芦竹的种质保存方法
阅读说明：本技术 芦竹的种质保存方法 (Germ plasm preservation method of giant reed ) 是由 刘福鹏 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了芦竹的种质保存方法,该方法包括：1)采集芦竹的未成熟花序,依次进行去除花序的外层叶片、第一消毒处理,去除最内层心叶以及进行第二消毒处理；2)将处理后的花序接种到愈伤组织诱导培养基上,以便诱导出愈伤组织；3)将愈伤组织从花序上剪切下来接种到丛生芽分化培养基上进行培养分化出丛生芽；4)将丛生芽分株转接到丛生芽增殖培养基上,以便使得丛生芽增殖；5)选取丛生芽,分株转接到种质保存培养基上进行种质保存培养,每5-7个月继代培养一次；6)将待复壮种质转接到复壮培养基上,以便获得芦竹的复壮种质苗。因此,通过采用本发明上述实施例的芦竹种质离体保存方法能够有效延长芦竹种质保存时间和继代时间。(The invention provides a germplasm preservation method of arundo donax linn, which comprises the following steps: 1) collecting immature inflorescences of Arundo donax Linn, sequentially removing outer leaves of the inflorescences, performing first disinfection treatment, removing innermost heart leaves, and performing second disinfection treatment; 2) inoculating the treated inflorescence to a callus induction culture medium so as to induce callus; 3) shearing the callus from the inflorescence, inoculating the cut callus onto a cluster bud differentiation medium, and culturing and differentiating to obtain cluster buds; 4) transplanting the cluster buds to a cluster bud multiplication culture medium in a division manner so as to multiply the cluster buds; 5) selecting cluster buds, transplanting the cluster buds to a germ plasm preservation culture medium in a separated manner for germ plasm preservation culture, and subculturing once every 5-7 months; 6) transferring the germplasm to be rejuvenated to a rejuvenation culture medium so as to obtain the rejuvenated germplasm seedling of the arundo donax. Therefore, the in-vitro preservation method for the arundo donax linn germplasm can effectively prolong the preservation time and the subculture time of the arundo donax linn germplasm.)
技术领域
本发明属于农业科学
技术领域
，主要涉及芦竹的种质保存方法。背景技术
芦竹(Arundo donax L)是禾本科芦竹属多年生草本植物，高3-6米，直径1.5-3.5厘米，无性繁殖，种子不育，常规繁殖方法为分蘖繁殖，每株分蘖量最高可达360株。广泛分布于全国，是高产出、低投入的非粮生物质能源与环境修复植物。
随着全球不可再生能源的消耗和枯竭，全球平均气温持续升高，人类迫切需要寻找新的可再生能源。芦竹由于其生物量大、耐盐碱、固碳氮能力强等特点，越来越成为人类进行开发利用的生物质可再生能源。
由于芦竹为无性繁殖、体细胞染色体为不平衡的倍性水平、分布范围广泛等特点，导致芦竹的种质资源非常丰富。但在生产实践过程中，人们往往筛选利用高生物量、高观赏价值、高蛋白质含量的品种，导致其它隐性或未开发优良性状品种的丧失，对芦竹未来的新品种研发和利用造成一定困难。通过建立芦竹种质资源库可以对芦竹不同品种进行保存，对芦竹未来的品种开发和利用提供不可或缺的支持。
