阅读说明：本技术 对btn2具有特异性的抗体及其用途 (Antibodies specific for BTN2 and uses thereof ) 是由 E·富歇 C·卡诺 K·S·勒 C·帕赛罗 D·奥利芙 于 2020-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及对BTN2A具有特异性的抗体及其特别是用于治疗癌症的用途。(The present invention relates to antibodies specific for BTN2A and their use, in particular, for the treatment of cancer.)

具体实施方式

材料和方法

细胞培养、单核细胞和NK细胞分选：

外周血单核细胞(PBMC)来自EDTA(乙二胺-四乙酸)-当地血库(Etablissementdu Sang(EFS)-Marseille-France)提供的健康供体(HD)的血沉棕黄层，并在密度梯度上(Eurobio)通过离心分离。将新鲜的PBMC在37℃、5％CO₂下在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI；Lonza)中培养。

按照制造商的说明，使用EasySep^TM人NK细胞富集试剂盒(StemCellTechnologies)通过负选择从新鲜PBMC中分选自然杀伤(NK)细胞。按照制造商的说明，使用CD14+微珠试剂盒(Miltenyi)分选人CD14+单核细胞。在37℃下将单核细胞以10⁶个细胞/mL的密度在补充有1％L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、0.1mM非必需氨基酸和10％FBS(均来自Thermofisher)的RPMI中培养5天。进胰腺癌细胞系PANC-1在补充有10％FBS的RPMI中培养。一旦生长至90％汇合，弃去培养基，并将细胞在PBS 1X中冲洗两次。然后，将PANC-1细胞在补充有5％FBS的RPMI中再培养24小时(每175cm²烧瓶30mL，以获得浓缩的上清液)。然后，收集PANC-1条件培养基，过滤(0.2μM)并储存在-20℃直至使用。其他人细胞系及其相应的培养基总结于下表1中：

表1

以下人细胞系来自美国典型培养物保藏中心：Daudi(伯基特淋巴瘤)、Jurkat(急性T细胞白血病)、MDA-MB-134(乳腺导管癌)和HEK-293T(胚胎肾)。人胰腺癌细胞系L-IPC(PDAC087T)由Juan IOVANNA博士友情提供。将Daudi和Jurkat细胞以及PBMC在补充有10％胎牛血清(FCS)、1％丙酮酸钠、1％L-谷氨酰胺(均来自Life Technologies)的RPMI 1640培养基中培养。HEK-293T BTN2 KO细胞通过CRISPR-Cas9介导的BTN2所有亚型失活产生(数据未显示)。将MDA-MB-134、L-IPC、HEK-293细胞和HEK-293T BTN2 KO细胞在含有10％FCS的DMEM培养基(Life Technologies)中培养。将杂交瘤在DMEM/Ham's F12(1:1)(ThermoFisher Scientific)、4％FetalClone I(Hyclone)、化学定义脂质浓缩物(1:250)、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸钠和100μg/mL PenStrep(全部来自ThermoFisher Scientific)中培养。为了收集杂交瘤上清液，在没有Fetalclone的情况下培养杂交瘤4-5天。

为了评估抗BTN2A1 mAb的特异性，按照制造商的说明，使用Lipofectamine 3000试剂(Thermofisher Scientific)，用编码BTN2A1和BTN2A2 CFP(Nter)-融合蛋白的pcDNA3-Zeo-BTN2A1-CFP质粒独立转染HEK-293T BTN2 KO细胞。

参考抗BTN2A1 mAb 107G3的鉴定

通过用重组人BTN2A1-Fc融合蛋白免疫48只带有6种不同MHC组合的小鼠而产生小鼠抗人BTN2A1抗体。21天后将小鼠放血，并通过Luminex测定确定BTN2A1特异性多克隆抗体的血清滴度。将显示最高BTN2A1特异性抗体滴度的小鼠安乐死。通过阳性选择分离脾B细胞，并进行PEG诱导的骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。

通过有限稀释克隆杂交瘤，并且杂交瘤上清液针对靶特异性及其诱导Vγ9Vδ2-T细胞脱粒的能力进行两轮筛选(图1c和2)，并鉴定出参考mAb 107G3。对这些亚克隆的VH和VL区进行测序(见表1)。

Vγ9Vδ2-T细胞的扩增

通过从第0天开始在唑来膦酸盐(Sigma，1μM)和重组人(rh)IL-2(Proleukin，200IU/mL)存在下培养来自HV的PBMC建立效应Vγ9/Vδ2-T细胞。从第5天开始，rhIL-2每隔一天更新一次，并且将细胞密度保持在1.15x 10⁶个/mL，总共15天。最后一天，通过流式细胞术评估Vγ9/Vδ2-T细胞的纯度。仅选择达到Vγ9/Vδ2-T细胞纯度高于80％的细胞培养物用于功能测试。冷冻纯化的Vγ9/Vδ2-T细胞直至使用。

