具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备
阅读说明：本技术 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备 (Wheat germ protein polypeptide with alpha-glucosidase inhibitory activity and preparation thereof ) 是由 李洪岩 王静 刘维维 孙宝国 温洋洋 范浩然 路士熠 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备和应用,属于生物医药领域。本发明提供的一种生物活性多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性,具有降血糖作用,且其分子量小,稳定性高,在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。该生物活性多肽可用于制备糖尿病治疗和/或预防药物,或作为功能食品添加剂,供糖尿病患者长期治疗保健使用。且本发明所述的生物活性多肽来源于天然植物蛋白,具有稳定、安全、人体易吸收等特点,可进行大规模产业化生产。(The invention provides a wheat germ protein polypeptide with alpha-glucosidase inhibitory activity and preparation and application thereof, belonging to the field of biological medicine. The bioactive polypeptide provided by the invention has alpha-glucosidase inhibitory activity, has the function of reducing blood sugar, has small molecular weight and high stability, and has wide application prospects in the fields of medical treatment, health care, food and the like. The bioactive polypeptide can be used for preparing medicines for treating and/or preventing diabetes, or used as functional food additive for long-term treatment and health promotion of diabetes patients. The bioactive polypeptide is derived from natural plant protein, has the characteristics of stability, safety, easy absorption by human bodies and the like, and can be subjected to large-scale industrial production.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备和应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的慢性、多因素代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍，如足部溃疡、糖尿病视网膜病变、肾病、中风、心血管疾病、神经病变等等。糖尿病可分为1型或2型糖尿病，其中，1型或2型糖尿病均存在明显的遗传异质性。糖尿病存在家族发病倾向，1/4-1/2患者有糖尿病家族史，且临床上至少有60种以上的遗传综合征可伴有糖尿病。1型糖尿病中有多个DNA位点参与发病，其中以HLA抗原基因中DQ位点多态性关系最为密切。而在2型糖尿病中，已发现多种明确的基因突变，如胰岛素基因、胰岛素受体基因、葡萄糖激酶基因、线粒体基因等。近年来，糖尿病患病率迅速上升，且发病呈现低龄化趋势，其中由胰岛素抵抗/缺乏引起的II型糖尿病(T2D)为主要类型，占所有糖尿病发病率的90％以上，因此，开发新型预防/治疗糖尿病功能因子显得尤为迫切。
α-葡萄糖苷酶(GAA)作为一种重要的碳水化合物水解酶，在降低聚糖和二糖转化为葡萄糖的过程中起关键作用，产生的单糖可被小肠吸收，导致血糖水平升高。因此，GAA已被认为是T2D防治的主要靶标酶，而α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGI)在控制糖尿病患者餐后血糖水平和维持血糖正常方面发挥重要作用。AGI可延缓碳水化合物的消化，减少单糖的吸收。研究人员一直致力于从有机化合物和天然产物中筛选AGIs，如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等。但这些药物存在一些明显的副作用，如腹痛、腹胀、胀气加重、腹泻、抽筋等。且这些药物的需求量大，但来源稀少，价格昂贵。因此，从天然产物中筛选出副作用小的天然活性化合物作为AGI越来越受到重视，美国临床内分泌学家协会(AACE)和国际糖尿病联合会(IDF)已将天然AGI视为一线疗法。
