治疗t细胞急性淋巴细胞白血病的药物组合物
阅读说明：本技术 治疗t细胞急性淋巴细胞白血病的药物组合物 (Pharmaceutical composition for treating T cell acute lymphocytic leukemia ) 是由 祝海川 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了治疗T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的药物组合物,所述组合物中包括抑制WTAP表达的活性成分和抑制JMJD6表达的活性成分。本发明的药物组合物通过同时抑制WTAP和JMJD6的表达,能够协同的抑制T-ALL细胞的增殖。(The invention discloses a pharmaceutical composition for treating T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), which comprises an active ingredient for inhibiting WTAP expression and an active ingredient for inhibiting JMJD6 expression. The pharmaceutical composition can synergistically inhibit the proliferation of T-ALL cells by simultaneously inhibiting the expression of WTAP and JMJD 6.)
技术领域
本发明涉及生物医药相关
技术领域
，特别涉及一种治疗T细胞急性淋巴细胞白血病的药物组合物及其应用。背景技术
急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种淋巴前体细胞在其分化的不成熟阶段受阻导致恶性增殖而形成的血液肿瘤。ALL可以发生在淋巴细胞的T细胞或b细胞前体中，因此分为T-ALL或B-ALL。其中T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)占儿童病例的10％-15％，成人中占有25％，临床特点及预后的异质性较大,使得其治疗效果远不如B淋巴细胞白血病(B-ALL)，并且目前针对T-ALL的选择治疗是十分有限的。
T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种侵袭性恶性肿瘤，主要影响儿童和青少年。多药化疗和骨髓细胞移植仍是临床中治疗T-ALL的主要方法。强化化疗方案都有着较大的毒性，患者一旦无反应或复发，预后则很差。在青少年和青年(adolescent and youngadult，AYA)患者中的生存率仍然较低，5年总生存率只有20％，且只有7％的复发患者存活。顽固性复发和减弱治疗毒性依然是提高AYA患者生存率的关键挑战，改善这种治疗阻滞急需发掘新的诊疗靶点，为生物医疗研究提供新的思路。
表观遗传学异常在恶性血液病特别是急性白血病的发病机制中起着重要的作用。与DNA甲基化和组蛋白修饰相似，RNA甲基化是另一种重要的表观遗传修饰。其中m6A(N6-methyladenosine,m6A)甲基化是最普遍和研究最广泛的RNA甲基化之一。广泛分布于mRNA和长链非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)中。m6A RNA甲基化,即RNA分子腺嘌呤第6位N发生甲基化修饰，是一种动态可逆的修饰方式。在转录后调控中发挥重要作用,影响mRNA的稳定性,翻译效率,可变剪接、加工成熟以及RNA的转运和衰变等。
m6A甲基转移酶复合物的关键组分Wilms’肿瘤蛋白1相关蛋白(Wilms’tumor 1-associating protein，WTAP)在催化m6A形成的过程中，METTLl4与METTL3形成异二聚，被WTAP招募并结合到mRNA上体发挥催化作用，调控m6A修饰水平的动态变化。WTAP是一种核蛋白，定位于整个核质中，并部分与剪接因子共定位。WTAP在m6A甲基化过程中发挥着招募底物RNA到酶促复合体中的功能。已有研究证明在急性髓系白血病(Acute myelocyticleukemia,AML)中WTAP表达增加，促进癌细胞增殖，而且诱导分化阻滞,WTAP是急性髓系白血病中一种新的致癌蛋白。WTAP的表达情况与多种增殖相关蛋白，抗凋亡蛋白，癌蛋白等表达情况相关，如Cyclins，Hsp90，Bcl-2，Bax，FLll，Myc和Ash2L。
多年来的研究显示表观遗传学异常在恶性血液病特别是急性白血病的发病机制中起着重要的作用，其中METTL-3、METTL-14、FTO、WTAP四种m6A甲基化的关键基因表达升高促进白血病的发生、发展。
JMJD6蛋白是亚铁离子(Fe2+)和2-氧戊二酸(2OG)依赖的双加氧酶家族成员，含有Jmjc结构域，可以催化蛋白质和核酸底物上的羟基化和去甲基化反应，是第一个被描述具有精氨酸去甲基化功能的酶。已有研究表明，JMJD6在不同的分子通路上可与多种蛋白质底物相互作用，发现JMJD6可以与其相互作用的溴结构域蛋白BRD4通过与基因组特定增强子结合，远程调控转录复合物P-TEFb蛋白复合体的活性，进而调控邻近编码基因转录延伸(transcription elongation)的转录调控新颖模式。JMJD6在RNA剪接调控中的也发挥着特殊作用，可以改变部分内源性基因和报告基因的选择性RNA剪接。JMJD6在基因可变剪接中发挥着至关重要的作用，与基因转录调控、可变剪切相关，Jmjd6参与多种生物学功能，与基因转录调控、可变剪切相关。