Luminex测定

根据制造商的说明，将磁性COOH珠(Biorad)与rhBTN2A1蛋白(R&D)缀合，并将珠储存在-20℃的储存缓冲液(Biorad)中直至使用。为了滴定小鼠血清，在Luminex测定缓冲液(Nanotools)中从1:50开始，通过1:4的稀释步骤进行系列血清稀释；将100μL珠悬浮液与100μL血清稀释液混合并在室温下孵育1小时，然后将珠在洗涤缓冲液中洗涤3次，在Luminex测定缓冲液中与1μg/mL生物素化山羊抗小鼠IgG-Fc一起孵育，和在Luminex测定缓冲液中再洗涤3次。最后，将珠在Luminex测定缓冲液中与1μg/mL链霉亲和素PE一起孵育1小时，然后在Luminex读取缓冲液(Nanotools)中最后洗涤3次。将珠重悬于Luminex读取缓冲液中，并在Luminex 100/200系统上采集数据。对于命中鉴定，将30μL上清液转移到96孔板中，并添加90μL Luminex测定缓冲液。将100微升珠悬浮液与100μL上清液稀释液混合，并在室温下孵育16小时，然后继续进行上述方案。对于命中识别，选择对靶标具有最高亲和力和对不相关对照蛋白(Rank-Fc)具有最低亲和力的那些。对于亲和力/Kd计算，将杂交瘤上清液在Luminex测定缓冲液中从40.000pM开始，通过1:4的稀释步骤进行连续稀释，并如上所述进行分析。Kd对应于相应结合曲线的中点。

流式细胞术

在使用FlowJo 10.5.3软件(FlowJo)在BD LSRFortessa(BD Biosciences)、CytoFlex LX或CytoFlex S(Beckman Coulter)上分析之前，将PBMC、纯化的Vγ9Vδ2-T细胞-T细胞或细胞系与指定的mAb一起孵育。用于Vγ9Vδ2-T细胞脱粒测定的抗体是：抗CD107a-FITC(BD Biosciences)、抗CD107b-FITC(BD Biosciences)、抗CD3-PeVio700(Miltenyi)、抗PanTγδ-PE(Miltenyi)、活/死Near IR(Thermofisher)。在FcR Block试剂(Miltenyi)、山羊抗小鼠PE 1:100(Jackson Immunoresearch)和活/死Near IR(Thermofisher)存在下，使用10μg/mL纯化mAb进行所有免疫染色。先前公开了小鼠抗人CD277(也称为BTN3A；具有IgG2a同种型的克隆103.2)(WO2012/080351)。为了评估抗BTN2A1mAb的特异性，转染后24小时，收集HEK-293T BTN2 KO细胞(5x10⁴个/样品)并如上所述用指定浓度(5ng/mL-75μg/mL)的抗人BTN2A1 107G3染色mAb。小鼠IgG1抗体(Miltenyi)用作染色的同种型对照。

Vγ9/Vδ2-T细胞的功能测定

将来自HV的纯化Vγ9/Vδ2-T细胞在rhIL-2(200UI/mL)中培养过夜。然后，将Vγ9/Vδ2-T细胞在37℃下与指定的靶细胞系(效应物:靶标(E:T)比为1:1)共培养，在有或没有以下mAb的情况下(50μL杂交瘤上清液或10μg/ml纯化的mAb，如所指定)：抗BTN2A1mAb、mIgG1(同种型对照抗体)或杂交瘤培养基。12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(PMA,20ng/mL)和离子霉素(1μg/mL)用作Vγ9/Vδ2-T细胞活化的阳性对照。对于第一轮杂交瘤上清液筛选，4小时后收集培养上清液并使用人IFNγELISA组(BD Biosciences)测试其在IFNγ上的含量，作为Vγ9/Vδ2-T细胞活化的指标。对于第二轮杂交瘤上清液表征，通过在GolgiStop(BDBiosciences)和可溶性CD107(a&b)-FITC存在下孵育4小时来评估Vγ9/Vδ2-T细胞脱粒。4小时后，将细胞收集，固定在含2％多聚甲醛的PBS中，并在CytoFlex LX(Beckman Coulter)上使用FlowJo 10.5.3软件(FlowJo)分析。

Vγ9/Vδ2-T细胞的增殖

使用抗TCRγδ微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体的PBMC分离Vγ9/Vδ2-T细胞。通过流式细胞术评估的γδ-T细胞纯度大于80％。将γδ-T细胞在37℃下用CellTraceViolet标记20分钟。然后，在IL-2(200UI/ml)、有或没有pAg、有或没有纯化的抗BTN2A1107G3抗体(10μg/ml)的情况下将5x10⁵个CellTrace标记的细胞在96孔圆底板中培养。培养5天后，使用FlowJo 10.5.3软件(FlowJo)在CytoFlex LX(Beckman Coulter)上通过流式细胞术评估CellTrace稀释度。

统计学：

对于Vγ9/Vδ2-T细胞脱粒，结果表示为平均值±SEM。根据可变斜率模型非线性回归后的对数(剂量)响应曲线测定纯化的抗BTN2A1 mAb在BTN2A1转染的HEK-293T BTN2 KO细胞上的EC₅₀。所有分析均使用GraphPad Prism 7.04软件(GraphPad)进行。