专利CN103468774B公开了一种从紫菜酶解产物中分离α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，通过复配可控酶解成本低廉的末水条斑紫菜，得到α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品，经分离纯化后制备得到的α-葡萄糖苷酶的高抑制活性部分(LGI)分子量较小，稳定性好，成本低、应用安全，在医药和食品等领域有较广泛的应用前景。专利CN109721639A公开了一种生物活性多肽及其在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，所述生物活性多肽AGI-1由十个氨基酸残基组成，其中含有两个半胱氨酸，形成一对分子内二硫键，其可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，IC50值为1.54mM。
基于此，亟需提供一种新的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的小分子化合物，用于制备降血糖药物。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种生物活性多肽及其制备方法和应用。所述的活性多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖作用，且其分子量小，稳定性高，在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种生物活性多肽，所述的生物活性多肽包含如LDLQ*、#GGF*和/或LDNF*所示的氨基酸序列中的一种或多种，其中，*为碱性氨基酸K/R/H，#为A/M。
具体地，所述的生物活性多肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。
具体地，所述的生物活性多肽包含如SEQ ID NO:1-12所示的氨基酸序列中的一种或多种。
具体地，所述的生物活性多肽来自于小麦天然提取或人工合成。
另一方面，本发明提供了一种上述生物活性多肽的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)麦胚蛋白的提取：以麦胚粉为原料，采用碱溶酸沉法提取麦胚蛋白；
(2)麦胚蛋白定向酶解：采用生物信息学联合生物酶解技术得到虚拟定向酶解步骤(1)制备的麦胚蛋白的条件；
(3)具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的生物活性多肽制备：采用步骤(2)得到的虚拟酶解条件处理步骤(1)制备的麦胚蛋白，得到生物活性多肽；
(4)高活性生物活性多肽的筛选：采用液质联用对步骤(3)制备得到的生物活性多肽进行鉴定、筛选及分子对接，得到上述生物活性多肽。
具体地，步骤(1)中所述的麦胚粉为脱脂麦胚粉。
具体地，步骤(1)中所述的碱溶酸沉法提取步骤为：取脱脂麦胚粉按照料液比1:10的比例溶于蒸馏水中，1M NaOH调节pH至11.0，50℃搅拌浸提2h，4000rpm离心15min，取上清，1M HCl调pH至4.5，4000rpm离心15min，沉淀即为麦胚蛋白，冻干备用。
进一步具体地，步骤(1)麦胚蛋白的提取的作用是富集脱脂麦胚粉中的蛋白，去除其中多糖及多酚。
具体地，步骤(2)中所述的麦胚蛋白定向酶解的具体方法为：首先采用生物信息学方法对蛋白结构进行分析，在Biopep数据库“Enzymeaction”模块，进行计算机辅助酶解，将得到的多肽采用Maestro软件，以α-葡萄糖苷酶为靶点蛋白进行虚拟筛选，利用对接模板筛选出得分较高的前配体，对获得的多肽进行活性预测并打分，取打分位于前列的多肽虚拟酶解条件作为实际酶解条件。
具体地，步骤(3)中所述的生物活性多肽的具体制备方法为：按照虚拟酶解条件，将所得麦胚蛋白溶于pH8.0的缓冲溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，得到酶解液，酶解液经0.45μm滤膜过滤后再经不同截留分子量滤膜超滤分离纯化，得到不同分子量级分的生物活性多肽，收集不同级分并检测各级分抑制活性，得到高活性生物活性多肽级分。
进一步具体地，步骤(3)中生物活性多肽的分离纯化是以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标，利用超滤(10KDa，5KDa，3KDa，1KDa)对混合生物活性多肽组分进行分离纯化。
具体地，步骤(4)中所述的液质联用为LC-TOF-MS/MS。
又一方面，本发明提供了上述生物活性多肽在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
又一方面，本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述的α-葡萄糖苷酶抑制剂包含上述生物活性多肽。
又一方面，本发明提供了上述生物活性多肽在制备降血糖药物中的应用。
又一方面，本发明提供了一种降血糖药物，所述的降血糖药物包含上述生物活性多肽。
具体地，所述的降血糖药物还包括药学上可接受的载体，所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
具体地，所述的降血糖药物为外用制剂、口服制剂或注射制剂中的任意一种。
进一步具体地，所述的外用制剂为喷雾剂或气雾剂。
进一步具体地，所述的口服制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂或囊泡剂中的任意一种。
进一步具体地，所述的注射制剂采用皮内、皮下、肌内、局部或静脉内注射作为给药方式。
又一方面，本发明还提供了上述生物活性多肽在制备降血糖保健品中的应用。