然而，当前可用于芦竹种质资源保存的方法主要有资源圃保存和离体保存。其中资源圃保存占地广、人力和物力消耗大、易受自然灾害影响，不能很好地保存种质资源。离体保存当前主要以组培快繁为主，该技术虽然在一定程度上保存了种质资源，但多次继代易导致种质资源的污染与混杂，还会导致种质遗传变异系数的增高。因此，建立芦竹长久的离体保存技术对芦竹种质资源保存工作具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的是克服芦竹种质资源的保存方面存在的缺陷或不足，提供了一种保存周期长、变异系数低的芦竹种质保存技术，解决了现有种质保存方法占地广、费用高、种质易丢失等问题，在一定程度上节约了种质保存成本，适合大量芦竹种质的保存。
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种芦竹的种质保存方法，根据本发明的实施例，该方法包括：
1)采集所述芦竹的未成熟花序，去除所述花序的外层叶片至保留最内层心叶后，对所述花序进行第一消毒处理，然后去除所述最内层心叶，对所述花序进行第二消毒处理；
2)将步骤1)中处理后的所述花序接种到愈伤组织诱导培养基上，并于25±2℃的温度下黑暗培养30-36d，以便诱导出愈伤组织；
3)将所述愈伤组织从所述花序上剪切下来接种到丛生芽分化培养基上，并于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照12h进行培养，每30天继代培养一次，2-3个月后分化出丛生芽；
4)将所述丛生芽分株转接到丛生芽增殖培养基上，并于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照8h，培养30-40d，以便使得所述丛生芽增殖；
5)选取步骤4)中的优质丛生芽，分株转接到种质保存培养基上，并于16-20℃、光照强度800-1200lx、每日光照12h的培养条件下进行种质保存培养，每5-7个月继代培养一次；
6)将步骤5)中的待复壮种质转接到复壮培养基上，并于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照12h的培养条件下进行复壮15-20d，以便获得所述芦竹的复壮种质苗。
本发明是首次建立的芦竹种质离体保存方法，该方法首先通过选择芦竹的未成熟花序作为种质保存外植体，可以简化外植体的消毒程序，同时降低污染率。其次，通过依次对消毒后的花序进行愈伤组织诱导、丛生芽分化、丛生芽增殖、种质保存以及种质复壮处理，可以获得优质种质。第三，发明人通过对上述步骤中的培养条件进行优化，可以有效地获得愈伤组织，并能进一步保证种质得到最优的分化、增殖、保存和复壮。因此，通过采用本发明上述实施例的芦竹种质离体保存方法能够有效延长芦竹种质保存时间和继代时间。另外，该方法与现有芦竹种质资源保存方法相比，可以有效解决现有保存方法占地广、费用高、种质易丢失等问题，而且可以从另一方面极大地节省了人力、财力以及物力消耗等。
另外，根据本发明上述实施例的芦竹的种质保存方法可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述第一消毒处理包括：首先用75％的酒精消毒1-2min，再用无菌蒸馏水冲洗2-3次；所述第二消毒处理包括：将所述花序放至0.1％的升汞溶液中消毒6-7min，再用无菌蒸馏水冲洗3-5次。该消毒程序简化且容易实施，并且不会对花序造成影响。
在本发明的一些实施例中，在步骤2)中，所述愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2.0-4.0mg/L 2.4-D+0.1-0.3mg/L KT，PH值为6.0。由此，采用该配方的愈伤组织诱导培养基可以进一步提高愈伤组织诱导率。
在本发明的一些实施例中，在步骤3)中，所述丛生芽分化培养基的配方为：MS+4.0-5.0mg/L 6-BA+0.4-0.5mg/L IBA，PH值为6.。由此，采用该配方的丛生芽分化培养基使得愈伤组织得到有效地分化。
在本发明的一些实施例中，在步骤4)中，所述丛生芽增殖培养的基配方为：MS+4.0-6.0mg/L 6-BA+0.4-0.6mg/L IBA，PH值为6.0。由此，采用该配方的丛生芽增殖培养基可以进一步提高增殖系数，并且进一步维持丛生芽的健康生长。
在本发明的一些实施例中，在步骤5)中，所述种质保存培养基配方为：1/3MS+2.0-4.0mg/L ABA+0.2-0.4mg/L NAA+25-28g/L甘露醇，PH值为6.0。由此，采用该配方的种质保存培养基可以有效地保证种质的生长和营养的供给。
在本发明的一些实施例中，在步骤5)中，当培养温度为16℃时，可继代培养5次；当培养温度为20℃时，可继代培养8次。
在本发明的一些实施例中，在步骤6)中，所述种质复壮培养基配方为：MS+3.0-5.0mg/L6-BA，PH值为6.0。
附图说明
：图1为对比例1愈伤组织诱导图；
图2为对比例2愈伤组织分化图；