参考抗BTN2A mAb 101G5的鉴定

在VH和VL测序后，在嵌合IgG1形式下产生如上所述从小鼠杂交瘤产生中获得的23种抗BTN2A mAb。简言之，在体外合成鼠VH和VK抗BTN2A mAb序列，并使用PrimeSTAR MaxDNA聚合酶(Takara)通过PCR扩增。使用融合系统(Clontech)将PCR产物克隆到重链和轻链表达载体(MI-mAb)中，并将质粒转化入Stellar感受态细胞(Clontech)。进行载体测序(MWGEurofins)以验证抗BTN2A mAb，然后大规模(maxi)制备用于进一步转染的质粒。将编码每个抗BTN2A克隆的匹配轻链和重链的载体瞬时转染到HEK-293细胞(2.9x10⁶个细胞/mL)中，其中重链/轻链比例为1:1.2，并且18小时后更新培养基。转染后7天，收集培养物上清液用于mAb纯化。抗体的亲和纯化使用Protein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)进行，44℃下过夜。结合缓冲液是0.5M甘氨酸，3M NaCl，pH8.9。使用以下缓冲液进行洗脱：0.1M柠檬酸盐，pH3。样品在洗脱后立即用1M Tris-HCl,pH9(10％v/v)中和。最后，将嵌合抗BTN2AmAb透析到PBS 1X中并通过0.22μM过滤器(Millex GV亲水性PVDF，Millipore)过滤。考虑到抗体的消光系数，在Nanodrop 2000分光光度计(ThermoScientific)中测定嵌合抗BTN2AmAb浓度。使用Acquity UPLC-HClass Bio(Waters)和Acquity UPLC Protein-BEH-200A,1.7μm 4.6x 50mm色谱柱(Waters)通过UPLC-SEC测定由mAb单体的分数定义的纯度。使用反相色谱柱(PLRP-S 4000A,5μm,50x 2.1mm(Agilent technologies)在Xevo G2-S Q-Tof质谱仪(Waters)中测定抗体质量。所有样品均在去糖基化后使用PNGase F糖苷酶(NewEngland Biolabs)在37℃下分析。当发现意外质量时，使用生物信息学工具分析初级氨基酸序列以鉴定Fab区内推定的糖基化位点。纯化抗体的SDS-PAGE允许检测最终材料无染色Mini protean TGX凝胶4-15(Biorad)的碎片和/或聚集。使用ClarioStar分光光度计(BMGLabtech)使用Chromogenic LAL Limulus Amebocyte Lysate动力学分析(Charles RiverEndosafe)测定内毒素水平。

体外巨噬细胞极化测定：

将M1或M2巨噬细胞从健康供体的分选单核细胞中极化。为此，在GM-CSF或M-CSF(40ng/mL；Miltenyi)存在的情况下培养分选的单核细胞，以分别产生M1或M2巨噬细胞。5天后，收集产生的巨噬细胞用于表型分析，或用LPS(200ng/mL)再刺激2天。在一些实验中，在第4天将IL-4(20ng/mL)添加到M2巨噬细胞中，导致产生“M2+IL-4”或巨噬细胞。在一些实验中，通过在没有M-CSF补充的情况下在PANC-1癌细胞条件培养基(在培养基中稀释30％v/v，在第0天和第3天)下培养单核细胞产生M2巨噬细胞。由此产生的M2巨噬细胞在本申请中称为“Tum-ind-M2”。为了筛选抗BTN2A mAb调节M2分化的能力，如上所述在有或没有指定浓度的嵌合抗BTN2A mAb或其同种型对照(人IgG1；Sigma)的情况下，从单核细胞产生M2巨噬细胞。将所有mAb湿法包被(在室温下在PBS 1X中过夜)。作为M2分化抑制的对照，在M-CSF诱导的M2极化过程中，将GM-CSF(40ng/mL)和IFNγ(100ng/mL，BioTechne)添加到单核细胞中。在GM-CSF存在下极化的M1巨噬细胞用作表型对照。极化后，收集得到的巨噬细胞及其培养上清液，并通过流式细胞术评估质膜上M1和M2相关标志物的表达。此外，按照制造商的说明，使用IL-10和TNFαELISA试剂盒(ThermoFisher Scientific)定量培养上清液中的细胞因子含量。

体外M2巨噬细胞逆转试验：

在不存在参考mAb的情况下如上所述在M-CSF存在下从单核细胞产生M2巨噬细胞。收集M2巨噬细胞并在有或没有LPS的情况下在培养孔上培养2天，所述培养孔之前用10μg/mL参考抗体或其对照同种型mAb(来自Sigma的人IgG1)湿法包被过夜。作为M2逆转的对照，将GM-CSF(40ng/mL)和IFNγ(100ng/mL)添加到M2巨噬细胞培养物中2天。在GM-CSF存在下极化的M1巨噬细胞用作表型对照。逆转实验后，收集未添加LPS逆转的巨噬细胞，通过流式细胞术进行表型分析。使用ELISA对来自LPS刺激的逆转巨噬细胞的培养物上清液进行细胞因子定量收集。

M2巨噬细胞介导的T细胞增殖和IFNγ产生抑制的体外测定

如上所述，在添加或不添加参考抗体或其同种型对照mAb的情况下产生M1和M2巨噬细胞。根据制造商的说明，使用CD3+微珠试剂盒(Miltenyi)从健康供体PBMC中分选CD3+T细胞并冷冻直至共培养。活化的CD3+T细胞如下产生：将CD3+T细胞用5μM CellTraceViolet染料(ThermoFisher Scientific)染色，然后在之前用1μg/mL抗CD3 mAb(克隆OKT3，BD biosciences)包被的96孔平板中在补充有20U/mL IL-2(Miltenyi)、LPS(200ng/mL)和CountBright绝对计数珠(每孔5x10³个，ThermoFisher Scientific)的X-Vivo 10培养基中培养10⁵个这样的细胞。为了与巨噬细胞共培养，将2x10⁴个同种异体M1、M2或在M-CSF和参考mAb或其对照同种型存在下极化的巨噬细胞添加到活化的同种异体CD3+细胞中。共培养5天后，在GolgiStop蛋白转运抑制剂存在下将20ng/mL PMA和0.5μg/mL离子霉素添加到共培养物中以增强细胞因子的产生，持续5小时。然后，通过流式细胞术回收细胞用于表型分析。CellTrace稀释度用作CD3+T细胞增殖的指标。表型和增殖的结果以百分比或每mL绝对细胞数表示(在使用绝对计数珠校准后)。

