体共振(SPR)用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)和HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare)测量抗原与抗体构建体的结合。对于抗体对其相应抗原的相对结合水平(％Rmax)的评估，通过抗Fc亲和捕获将抗体捕获至传感器芯片。在这个测定中，使用重组人抗原(PD-L1-His(9049-B7-100，R&D Systems)、CD40-His(10774-H08H，SinoBiological)、TNFα(130-094-022，Miltenyi)、GITR-His(内部生产)、PD1-His(8986-PD-100，R&D Systems)、CD3εδ-FLAG-His(#CT038-H2508H，Sino Biological)和人CD123(#301-R3/CF，R&D Systems))。在研究级CM5芯片(GE Life Sciences)上使用标准程序经由伯胺基团(11000RU)固定抗人Fc捕获抗体(人抗体捕获试剂盒，GE Life Sciences)。以导致10至30RU的最大分析物结合的经调整的RU值以10μl/min的流速捕获抗体。将抗原用作分析物并以400nM和100nM浓度(对于CD3εδ-FLAG-His)或以100nM浓度(对于所有其他所用抗原)注射。在300秒的解离时间、30μL/min的流速下，将抗原注射240秒。通过用捕获试剂盒所提供的再生缓冲液的2min注射使芯片表面再生。用空白芯片表面和HBS-EP缓冲液空白对传感图进行双重参照。使用Biacore 8K评价软件1.11.7442版(GE Healthcare)进行数据分析和结合水平确定。使用最大结合水平除以理论Rmax值来计算％Rmax值。从捕获水平R捕获、结合化学计量学N以及抗体分子量Mw(Ab)和抗原分子量Mw(Ag)，根据Rmax＝R捕获*N*(Mw(Ag)/Mw(Ab)来计算Rmax值。

纳米差式扫描荧光测定法(nanoDSF)

使用纳米差式扫描荧光测定法(nano differential scanning fluorimetry，nanoDSF)确定蛋白质变性的起始温度(T起始)和熔点(Tm)。将样品在配制缓冲液中稀释至0.5μg/μl的最终浓度并一式双份地加载到nanoDSF毛细管(Nanotemper Technologies)中。所有测量都是使用Prometheus NT.plex nanoDSF装置(Nanotemper Technologies)进行的。从20℃到95℃，加热速率为1℃/分钟。使用PR.ThermControl软件2.3.1版(NanotemperTechnologies)记录数据并使用PR.稳定性分析软件1.0.3版(Nanotemper Technologies)进行分析。

实施例6：另外的Y形抗体突变

产生具有Y形结构的另外的双特异性抗体并用不同的突变组测试。具体地，采用具有下文表10中列举的突变的抗PD-1x抗OX40抗体。下文数据显示，与野生型对照相比，具有Fab突变的所有Y形抗体都具有减少的错误配对。具有VH39/VL38相反电荷突变组、L143/S176相反电荷突变组和组合的K221E:K228D/E123K:D122K相反电荷突变组的抗体(蛋白质ID Y61)展示出极佳的结果，未检测到错误配对。

表10–抗PD-1 x抗OX40 Y形抗体的变体的表达和生物物理学表征。

实施例7：Y形抗体形式中的使得能异二聚化的另外的突变

测试具有不同的异二聚化突变组的另外的Y形抗体。下文表11列举了所测试的每种Y形抗体的生物物理学表征数据。如表11和图11A-图11E中所列举，“CM1”是指VH39K/VL38E突变对，“CM2”是指VH39E/VL38K突变对，“CM3”是指CH1 L143E或L143D/CL S176R或S176K突变对，“CM4”是指CH1 L143R或L143K/CL S176E或S176D突变对，并且“NN3”是指CH1K221E和K228D/CL D122K和E123K突变对。

表11–串联Fab抗体的异二聚化突变。

如表11和图11A-11E中所示，与野生型抗体相比，所用的各种异二聚化突变每种都减少错误配对。在已知其野生型构型中不具有错误配对的抗TNF x抗OX40抗体(Y49)的情况下，包括异二聚化突变对错误配对没有负面影响(图11C)。

除了上文的生物物理学表征以外，T细胞接合器抗体CD3 x CD123处于基于细胞的细胞毒性测定中。在细胞毒性测定中使用原代人T细胞分析双特异性抗体分子。在Leucosep管(Greiner Bio-One，#227290)中使用15ml Histopaque(Sigma-Aldrich，#10771)和以1000xg离心10min分离来自健康供体血液的人外周单核细胞。将分离的PBMC在补充有5％MACS BSA原液(Miltenyi Biotec，#130-091-370)的autoMACS冲洗缓冲液(MiltenyiBiotec，#130-091-222)中洗涤两次。用MACSpro分离器(Miltenyi Biotec)和Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，#130-096-535)使用制造商的方案从人PBMC中分离原代人T细胞。将分离的人T细胞以5x10⁶个细胞/mL重悬于补充有10％FCS HI(Gibco，#10082-147)的RPMI GlutaMAX I培养基(Gibco，#72400)中。在细胞毒性测定之前，将THP-1靶细胞(ADCCTIB-202)用1μM CFSE(Invitrogen，#C1157)在37℃下染色15min。将细胞在RPMI+GlutaMAXI培养基中洗涤两次，并以400x g离心5min。将THP-1靶细胞以5x10⁵个细胞/mL重悬于补充有10％FCS HI的RPMI培养基中。将CFSE标记的THP-1细胞与人pan T细胞以10:1的效应物与靶标比率混合并以100μl/孔的总体积接种于96孔测定板(Greiner BioOne，#650185)中。将双特异性抗体分子在从10nM开始至0nM(1:6稀释)的11个稀释系列中以5μL/孔的体积添加到细胞中，并在37℃和5％CO₂下温育20小时。在温育之后，将细胞用5μg/ml 7-AAD(Invitrogen，#A1310)在4℃下染色30min。为了确定细胞毒性，通过在LSRII流式细胞仪(BD)上对CFSE/7-AAD双阳性THP-1细胞进行门控来测量死靶细胞，并用Xlfit软件确定EC50值。

如图12中所示，所有三种CD3 x CD123双特异性抗体都展示出相当且稳健的活性。Y56和Y57中异二聚化突变的存在对活性没有负面影响，然而减少链错误配对。