目前，针对WTAP和JMJD6的研究主要集中在对AML及其他实体肿瘤的功能，而这两种因子相互作用在T-ALL里的功能机制研究很少。T-ALL是一种发展迅速且具有侵袭性血液恶性疾病，有着极大的异质性和预后差、易复发的临床特点，在临床的有效诊疗手段十分受限。目前在血液病中针对T-ALL的可行性研究靶点还十分匮乏，WTAP和JMJD6在多种分子通路上发挥着生物学功能，且其基因的表达变化对T-ALL有着明显的影响，可显著的抑制T-ALL细胞的增殖，可作为T-ALL新的研究靶点,为现阶段的医药学研究提供新的方向。本发明正是基于这一发现得以完成。
发明内容
针对现有技术存在的治疗T细胞急性淋巴细胞白血病的药物的技术问题，本发明提供一种新的用于治疗T细胞急性淋巴细胞白血病的药物组合物及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明涉及一种治疗T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的药物组合物，所述组合物中包括抑制WTAP表达的活性成分和抑制JMJD6表达的活性成分。本发明的药物组合物通过同时抑制WTAP和JMJD6的表达，能够协同的抑制T-ALL细胞的增殖。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抑制WTAP表达的活性成分包括敲除WTAP基因的siRNA或突变WTAP基因的siRNA。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抑制JMJD6表达的活性成分包括敲除JMJD6基因的siRNA或突变JMJD6基因的siRNA。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抑制WTAP表达的活性成分还包括转染载体。
在本发明的一个优选实施方式中，所述抑制JMJD6表达的活性成分还包括转染载体。
本发明另一方面还涉及上述药物组合物在制备治疗T细胞急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物组合物用于抑制T-ALL癌细胞增殖。
有益效果
本发明首次发现WTAP与JMJD6可以作为治疗T-ALL的靶点，并且两者之间具有协同作用。本发明的药物组合物对于提高治疗T-ALL的效果提供了新的方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为表示在4种T-ALL细胞系分别为MOLT-4、JURKAT、KE-37、MOLT-3细胞中利用siRNA单敲降WTAP、METTL3、METTL14、FTO后，分别于36小时、60小时进行细胞计数，结果如图所示，与NC对照组相比，siRNA敲降组明显抑制了T急淋细胞的增殖，而WTAP表达降低对细胞增殖的抑制效果远强于METTL3/METTL14/FTO的图。
图2为表示siWTAP分别转染KE-37和MOLT-4细胞，48h提蛋白，如图点样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，在内参基因均一的前提下，siWTAP敲降组与NC对照组相比,WTAP的蛋白表达明显降低，c-Myc蛋白表达也随之降低，说明Myc的表达受WTAP的影响的图。
图3为表示质谱匹配度分析显示，WTAP与METTL3和METTL14有着较强的结合，其中JMJD6显示出更强的结合度的图。
图4为表示MOLT16细胞裂解液进行COIP实验,结果如图，INPUT组作为阳性对照，证明两组细胞中均有WTAP/JMJD6表达，IP组中，IgG作为阴性对照，排除了WTAP一抗的非特异性结合，综上，WTAP共沉淀的复合物中，检测到了JMJD6,说明WTAP与JMJD6存在相互作用的图。
图5为表示sh1-JMJD6、sh2-JMJD6作为2个敲降重复组，于48h、72h计数结果，与sh-Control(sh-C)对照组相比，JMJD6基因表达水平降低显著抑制了JURKAT细胞的增殖，纵轴表示每毫升细胞数的图。
图6为表示sh1-JMJD6/sh2-JMJD6慢病毒颗粒侵染JURKAT细胞，24h提RNA，进行RT-qPCR定量检测，2^-△△Ct法分析结果，与敲降组sh-C相比,敲降组JMJD6基因表达量显著减低的图，其中，Pvalue,*<0.05。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1:基因敲除对于T-ALL细胞增值的影响
1.siRNA的获取：WTAP、METTL3、METTL14、FTO的siRNA(5nmol)，各2对及阴性对照，由锐博生物公司设计合成；
需要说明的是，shRNA，即小发卡或短发卡RNA(asmall hairpin RNA or shorthairpin RNA,shRNA)是一段具有紧密发卡环(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。