使用参考抗BTN2A1 mAb进行自然杀伤(NK)挑战：

将来自健康供体的分选自然杀伤(NK)细胞标记，然后在37℃、5％CO₂下在补充有10％FBS和1％P/S、IL-2(50UI/mL)的RPMI中在有或没有IL-15(10ng/mL)刺激下培养。在第0天将参考抗BTN2A mAb或对照同种型(10μg/mL)添加到培养物中。5天后，对NK细胞进行细胞外表型分析以表达活化标志物。通过诱导CD69和CD25表达(百分比和中值荧光强度MFI)来评估NK激活。NK细胞的门控策略如图4所示。对于NK细胞毒性测量，将来自3个健康供体的分选NK细胞在37℃、5％CO₂下在补充有10％FBS和1％P/S的RPMI中在有或没有IL-2(50UI/mL)和IL-15(10ng/mL)的条件下培养。将参考抗BTN2A mAb或对照同种型(10μg/mL)添加到未刺激或IL-2/IL-15刺激的NK细胞上过夜。第二天，将NK细胞与指定的血液或癌细胞系以1:1的比例共培养，并将FITC标记的抗CD107a和抗CD107b mAb(均来自BD Biosciences)添加到共培养物中并孵育4小时。通过流式细胞术将NK细胞脱粒评估为未刺激或IL-2/IL-15刺激的NK细胞上CD107ab+细胞百分比。为了计算NK细胞脱粒增强的EC₅₀，参考抗BTN2A mAb及其同种型对照mAb以0.005nM-300nM的浓度使用。对于癌细胞NK细胞介导的杀伤评估，将纯化的NK细胞10μg/mL的参考101G5和107G3 mAb或相应的IgG1对照在37℃、5％CO₂下在补充有10％FBS和1％P/S IL-2(50UI/mL)和IL-15(10ng/mL)的RPMI中预孵育过夜，并用作阳性对照。第二天，将NK细胞与指定的CellTrace标记的癌细胞系以1:1的比例共培养4小时。通过使用CellEvent^TM Caspase-3/7绿色检测试剂(Thermofisher Scientific)在肿瘤细胞系上获得caspase 3/7+细胞的百分比来评估癌细胞死亡。

流式细胞术：

在染色之前，将PBMC/NK细胞和单核细胞/巨噬细胞与人Fc阻断(Miltenyi)或人IgG1(Sigma)孵育10分钟以使Fc受体饱和。使用的标记mAb如下：CD14-FITC和-APC-Vio770(Miltenyi)、CD163-VioBlue(Miltenyi)、DC-SIGN-PE-Vio770(Miltenyi)、CD80-PE(BDBiosciences)、PDL1-APC(BD Biosciences)、CD3-PE-CF594(BD Biosciences)和CD3-BV605(Biolegend)、CD56-PE-Vio770(Miltenyi)和-BV605(BD Biosciences)、CD69-BV421(BDBiosciences)、CD25-APC(BD Biosciences)。将细胞与抗体混合物在4℃下孵育30分钟。使用活/死近红外染料(ThermoFisher Scientific)来定义“活”门，而排除死细胞。对于细胞内IFNγ染色，使用细胞内固定和透化缓冲液组(eBioscience)固定和透化细胞外染色的细胞，并与APC标记的抗IFNγ(BD Biosciences)一起孵育。使用FlowJo 10软件在Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上进行采集。对于BTN2A1和BTN2A2表型分析，使用10μg/mL的纯化抗BTN2A1特异性(mAb5)和抗BTN2A2特异性(mAb17)，并用PE标记的抗IgG(H+L)(JacksonImmunoresearch)显示。选择单个细胞后，NK细胞是“活”门内的CD45+CD14-CD3-CD56+细胞。选择单个细胞后，单核细胞是“活”门内的CD45+CD19-CD3-CD56-CD14+细胞。在Cytoflex LS(Beckman Coulter)、iQue Screener(Intellicyt)或Fortessa(BD Biosciences)流式细胞仪上进行采集，并使用FlowJo 10软件分析数据。结果表示为减去相应染色对照获得的值后的中值荧光强度(MFI)。