又一方面，本发明还提供了一种降血糖保健品，所述的降血糖保健品包含上述生物活性多肽。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明提供了一种生物活性多肽，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖作用，且其分子量小，稳定性高，在医疗卫生、食品保健等领域具有广泛的应用前景。该生物活性多肽可用于制备糖尿病治疗和/或预防药物，或作为功能食品添加剂，供糖尿病患者长期治疗保健使用。
(2)本发明所述的生物活性多肽来源于天然植物蛋白，具有稳定、安全、人体易吸收等特点，其制备原料为小麦胚芽油加工副产物-脱脂麦胚粉，价格低廉且来源广泛，可进行大规模产业化生产。
附图说明
图1为粗麦胚肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线图。
图2为不同分子量级分麦胚肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性曲线图及IC50值检测结果图。
图3为麦胚肽(<1KDa)在大鼠肠内的降血糖效果评价图。
图4为阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图5为本发明高活性肽段LDLQK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图6为本发明高活性肽段LDLQR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图7为本发明高活性肽段LDLQH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图8为本发明高活性肽段AGGFK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图9为本发明高活性肽段AGGFR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图10为本发明高活性肽段AGGFH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图11为本发明高活性肽段MGGFK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图12为本发明高活性肽段MGGFR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图13为本发明高活性肽段MGGFH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图14为本发明高活性肽段LDNFK与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图15为本发明高活性肽段LDNFR与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
图16为本发明高活性肽段LDNFH与α-葡萄糖苷酶(2QMJ)结合位点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1.α-葡萄糖苷酶活性抑制多肽的制备
(1)麦胚蛋白提取：10g脱脂麦胚粉溶于100mL蒸馏水中，1M NaOH调节pH至11.0，50℃搅拌浸提2h，4000rpm离心15min，取上清，1M HCl调pH至4.5，4000rpm离心15min，沉淀即为麦胚蛋白，冻干备用。
(2)定向酶解制肽：采用生物信息学联合生物酶解技术定向酶解麦胚蛋白。首先采用生物信息学方法对蛋白结构进行分析，从UniProtKB蛋白质数据/NCBI基因库中下载麦胚蛋白氨基酸/基因序列，利用Biopep数据库中“Profiles of potential biologicalactivity”模块对氨基酸序列进行分析，评估其作为降血糖活性肽来源的潜力。在Biopep数据库“Enzymeaction”模块，单独或联合使用胃蛋白、胰蛋白酶、糜蛋白酶进行计算机辅助酶解，将得到的多肽采用 Maestro软件中的Glide模块进行虚拟筛选，利用Protein Preparation Wizard模块处理靶点蛋白(PDB ID:2QMJ，Resolution:)，去除结晶水，补加缺失的氢原子，并修复缺失键信息，修补缺失肽段，最后对蛋白进行能量最小化、以及几何结构的优化。利用OPLS3e力场对受体进行约束最小化，所有多肽分子均按LigPre模块的默认设置制备。在Glide模块中进行筛选时，导入制备好的受体，以在受体网格生成中指定合适的位置。首先将原配体进行再对接，确认对接方法的选择的可行性。然后进行对接数据集的筛选。最后，利用对接模板筛选出得分较高的肽段，对获得的肽段进行活性预测并打分，取打分位于前列的肽段酶解条件作为实际酶解条件。
(3)麦胚蛋白酶解：参考上述步骤(2)虚拟酶解得到的酶解条件，10％NaOH调节0.8％麦胚蛋白溶液至pH8.0，蛋白充分溶解后沸水浴中煮沸10min，80W超声30min，冷却至37℃后加入蛋白质量1％的胰蛋白酶酶解1.5h，期间保持温度恒定，1M NaOH维持pH在8.0。酶解结束后，煮沸10min灭酶，得到酶解液。
(4)α-葡萄糖苷酶活性抑制多肽的分离纯化：所得酶解液首先经0.45μm滤膜过滤，将滤液依次经过10KDa、5KDa、3KDa、1KDa超滤膜，收集滤出液得到>10KDa、5-10KDa、3-5KDa、1-3KDa、<1KDa共5个不同分子量范围的肽级分，检测不同级分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
(5)α-葡萄糖苷酶活性抑制肽的结构鉴定：液质联用对高活性麦胚肽组分进行鉴定，并对所得肽段再次进行虚拟筛选及分子对接，得到高活性肽段为LDLQ*/#GGF*/LDNF*，其中，*为碱性氨基酸K/R/H，#为A/M。