siRNA，即小或短干扰RNA(small/short interfering RNA,siRNA)是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子，其主要在RNAi通路中起作用，干扰特异基因的表达。也就是说shRNA和siRNA的作用都是RNA干扰，从而影响基因的表达，shRNA最终也是形成siRNA发挥作用，只是不同的形式。
2.T-ALL细胞培养：所述的所有T-ALL细胞，均由10％的胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次。
3.接种细胞：JURKAT细胞以1×105/孔的密度接种于有适量(500ul-1000ul)完全培养基的24孔板中,，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h；
4.siRNA转染:使用LipofectamineTM3000转染试剂(赛默飞，L3000015)转染T-ALL细胞，将细胞接种于24孔板中，使其转染时细胞数量密度约20％，使用前混匀转染试剂，取1ul转染试剂与11.5ul无RNA酶的水混合至12.5ul。将siRNA稀释至20pmol，取稀释的siRNA12.5ul与12.5ul转染试剂混合，室温孵育5分钟，在每孔细胞中加入25ul转染混合液，轻轻摇匀，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养38h，于38h开始重悬均匀T-ALL悬浮细胞，取10uL于200uLPCR管中，1:1加入10uL的台盼蓝混合均匀，取10uL混合液，用于细胞计数板计数，开始细胞计数，按照公式：细胞数(个/ML)＝(四个大格的总数/4)*10000*稀释倍数,计上不计下,计左不计右，60h重复第三次计数。
实验结果如图1所示，图1中四张图分别是4种T-ALL细胞在转染siRNA后36h和60h的细胞数，横坐标为时间，纵坐标为对应的细胞数量，图例表示5个分组，分别表示转染了5种不同的siRNA，其中NC为对照组，如图，折线斜率表示细胞增殖率，其中WTAP的敲降组，细胞增长趋势显著低于其他4组，说明敲除WTAP对T-ALL细胞增殖的抑制效果最好。
采用同样的方法，sh敲降质粒转染JURKAT细胞，每组做4个平行，于转染后24h取每组的任意平行组细胞提RNA，由RT-qPCR进行基因定量分析，确定sh1-JMJD6/sh2-JMJD6组细胞的JMJD6基因表达明显降低后，于48h和72h进行细胞计数，确定敲降JMJD6基因的表达，会显著抑制JURKAT细胞的增殖，实验结果如图5所示。图5的实验结果显示，sh1-JMJD6、sh2-JMJD6作为2个敲降重复组，于48h、72h计数结果，与sh-Control(sh-C)对照组相比，JMJD6基因表达水平降低显著抑制了JURKAT细胞的增殖。纵轴表示每毫升细胞数。JURKAT细胞，每组做4个平行，于转染后24h取每组的任意平行组细胞提RNA，由RT-qPCR进行基因定量分析，确定sh1-JMJD6/sh2-JMJD6组细胞的JMJD6基因表达明显降低后，于48h和72h进行细胞计数，确定敲降JMJD6基因的表达，会显著抑制JURKAT细胞的增殖。
实施例2：
总RNA提取：总RNA提取均按照翊圣总RNA提取试剂盒说明书操作(MolPure Cell/Tissue Total RNA Kit，Yeasen)如下：
(1)样本预处理：离心收集细胞沉淀，每5×106-1×107个细胞加入1mL裂解液LB，用移液器反复吹打。
(2)总RNA提取：
将RNA吸附柱A1套入2mL收集管中，备用。
将上述预处理混合液(及沉淀)加入到RNA吸附柱A1中，12,000rpm离心1min，弃过滤液。
加入500μL去蛋白液PL，12,000rpm离心45sec，弃过滤液。
将RNA吸附柱A1放回收集管，加入500μL漂洗液W*，12,000rpm室温离心45sec，弃过滤液。重复一遍步骤4。
将RNA吸附柱A1放回收集管，空柱12,000rpm室温离心2min，以除去残留的漂洗液W*。
将RNA吸附柱A1放入新的1.5mL RNase-free离心管中，在RNA吸附柱A1中央加入30-80μL RNase-free H2O，室温放置2min。然后12,000rpm离心1min。收集滤液，即为RNA溶液
(3)逆转录：残留基因组DNA去除：在RNase free离心管中配制如下混合液，轻缓混匀，42℃孵育2min。
(4)逆转录反应体系配制：直接于第一步的反应管中加入4×Hifair IIISuperMixplus,混匀，置于伯乐PCR仪中，按如下程序，进行逆转录PCR。
qPCR检验目的基因mRNA的表达：
(5)设计WTAP/Myc/DAPDH/JMJD6的扩增引物，由上海生工合成。有效引物序列如下：
JMJD6-F:ctgaattcaaacccctggaa
JMJD6-R:taccgtcttgtgccatacca
WTAP-F:gcgactagcaaccaaggaac
WTAP-R:cattttgggcttgttccagt
GAPDH-F:gtcagtggtggacctgacct
GAPDH-R:tgctgtagccaaattcgttg
配制20ul的反应体系：
(6)PCR程序：95℃3min,(95℃10s,58℃10s,60℃20s)40个循环，以SYBR Green作为荧光标记物，在伯乐荧光实时定量PCR仪上进行RT-qPCR反应，prism软件进行数据分析整理，结果如图6所示。
实施例3：CO-IP实验验证目的蛋白WTAP和JMJD6的互作关系
(1)相关试剂配制及相关抗体：
Sucrose-NP40 Lysis buffer:
使用前添加:10mM NaF、1mM NaVO3、1mM DTT、1mM PMSF、蛋白酶抑制剂
Wash buffer:
使用前添加：1mMDTT、0.2mMPMSF
细胞:293T每组两瓶细胞(细胞数为107/ml,每瓶为10ml细胞悬液)
抗体：RabbitIgG(三鹰，B900610)
Anti-WTAP antibody(abcam,ab195380)
Anti-c-Myc antibody(abcam,ab32072)
VeriBlot for IP Detection试剂(HRP)(abcam,ab131366)
JMJD6 Rabbit polyclonal antibody(16476-1-AP)
GAPDH(Human Specific)Rabbit mAb(ABclonal,AC036)
HRP Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(ABclonal,AS014)
(2)实验步骤
细胞长到一定密度(107/ml)后1000rmp收细胞，15mlPBS重悬，1200rmp离心，去上清
每组添加1mlSucrose-NP40裂解液，冰上裂解30min
4℃、12000rmp离心,上清各取40ul作为Input组，备存与-20℃。其余上清均加入2ugIP一抗(Anti-WTAP antibody)与40ul protein A琼脂糖珠(碧云天，p2051-10ml)混合液中
4℃混匀4h
预冷的wash buffer洗4次
沉淀中加入40ul 1×蛋白上样缓冲液，95℃变性10min
Western blot观察目的条带，结果如图4所示。
Western blot验证蛋白表达
蛋白提取:300g离心收集悬浮细胞，加入5mlPBS重悬洗涤细胞一次，300g离心去上清，加入1ml细胞裂解液(强)和10ul蛋白酶抑制剂PMSF的混合液，于冰上裂解30min，每10min涡旋震荡一次，12000g离心15min，取上清。按照Themo BCA蛋白定量试剂盒说明书绘制标准曲线，酶标仪检测吸光度，测定蛋白浓度。
SDS-PAGE凝胶电泳：
配制12％的蛋白胶，每孔上样量为15ug，以70V恒压跑30min,120v正式跑胶90min，
转膜、封闭:将用甲醇活化的PVDF膜和跑好的蛋白胶，按照正负极方向平铺于转膜夹板上，金斯瑞的半干转转膜仪，转膜15min,TBST配制5％的封闭液，室温摇床轻摇2h。
孵一抗：根据抗体说明的比例，用封闭液稀释一抗，4℃摇床孵育过夜。
二抗孵育：TBST室温摇床用TBST洗三次，按二抗稀释比例TBST稀释二抗，室温摇床孵育1h
TBST洗三遍，配制ECL发光液，显影。图2为siWTAP分别转染KE-37和MOLT4细胞，48h提蛋白，点样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，在内参基因均一的前提下，siWTAP敲降组与NC对照组相比,WTAP的蛋白表达明显降低，c-Myc蛋白表达也随之降低，说明Myc的表达受WTAP的影响
从KE-37细胞裂解液中进行免疫共沉淀实验，上清液与Protein A琼脂糖珠(碧云天,p2051-10ml)和IP一抗Anti-WTAP antibody(ab195380)共孵育4小时，洗脱共沉淀所得的IP样品并通过SCIEX质谱仪上机检测分析，所得质谱结果分析数据部分整理如图4所示。Score即肽段的得分,分值越高说明肽段二级图谱的匹配程度越好，可信度越高。图4结果显示、MOLT16细胞裂解液进行COIP实验,结果如图，INPUT组作为阳性对照，证明两组细胞中均有WTAP/JMJD6表达，IP组中，IgG作为阴性对照，排除了WTAP一抗的非特异性结合。综上，WTAP共沉淀的复合物中，检测到了JMJD6,说明WTAP与JMJD6存在相互作用。
图3质谱分析法(Mass Spectrometry,MS)，其是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量,以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。化合物分子受到电子流冲击后,形成的带正电荷分子离子及碎片离子,按照其质量m和电荷2的比值m/z(质荷比)大小依次排列而被记录下来的图谱,称为质谱。图3的质谱匹配度分析显示，WTAP与METTL3和METTL14有着较强的结合，其中JMJD6显示出更强的结合度。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，在没有做出创造性劳动前提下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> 治疗T细胞急性淋巴细胞白血病的药物组合物
<130> CP210303
<141> 2021-06-30
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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aagctttgga gggcaagtac a 21
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ctgcaagtat gttcactatg a 21
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