基于Octet的BTN2A1表位亲和力测量和分箱测定：

在生成嵌合IgG1形式的参考抗BTN2A抗体后，评估了该靶标的2种不同亚型(BTN2A1和BTN2A2)的亲和力，并进行了竞争测定以确定这些mAb是否识别BTN2A1的相同表位区域。在基于生物层干涉测量(BLI)技术的Octet Red96平台(Fortebio/PALL)上进行亲和力和分箱实验。对于亲和力实验，根据制造商的说明，使用EZ-Link^TMNHS-PEG4生物素化试剂盒将重组人(rh)BTN2A1-Fc(GTP)生物素化，并且生物素化的rhBTN2A2-Fc购自R&DSystems。在BTN2A1亲和力测定的情况下，将生物素化的rhBTN2A1-Fc加载到在KineticBuffer 1X(ForteBio)中稀释的链霉亲和素(SA)生物传感器(ForteBio)中，加载靶标水平约为1nm，并使用嵌合抗BTN2A抗体作为分析物。对于BTN2A2亲和力测定，如上所述将嵌合抗BTN2A抗体加载到FAB2G传感器(抗人CH1；Fortebio)中，并且使用生物素化的rhBTN2A2-Fc作为分析物。在这两种情况下，分析物保留在溶液中，并且将其工作浓度在Kinetic Buffer10X(ForteBio)中稀释。对于第一次运行，标准工作浓度范围为200-3.125nM。当第二次运行需要时，将工作浓度从80调整到1.25nM。所有运行(包括加载、平衡、传感器结合/浸入分析物、解离和再生)均在30℃下以1000rpm的转速进行。使用由Octet软件计算的1:1或2:1Langmuir模型(分别为BTN2A1或BTN2A2)进行分析，这允许更好的拟合计算。对于分箱实验，His标记的BTN2A1(rhBTN2A-His)购自R&D Systems。以成对方式针对BTN2A1测试参考抗BTN2A抗体。通过遵循“串联”格式进行分箱实验，意味着将rhBTN2A-His固定在生物传感器(抗Penta-His《HIS1K生物传感器；ForteBio/PALL)上，并在连续步骤中呈递给2个竞争抗体。对于此动力学筛选，将rhBTN2A-His加载到HIS1K(信号强度：1nm)之后，然后是与10μg/mL抗体结合3分钟的步骤，然后是3分钟的解离步骤。rhBTN2A1-His活性通过以与分箱测定相同的格式进行的动力学筛选测定而证实(BTN2A1作为传感器上的配体/捕获物，并且抗体作为分析物)。所有抗体(饱和抗体或竞争抗体)均以10μg/mL的浓度使用，在KineticBuffer 1X中稀释。对于该动力学筛选，在HIS1K上加载rhBTN2A1-His(信号强度：1nm)，然后是与抗体结合3分钟的步骤，然后是3分钟的解离步骤。测定步骤如下：基线->抗原捕获->基线->饱和抗体->基线->竞争抗体->遵循“串联”方案的再生。使用表位分箱操作使用Octet数据分析HT 11.1分析分箱数据。

参考mAb 107G3和101G5的表位定位

BTN2A1与参考mAb 107G3和101G5之间的相互作用通过对单独的BTN2A1或与107G3或101G5的肽质量指纹的差异评估来评估。在开始表位定位之前，已在rhBTN2A1-Fc蛋白(GTP Technologies)上进行高质量MALDI分析，以使用配备CovalX HM4相互作用模块的Autoflex II MALDI ToF质谱仪(Bruker)验证其完整性和聚集水平(CovalX)，这证实样品中不存在BTN2A1的非共价聚集体或多聚体。为了表征BTN2A1，并确定BTN2A1/107G3和BTN2A1/101G5的表位，我们将样品提交给胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶水解，然后使用与LTQ-Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific)联合nLCUltimate 3000-RSLC系统，进行nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析。对于BTN2A1/107G3和BTN2A1/101G5复合物，将蛋白质复合物在多酶裂解之前与氘化交联剂一起孵育。富集交联肽后，使用XQuest 2.0和Stavrox 3.6软件分析样品和生成的数据。对于样品制备，如下进行还原烷基化：将BTN2A1(4.04μM)与DSS d0/d12(2mg/mL；DMF)混合，然后在室温下孵育180分钟。孵育后，通过添加1μL碳酸氢铵(20mM终浓度)终止反应，然后在室温孵育1小时。然后，使用speedvac然后是在H₂O 8M尿素悬浮液(10μL)干燥溶液。混合后，向溶液中添加1μL DTT(500mM)。然后，将混合物在37℃下孵育1小时。孵育后，添加1μl碘乙酰胺(1M)，然后在暗室室温孵育1小时。孵育后，添加100μl蛋白水解缓冲液。胰蛋白酶缓冲液含有50mM Ambic pH8.5、5％乙腈；胰凝乳蛋白酶缓冲液含有Tris HCl 100mM、CaCl₂ 10mM pH 7.8；ASP-N缓冲液含有50mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液；弹性蛋白酶缓冲液含有Tris HCl 50mM pH 8.0并且嗜热菌蛋白酶缓冲液含有Tris HCl 50mM、CaCl₂ 0.5mM pH 9.0。对于胰蛋白酶蛋白水解，将100μL还原/烷基化BTN2A1与1μL胰蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/100的比例混合。将蛋白水解混合物在37℃下孵育过夜。对于胰凝乳蛋白酶蛋白水解，将100μL还原/烷基化BTN2A1与0.5μL胰凝乳蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/200的比例混合。将蛋白水解混合物在25℃下孵育过夜。对于ASP-N蛋白水解，将100μL还原/烷基化BTN2A1与0.5μL ASP-N(Roche Diagnostic)以1/200的比例混合。将蛋白水解混合物在37℃下孵育过夜。对于弹性蛋白酶蛋白水解，将100μL还原/烷基化BTN2A1与1μL弹性蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/100的比例混合。将蛋白水解混合物在37℃下孵育过夜。对于嗜热菌蛋白酶蛋白水解，将100μL还原/烷基化BTN2A1与2μL嗜热菌蛋白酶(Roche Diagnostic)以1/50的比例混合。将蛋白水解混合物在70℃下孵育过夜。消化后，将最终1％的甲酸加入溶液中。蛋白水解后，将10μL蛋白水解产生的肽溶液加载到具有以下设置的纳米液相色谱系统(Ultimate 3000-RSLC)上：A：95/05/0.1H₂O/ACN/HCOOH v/v/v；B:20/80/0.1H₂O/ACN/HCOOH v/v/v，35分钟内梯度5-40％B，进样体积10μL，预柱300-μm ID x 5-mm C18 PepMapTM，预柱流速20μL/min，色谱柱75-μm ID x 15-cm C18 PepMapRSLC，色谱柱流速，200nL/min。