实施例2.生物活性多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性检测
检测方法：在96孔酶标板孔中依次加入50μL 0.1mol/L PBS(0.01M,pH6.8)、50μL0.5U/mLα-葡萄糖苷酶以及50μL多肽溶液(用PBS配制不同浓度的多肽溶液)，混匀后于37℃恒温反应15min后加入100μL 1.5mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，混匀后于酶标仪内37℃孵育15min后检测其在405nm波长下的吸光度值，重复实验3次，取平均值。
酶活性抑制率的公式：I％＝[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100％；式中：A1为样液组的吸光度值，A2为以PBS代替酶溶液测得的样液组背景吸光度值，A3为以PBS溶液代替样液测得的空白对照组吸光度值，A4为以PBS溶液代替样液与以PBS溶液代替酶溶液测得的空白对照组背景吸光度值。
不同组分的多肽组分冷冻干燥的冻干粉，配制不同浓度溶液后检测α-葡萄糖苷酶抑制活性，检测结果如图1和图2所示。结果显示：粗麦胚肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50为6.874mg/mL，将粗肽按照分子量大小进行分级后，发现分子量<1KDa的麦胚肽组分活性最高，IC50值为2.097mg/mL，高活性多肽级分得到有效富集。
实施例3.大鼠肠囊翻转实验
雄性SD大鼠实验前禁食过夜，取空肠部分，生理盐水冲洗除去内容物，切成3cm长片段，采用灌胃针将空肠片段翻转，刷状缘毛朝外，两端打结封口，放入5mL含5M蔗糖，37℃的Ringer’s溶液中，加入或不加上述实施例1制备的生物活性多肽，孵育90min，每隔15min检测溶液中葡萄糖含量，计算葡萄糖生成速率，评价生物活性多肽的降血糖效果。图3结果表明，与不加生物活性多肽相比，1mg/mL的麦胚肽(<1KDa)即可显著降低葡萄糖生成速率，发挥优异降血糖效果。
实施例4.分子对接分析
α-葡萄糖苷酶(2QMJ)蛋白的晶体结构精度高，无关键残基缺失，通过原配体进行多次测试，确定了原配体与活性位点的结合模式(图4)。活性位点残基ASP-203，ARG-526，THR-205，ASP-542，HIS-600，ASP-327等在稳定配体发挥着重要的作用(图4)。这些活性位点氨基酸与原配体能够形成多个氢键，对稳定在蛋白口袋中的小分子有着较大的贡献。为了确定合适的对接方案用于筛选潜在的活性多肽分子，将对接后的原配体再次对接到2QMJ结合位点上，结合位置与先前的复合物中一致，表明该筛选方法的有效性，后期抑制剂的筛选均在此方法下进行。
麦胚多肽高活性组分鉴定所得肽段以同一方法将其与2QMJ进行对接(详见图5-图16)，发现其与α-葡萄糖苷酶活性中心的ASP-327，ARG-526，GLN-603，ASP-203，ASP-542等基团形成的较强的氢键相互作用，平均距离为远小于传统氢键的这些氢键的存在对稳定蛋白活性位点中的多肽小分子有着重要意义。因此，本申请所述的多肽与2QMJ蛋白匹配较好，结合能力强，而且所述多肽分子相互作用模式与阿卡波糖接近，说明所述多肽分子是一个潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的麦胚蛋白多肽及其制备
<130> 20210826
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Leu Asp Leu Gln Lys
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
Leu Asp Leu Gln Arg
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
Leu Asp Leu Gln His
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
Ala Gly Gly Phe Lys
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Ala Gly Gly Phe Arg
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Ala Gly Gly Phe His
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Met Gly Gly Phe Lys
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Met Gly Gly Phe Arg
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Met Gly Gly Phe His
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
Leu Asp Asn Phe Lys
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<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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Leu Asp Asn Phe Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
Leu Asp Asn Phe His
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