阅读说明：本技术 用于治疗癌症的多克隆抗体和抗pd1或抗pdl1抗体的联合 (Combination of polyclonal antibodies and anti-PD 1 or anti-PDL 1 antibodies for the treatment of cancer ) 是由 O·迪沃 B·瓦恩霍维 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及针对癌细胞的非人哺乳动物多克隆抗体；与至少一种选自下组的单克隆抗体的联合：抗PD1和抗PDL1单克隆抗体,其用于预防和/或治疗哺乳动物患者的癌症。也预期这种联合。(The present invention relates to non-human mammalian polyclonal antibodies directed against cancer cells; in combination with at least one monoclonal antibody selected from the group consisting of: anti-PD 1 and anti-PDL 1 monoclonal antibodies for use in the prevention and/or treatment of cancer in a mammalian patient. Such combinations are also contemplated.)

具体实施方式

实施例1：通过用癌细胞系免疫兔获得的多克隆抗体的ELISA对照

用来自鼠肿瘤细胞系Hepa 1.6(肝细胞癌)的细胞免疫兔以获得相应的抗肿瘤多克隆抗体。

所述肿瘤细胞皮下注射两次，间隔两周。

在第一次皮下注射(Rabbit–I1+7)后7天和第二次皮下注射(Rabbit–I2+7)后7天，实际上在预先免疫的兔(Rabbit–J0)中收集血清以测试抗体识别用于免疫兔的肿瘤细胞的能力。

更特别地，基于用于免疫兔的Hepa 1.6细胞，使用细胞ELISA测试测量经免疫兔的抗体反应。收集的血清以1:20；1:60；1:180；1:540；1:1620；1:4860；1:14580；1:43740系列稀释入0.05％PBS-牛血清白蛋白中，并在室温下孵育2小时。将ELISA板离心和洗涤后(注意不要吸出细胞)，添加过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(稀释度1/1000)，并且孵育1小时和再次洗涤。然后，添加50微升TMB，在黑暗中孵育15分钟。添加10微升HCL后，在450nM处读取光密度。

结果示于图1中。

注释：

可以看出，在第二次注射后，收集到的血清中获得的多克隆抗体有效识别目标靶向肿瘤细胞。

实施例2：在同源和原位小鼠模型中体内使用收集的多克隆抗体

Hepa1.6肝细胞癌小鼠模型已在Gauttier et al.,Int J Cancer.2014Dec 15；135(12):2857-67中使用和描述。

该模型在免疫活性C57/BL6J小鼠中是同源和原位的。

将重悬于PBS中的2.5.10⁶个Hepa1.6细胞注入8周龄雄性小鼠的门静脉中，如果不处理，这导致肝性高血压并导致动物在12-15天内死亡。

4天后(D4)施用不同的治疗：

-第一组(组1；n＝7；对照)，接受：对照同种型(3G8：无关单克隆抗体(mAb)-同种型IgG1)(8mg/kg，每周2次，28天)+兔的免疫前多克隆抗体(20mg/kg，每周2次，28天)。

-第二组(组2；n＝8；对比)，接受：对照同种型(3G8：无关单克隆抗体(mAb)-同种型IgG1；8mg/kg，每周2次，28天)+从免疫兔血清中分离的多克隆抗Hepa 1.6细胞抗体(20mg/kg，每周2次，28天)。

-第三组(组3；n＝8)，接受：单克隆抗PDL-1抗体(8mg/kg，每周2次，28天)+从免疫兔血清中分离的多克隆抗Hepa 1.6细胞抗体(20mg/kg，每周2次，28天)。

-第四组(组4；n＝7；对比)，接受：单克隆抗PDL-1抗体(8mg/kg每周2次，28天)+兔的免疫前多克隆抗体(20mg/kg，每周2次，28天)。

所用的多克隆抗体对应于根据实施例1获得的IgG抗体，其使用本领域技术人员熟知的方法(包括蛋白A上的亲和柱)从兔血清中纯化。

在这些处理之后，在肿瘤细胞注射后的30天内观察不同组的临床评分。

获得的结果如图2所示。

从0-4的临床评分如下所示：

-临床评分1对应于动物出现刚毛和轻微肿胀的腹部；

-临床评分2对应于动物出现腹部肿胀和面部水肿；

-临床评分3对应于动物出现腹部肿胀和眼球突出；

-临床评分4分对应于动物出现腹部高度肿胀(直径>9厘米)、虚脱、驼背、孤立(导致个体处死)。

注释：

如所预期，在未处理的对照组1中，所有小鼠在注射细胞后的第15天死亡(如图3所示)。

观察到的结果对于组2和组4是相似的，对应于施用如上所述获得的纯化多克隆抗体或单克隆抗PDL1抗体。这两种单独的处理导致25天后临床评分降低至约3。

相反，在用本发明的组合的多克隆抗体和抗PDL1单克隆抗体处理的组3动物观察到协同作用，因为它们将0-1的临床评分保持直到第30天(实验结束)。

令人惊讶的是，在此实验后的几天内对组3小鼠的仔细观察没有观察到任何毒性，特别是任何自身免疫体征(即无痛苦、无体重减轻、无动物变色、无脱毛或腹泻)。

实施例3：本发明的多克隆抗体允许将冷肿瘤转化为热肿瘤

用小鼠B16F10黑色素瘤细胞免疫兔以获得相应的抗肿瘤多克隆抗体。

众所周知，B16F10黑色素瘤细胞系是“冷”肿瘤的很好的实例，因为例如对抗PDL1抗体具有耐药性，其中此类抗体对肿瘤消退的影响非常有限(Chen et al.,CancerImmunol res.2014；3(2):149-60；Ueha et al.,2015；3(6):631-40)。

从第4天(D4)到第30天(D30)每两周(12.5mg/kg，每周两次)将这些来自兔的针对B16F10细胞产生的多克隆抗体的IgG部分输注到皮下植入B16F10黑色素瘤细胞(D0)的Balb/C小鼠中(组2–n＝8)。

同样皮下植入B16F10黑色素瘤细胞的动物对照组(组1–n＝7)仅接受兔的免疫前多克隆抗体(20mg/kg，每周2次，28天)。

在注射细胞后30天(针对组2)或用于组1的所述注射后18天(因为来自该组的所有个体均已死亡)，抽取肿瘤活检并通过免疫组织学分析。

显示CD3+T细胞和LY6G+骨髓细胞，如图4所示。

在接受针对所述肿瘤的本发明多克隆抗体的动物的肿瘤中观察到显著更高的T细胞和骨髓细胞浸润。

因此，可以看出，本发明的多克隆抗体诱导CD3+T细胞和骨髓免疫细胞浸润到肿瘤床中。

因此，它将已知的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，从而使抗PD1/抗PDL1有效地发挥它们在防止肿瘤细胞使现在可以进入肿瘤的T细胞失活的作用，从而使免疫系统能够全力对抗肿瘤。