人和食蟹猴BTN2A1交叉反应性的ELISA测定

将食蟹猴BTN2A1直系同源序列(XM_015448906.1)在使用人BTN2A1氨基酸序列进行BLAST搜索后鉴定，并使用EcoRI/EcoRV限制性位点将其胞外域克隆到pFUSE-hIgG1FC2载体(InvivoGen)中。根据制造商的说明，通过使用ExpiFectamine^TM293(ThermoFisher)将所得pFUSE-hIgG1FC2-cynoBTN2A1质粒转染到Expi293F^TM细胞中来生产重组cynoBTN2A1-Fc融合蛋白。第6天收集的细胞培养上清液用于通过亲和纯化柱进行纯化。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析纯化的cynoBTN2A1-Fc蛋白的分子量和纯度测量。cynoBTN2A1-Fc蛋白浓度通过以BSA为标准的Bradford测定法测定。对于ELISA，将cynoBTN2A1-Fc蛋白或重组人BTN2A1-Fc(huBTN2A1-Fc，GTP Technologies)在4℃下包被(5μg/mL，在1X PBS中)过夜。在PBS中洗涤3次后，将板在室温下用PBS中的BSA 2％v/v饱和1小时，然后丢弃饱和缓冲液。将参考mAb101G5和107G3或对照人IgG1在2％PBS BSA中稀释10倍级联稀释，从1μM-1pM，并且每孔添加100μL每种稀释液，并在室温下在振动筛上孵育90分钟。将所有孔在PBS中洗涤3次，然后添加山羊抗小鼠IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，在PBS BSA 2％中以1:10000稀释)并在室温下孵育1小时。然后，将所有孔在PBS中洗涤3次，并添加1步ABTS溶液(ThermoFisher)用于结合显示，如在Spark光谱仪(Tecan)中通过405nm处的吸光度评估。所有样品一式两份进行评估。

结果：

参考抗体抗BTN2A1 107G3的鉴定

参考抗BTN2A1 107G3抗体鉴定如下：用BTN2A1-Fc抗原免疫小鼠，收集表现出最高滴度BTN2A1特异性血清的小鼠的脾细胞，并与骨髓瘤细胞系融合以获得杂交瘤。根据它们调节Vγ9/Vδ2-T细胞分泌IFN-γ的能力，选择对BTN2A1表现出最高亲和力的杂交瘤培养上清液进行第一轮筛选。将从第一轮筛选中选出的克隆亚克隆并测试它们诱导IFN-γ分泌和Vγ9/Vδ2-T细胞脱粒和IFN-γ分泌的能力，特别是它们诱导Vγ9Vδ2-T细胞脱粒的能力(图1c和2)，并导致参考mAb 107G3的鉴定。对这些亚克隆的VH和VL区进行测序(见下表2)。

抗BTN2A1 107G3抗体诱导针对不同癌细胞靶标的Vγ9Vδ2-T细胞脱粒

从健康供体的PBMC中扩增纯化的Vγ9/Vδ2T细胞，并在有或没有抗BTN2A1 107G3杂交瘤培养上清液的情况下与不同的癌细胞系共培养，包括Daudi(伯基特淋巴瘤)、Jurkat(急性T细胞白血病)、L-IPC(胰腺癌)和MDA-MB-134(乳腺癌)作为靶细胞。如图2和表3所示，与单独与靶细胞共培养或在对照杂交瘤培养基存在的情况下相比，添加抗BTN2A1 107G3杂交瘤上清液会诱导Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，如通过CD107+脱粒细胞的百分比所测量。如所预期，PMA/离子霉素处理Vγ9/Vδ2T细胞最大程度地诱导其独立于靶细胞的溶细胞功能。

由抗BTN2A1 107G3杂交瘤上清液诱导的CD107+细胞百分比范围从Daudi细胞中的71.1±7.4％到MDA-MB-134细胞中的17.1±2.9％vs分别在与对照杂交瘤培养基共培养的24.9±4.7％和4.9±0.4％。在Vγ9/Vδ2T细胞的共培养物中，以所有测试的癌细胞系为靶标，在对照杂交瘤培养基存在下，与相同的共培养物相比，抗BTN2A1 107G3诱导的Vγ9/Vδ2T细胞脱粒增加了2-8倍。

在增加浓度(0-18μg/ml)的抗BTN2A1 107G3 mAb存在下与作为靶标的Daudi细胞共培养，纯化的抗BTN2A1 mAb 107G3的诱导Vγ9/Vδ2T细胞脱粒的EC₅₀为0.77μg/mL(95％IC0.32-13.22μg/mL)，如CD107+细胞百分比所示(图2b)。

表3

抗BTN2A1 107G3抗体识别BTN2A1但不识别BTN3

为了确定抗BTN2A1 mAb 107G3仅对BTN2A1亚型具有特异性，将具有CRISPR-Cas9介导的两种BTN2亚型失活的HEK-293T BTN2 KO细胞用编码BTN2A1的质粒瞬时转染，作为CFP-融合蛋白。如图3a所示，仅在用BTN2A1编码质粒转染的HEK-293T BTN2KO细胞中检测到纯化的抗BTN2A1 mAb 107G3染色，而在单独的HEK-293T BTN2 KO细胞中未检测到。