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种芦竹的种质保存方法。下面详细描述本发明的实施例芦竹的种质保存方法。根据本发明的具体实施例，该方法主要包括：外植体的选择与消毒、愈伤组织诱导、丛生芽分化、丛生芽增殖、种质保存和种质复壮。
首先，步骤1)外植体的选择与消毒：采集所述芦竹的未成熟花序，去除所述花序的外层叶片至保留最内层心叶后，对所述花序进行第一消毒处理，然后去除所述最内层心叶，对所述花序进行第二消毒处理。由此，采用未成熟的花序作为种质保存外植体，仅通过两步消毒即可完成外植体的处理，进而显著减少了外植体的消毒程序和污染率。
另外，根据本发明具体实施例，上述对除去外层也叶片的花序进行第一消毒处理的步骤包括：首先用75％的酒精消毒1min，再用无菌蒸馏水冲洗2-3次；进行第二消毒处理的步骤包括：将所述花序放至0.1％的升汞溶液中消毒7min，再用无菌蒸馏水冲洗3-5次。因此，两步消毒显著简化了消毒程序，降低污染率，提高了消毒效率，并且简化后的消毒程序还可以减少对花序的影响。
其次，步骤2)愈伤组织诱导：将步骤1)中处理后的所述花序接种到愈伤组织诱导培养基上，并于25±2℃的温度下黑暗培养30-36d，以便诱导出愈伤组织。
根据本发明的具体实施例，在上述步骤2)中，进行愈伤组织诱导采用的愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2.0mg/L 2.4-D+0.1mg/L KT，PH值为6.0。该配方是发明人针对芦竹花序的进行多次优化获得的，该培养基对于芦竹花序愈伤组织诱导培养具有明显的适用性，可以进一步提高愈伤组织诱导率，同时降低感染率。具体地，愈伤组织诱导率最高可达90％。
表1不同浓度2,4-D对愈伤组织诱导的影响
2,4-D浓度(mg/L)
接种数
诱导数
诱导率
1.0
60
45
75％
2.0
60
54
90％
3.0
60
50
83％
另外，本发明采用的愈伤组织诱导培养基的配方仅由MS、2.4-D和KT三种成分组成，因此成分更加简单。另外，发明人发现，2.4-D和KT的浓度过高或者过低都会使得诱导率降低。当2.4-D浓度过低时，愈伤组织诱导率较低；当KT浓度过低时，诱导的愈伤组织较小；当2.4-D与KT浓度过高时，诱导的愈伤组织分化率低。
进一步地，步骤3)丛生芽分化：3)将所述愈伤组织从所述花序上剪切下来接种到丛生芽分化培养基上，并于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照12h进行培养，每30天继代培养一次，2-3个月后分化出丛生芽。由此，上述培养条件非常有利于愈伤组织的丛生芽分化，进而可以进一步提高丛生芽分化率。
根据本发明的具体实施例，在步骤3)中，所述丛生芽分化培养基的配方为：MS+4.0mg/L6-BA+0.4mg/L IBA，PH值为6.。由此，采用该配方的丛生芽分化培养基使得愈伤组织得到有效地分化。并且在上述培养条件以及培养基进行丛生芽分化可以使得丛生芽分化率得到显著提高，具体可以达到92％。
表2不同浓度6-BA、IBA对愈伤组织分化影响
6-BA浓度(mg/L)
IBA浓度(mg/L)
接种数
分化数
分化率
2.0
0.2
30
23
78％
4.0
0.4
30
27
92％
6.0
0.6
30
29
98％
另外，发明人发现，6-BA的浓度若过高，则会导致生根数量较少，若浓度过低则会导致分化数量减少；IBA的浓度若过高，则会导致芦竹分化时间过长，若浓度过低则会导致分化数量减少。
再进一步地，步骤4)丛生芽增殖：将所述丛生芽分株转接到丛生芽增殖培养基上，并于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照8h，培养30-40d，以便使得所述丛生芽增殖。由此，通过在上述优化后的培养条件下进行丛生芽增殖可以进一步提高增殖系数，保证增殖的稳定性。
根据本发明的具体实施例，在上述步骤4)中，采用的丛生芽增殖培养的基配方为：MS+6.0mg/L 6-BA+0.6mg/L IBA，PH值为6.0。由此，采用该配方的丛生芽增殖培养基可以进一步提高增殖系数，并且进一步维持丛生芽的稳定健康生长。该丛生芽增殖步骤与丛生芽分化步骤中采用了相同成分的培养基，并分别增加了6-BA和IBA的浓度，进而可以提高增殖系数。
再进一步地，步骤5)种质保存：选取步骤4)中的优质丛生芽，即增殖系数较高、长势较为一致的丛生芽，分株转接到种质保存培养基上，并于16-20℃、光照强度800-1200lx、每日光照12h的培养条件下进行种质保存培养，每5-7个月继代培养一次。具体地，增殖系数较高是指增殖系数高于平均系数的丛生芽；长势较为一致是指高度及叶片大小较整齐
根据本发明的具体实施例，在上述步骤5)中，采用的种质保存培养基配方为：1/3MS+2.0mg/L ABA+0.2mg/L NAA+25g/L甘露醇，PH值为6.0。由此，采用该配方的种质保存培养基可以有效地保证种质的健康成长和营养的供给。另外，在该培养基配方中，发明人采用1/3MS培养基，有效减少培养基营养成分，控制种质生长速度。