识别所有BTN3亚型的抗BTN3 mAb 103.2容易检测HEK-293T BTN2 KO细胞中BTN3表达。因此，抗BTN2A1 107G3对BTN2A1亚型具有特异性，并且不会与BTN3发生交叉反应。

抗BTN2A1 107G3 mAb对细胞中BTN2A1的亲和力

为了测量抗BTN2A1 107G3 mAb对其靶标的亲和力，用BTN2A1编码质粒转染的HEK-293T BTN2 KO细胞用增加浓度(5ng/mL-75μg/mL)的纯化抗BTN2A1 107G3 mAb或对照mIgG1染色(图3b)。平均荧光强度数据的非线性回归分析发现抗BTN2A1 107G3 mAb的EC₅₀为0.32μg/mL(95％IC 0.21-0.46μg/mL)。

嵌合抗BTN2A mAb的产生、亲和力测量和BTN2A亚型特异性：

在HEK-293T细胞中瞬时产生23种单克隆抗体，实现了不同范围的生产力。大多数抗BTN2A抗体以高水平(>100mg/L和高达430mg/L)产生。一种抗体，抗BTN2A mAb3(表3)，在HEK-293T细胞中的产量非常低，范围为6-8mg/L。氨基酸序列分析揭示了其Fab部分中的N-糖基化位点，在其VH的CDR1中。其他两种抗体，抗BTN2A mAb9和mAb11，也在其Fab区内(在mAb9的CDR1_VH和mAb11的CDR1_VL中)表现出N-糖基化位点。六种抗体的纯度水平较低(单体中<95％)，但只有抗BTN2A mAb1和mAb3的纯度水平<90％(分别为86％和75％)。所有最终纯化的抗BTN2A mAb都表现出非常低的内毒素水平(在0.1EU/mg的范围内)。只有mAb3的内毒素水平(0.73EU/mg)高于其他单克隆抗体，但仍处于可接受的标准范围内(<1EU/mg)。通过使用生物素化重组Fc融合可溶性蛋白，使用Octet技术测定23种抗BTN2A嵌合mAb的亲和常数(K_D、k_on和k_off)。表4概括了每种抗BTN2A mAb的K_D常数。对于mAb6和mAb9，由于在测量期间没有观察到解离(k_off<10^-7s^-1)，因此无法计算K_D，这可以通过这些抗体的亲合力效应减缓它们与靶标的解离来解释。发现8种抗BTN2A mAb仅结合BTN2A1亚型(mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb8、mAb9和mAb10)，发现8种抗BTN2A mAb仅结合BTN2A2亚型(mAb16、mAb17、mAb18、mAb19、mAb20、mAb21、mAb22和mAb23)并发现7种mAb结合两种亚型(mAb1、mAb7、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14和mAb15)。

表4：嵌合抗BTN2A mAb产生和亲和力总结。

*在VH或VL中存在N-糖基化位点。

单核细胞和NK细胞上的BTN2A1和BTN2A2质膜表达：

我们试图确定抗BTN2A mAb是否可以针对外周血的非Vγ9Vδ2T细胞区室，即单核细胞和NK细胞进行治疗。因此，我们使用在我们的octet测定中发现的分别仅结合BTN2A1或BTN2A2的mAb5和mAb17进行来自外周血的单核细胞和NK细胞的表型分析。如图4所示，只有抗BTN2A1 mAb5染色单核细胞和NK细胞的质膜，其中在单核细胞中观察到更强的信号。因此，在单核细胞和NK细胞的质膜上检测到BTN2A1而不是BTN2A2，这为筛选识别BTN2A1的mAb提供了理由，因为它们能够调节这些免疫细胞区室的免疫功能。

筛选抗BTN2A mAb调节单核细胞至巨噬细胞极化的能力

为响应来自其微环境的信号，单核细胞可以极化为M1或M2巨噬细胞。M1巨噬细胞具有促炎和抗肿瘤特性，而M2巨噬细胞具有抗炎特性并与肿瘤发展有关。鉴于在单核细胞的质膜上仅发现BTN2A1亚型，在M-CSF存在下评估仅识别BTN2A1或识别BTN2A1/BTN2A2亚型的抗BTN2A mAb在体外干扰单核细胞极化为M2巨噬细胞的能力。在GM-CSF(CD14+/-CD163-)存在下产生的M1巨噬细胞和在M-CSF存在下产生的M2(CD14+CD163+)巨噬细胞(两者均没有mAb)用作巨噬细胞极化的对照。体外极化5天后，在抗BTN2A mAb或其对照IgG1存在下极化的M1、M2和M-CSF诱导的巨噬细胞质膜上CD14和CD163的表达通过流式细胞术评估(表4)。如所预期，M1细胞呈现出低CD14表达和无法检测到的CD163表达(表5和图4)，而M2巨噬细胞呈现出两种标志物的高表达。有趣的是，从现在起将被称为101G5的抗BTN2A mAb1在M-CSF存在下诱导了CD14和CD163表达的最强降低，从而使M-CSF诱导的巨噬细胞向M1样表型极化(表4和图4B)。M-CSF诱导的M2巨噬细胞极化的第二个最佳抑制剂是mAb2，即107G3(表5和图4B)。这与在M-CSF和对照IgG1存在下获得的巨噬细胞的表型相反，后者类似于未处理的M2巨噬细胞。