根据本发明的具体实施例，在上述步骤5)中，当培养温度为16℃时，可继代培养5次；当培养温度为20℃时，可继代培养8次。
最后，步骤6)种质复壮：将上述步骤5)中的待复壮种质转接到复壮培养基上，并于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照12h的培养条件下进行复壮15-20d，以便获得所述芦竹的复壮种质苗。
根据本发明的具体实施例，在上述步骤6)中，采用的种质复壮培养基配方为：MS+3.0mg/L 6-BA，PH值为6.0。另外，发明人发现，6-BA的浓度若过高，则会导致复壮苗下一步增殖系数较低，若浓度过低则会导致复壮时间过长。
本发明是首次建立的芦竹种质离体保存方法，该方法首先通过选择芦竹的未成熟花序作为种质保存外植体，可以简化外植体的消毒程序，同时降低污染率。其次，通过依次对消毒后的花序进行愈伤组织诱导、丛生芽分化、丛生芽增殖、种质保存以及种质复壮处理，可以获得优质种质。第三，发明人通过对上述步骤中的各培养基配方和培养条件进行优化，可以有效地获得愈伤组织，并能进一步保证种质得到最优的分化、增殖、保存和复壮。因此，通过采用本发明上述实施例的芦竹种质离体保存方法能够有效延长芦竹种质保存时间和继代时间。另外，该方法与现有芦竹种质资源保存方法相比，可以有效解决现有保存方法占地广、费用高、种质易丢失等问题，而且可以从另一方面极大地节省了人力、财力以及物力消耗等。另外，更重的是，采用本发明的上述实施例的芦竹种质离体保存方法
实施例1
一种芦竹种质保存方法，该种质保存方法的技术环节和详细步骤如下：
1)外植体的选择与消毒：采集芦竹原变种的未成熟花序，用自来水冲洗外部，去除外部包裹的叶片，只留包裹着花序的最里层心叶。将包裹着花序的心叶剪切成1-2cm长的小节，在超净工作台上用75％酒精消毒1min，再用无菌蒸馏水冲洗2-3次；去除心叶部分，放入0.1％的升汞溶液中消毒7min，再用无菌蒸馏水冲洗3-5次；
2)愈伤组织诱导:按照MS+2.0mg/L 2.4-D+0.1mg/L KT配制愈伤组织诱导培养基，调整PH值到6.0，高压灭菌后冷凝。将步骤1)中消毒后的花序接种到愈伤组织诱导培养基上，将其放置在25±2℃温度下黑暗培养30-36d后诱导出愈伤组织；
3)丛生芽分化：按照MS+4.0mg/L 6-BA+0.4mg/L IBA配制丛生芽分化培养基，调整PH值到6.0，高压灭菌后冷凝。将步骤2)诱导出的愈伤组织从花序上剪切下来，挑选结构紧密的白色细胞团，将其接种到丛生芽分化培养基上，置于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照12h进行培养，每30d对其进行继代培养一次，2-3个月后愈伤组织分化出丛生芽；
4)丛生芽增殖：按照MS+6.0mg/L 6-BA+0.6mg/L IBA配制丛生芽增殖培养基，调整PH值到6.0，高压灭菌后冷凝。挑选步骤3)中长势较好的丛生芽，剪去叶片，保留约2cm长左右的茎秆基部部分，将其转接到丛生芽增殖培养基上，每个培养基接种4-6株。置于25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照8h培养条件下进行增殖培养，培养30-40d；
5)种质保存：按照1/3MS+2.0mg/L ABA+0.2mg/L NAA+25g/L甘露醇配制种质保存培养基，调整PH值到6.0，高压灭菌后冷凝。选取步骤4)中增殖系数较高、长势较为一致的丛生芽，剪去叶片，保留约2-3cm长的茎秆基部，将其分株转接到种质保存培养基上，每个培养基接种10-12株。在16-20℃、光照强度800-1200lx、每日光照12h的培养条件下进行种质保存培养，每5-7个月继代培养一次。
6)种质复壮：按照MS+3.0mg/L 6-BA配制种质复壮培养基，调整PH值到6.0，高压灭菌后冷凝。将步骤5)中的待复壮种质转接到复壮培养基中，在25±2℃、光照强度2000-2200lx、每日光照12h的培养条件下进行复壮15-20d，获得复壮种质苗。获得的复壮种质苗可进行后续育种或组培快繁。
对比例1
操作步骤同实施例1，不同在于愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+6.0mg/L2.4-D+0.1mg/L KT，PH值为6.0。
结论：与实施例1相比，对比例1的愈伤组织诱导率仅为87，愈伤组织诱导图见图1所示。
对比例2
操作步骤同实施例1，不同在于丛生芽分化培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+0.4mg/LIBA，PH值为6.0。
结论：与实施例1相比，对比例2的愈伤组织分化数量减少。愈伤组织分化图见图2。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
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