表5：抗BTN2A mAb对单核细胞向M2-巨噬细胞极化后CD14和CD163表达的影响。

图5显示了在CD14和CD163表达抑制方面与同种型对照相比参考101G5和107G3抗BTN2A mAb的M2抑制作用的剂量依赖性(图5A和5B)以及作为M1表型的特征的PDL1和CD86的增加的表达(图5C和5D)。细胞因子分泌特征也是M2与M1巨噬细胞之间的区别特征。因此，在LPS刺激来自M-CSF诱导的巨噬细胞的培养物上清液后(有或没有参考抗-BTN2A mAb)，通过ELISA评估IL-10(抗炎，M2相关)和TNFα(促炎，M1相关)分泌。如图5E和5F所示，与同种型对照相比，参考抗BTN2A mAb以剂量依赖性方式抑制IL-10的分泌并增加TNFα的分泌。这些观察结果证实，在表型和细胞因子分泌方面，101G5和107G3通过偏向M1样表型来抑制M-CSF诱导的单核细胞极化为M2巨噬细胞。此外，101G5和107G3的这些作用是剂量依赖性的。每个mAb的IC₅₀和EC₅₀显示于表6中。值得注意的是，与107G3相比，101G5获得了除PD-L1之外的所有参数的最低IC₅₀和EC₅₀。

表6：参考抗BTN2A mAb对M2与M1相关表型和细胞因子分泌的IC₅₀和EC₅₀

来自肿瘤微环境的其他刺激已被描述为诱导M2巨噬细胞极化(Mosser和Edwards，Nat Rev Immunol 2008；Mantovani和Allavena，J Exp Med 2015)。除了M-CSF，最常用的诱导M2极化的刺激之一是IL-4。我们确定了101G5和107G3对用M-CSF和IL-4刺激后由单核细胞产生的所谓的促肿瘤“M2+IL-4”巨噬细胞分化的影响。在这种条件下培养5天后，101G5和107G3抑制“M2+IL-4”相关标志物(CD14、CD163和DC-SIGN，图6A、6B和6D)的表达和IL-10分泌(图6F)，同时增加M1相关标志物(CD86、PDL1)的表达和TNFα的分泌(图6C、6E和6G)。因此，在促肿瘤环境(M-CSF和IL-4)中，101G4和107G3抑制“M2+IL-4”分化并增强促炎性M1巨噬细胞分化。

此外，101G5和107G3对癌细胞诱导的单核细胞M2极化的影响通过在PANC-1(胰腺腺癌细胞系)条件培养上清液存在下培养分选的单核细胞来评估。当在此设置中添加101G5或107G3时，M2极化被抑制，如M2相关标志物(CD14、CD163)的表达和IL-10分泌(图7A-C)减少以及M1相关促炎性TNFα的表达增加(图7D)所示。

参考抗BTN2A mAb 101G5和107G3对M2-巨噬细胞向M1重编程的影响

评估了参考101G5和107G3 mAb将M2极化巨噬细胞逆转为M1表型的潜力。为此目的，将先前在M-CSF存在下极化5天的M2巨噬细胞接种到先前包被有101G5和107G3 mAb的孔中，并再培养2或4天。用IFNγ处理M2巨噬细胞作为M2->M1逆转的阳性对照。如图8所示，在101G5和107G3存在下培养的M2巨噬细胞获得了M1样表型，类似于IFNγ处理。实际上，用参考101G5和107G3 mAb处理M2巨噬细胞导致CD14(图8A)和CD163(图8B)表达降低，并且CD86表达增加(图8C)。分别用101G5或107G3处理后，观察到PDL1适度至无上调(图8D)。此外，用101G5和107G3处理M2巨噬细胞可抑制IL-10分泌(图8E)并增强TNFα分泌(图8F)，指示M1表型。

图8G-I显示在CD163表达抑制方面与同种型对照相比(图8G)，参考101G5和107G3mAb对M2-巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞的影响的剂量依赖性，IL-10降低和TNFα分泌增加(图8H和I)。对于相关的特定M1/M2标志物，每种mAb的IC₅₀和EC₅₀显示于表7中，其中抗BTN2A101G5 mAb对M2-巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞显示出最佳活性。

表7：参考抗BTN2A mAb对M2逆转的IC₅₀和EC₅₀

参考抗BTN2A mAb 101G5和107G3释放M2介导的T细胞增殖抑制

研究了参考101G5和107G3 mAb影响M2巨噬细胞功能的能力，即抑制M2介导的T细胞增殖。为此，将同种异体预活化的CD3+T细胞与M1、M2或在mAb存在下产生的M2共培养。如所预期，与M1巨噬细胞相比，与常规M2巨噬细胞共培养导致CD3+T细胞数减少，T细胞增殖(通过CTV稀释评估)和IFNγ产生减少(图9A、C、G、E和I)。相比之下，在101G5和107G3存在下产生的M2巨噬细胞似乎没有抑制T细胞增殖，如在对照IgG1存在下产生的M2巨噬细胞培养物相比，CD3+T细胞的百分比和绝对数更高(图9B、9H和9J)所示。此外，与对照IgG1相比，在含有在101G5和107G3存在下产生的巨噬细胞的共培养物中，产生IFNγ的T细胞的百分比和数量也更高(图9D和9F)。

因此，与单独由M-CSF诱导的M2巨噬细胞相比，除了M-CSF外，在101G5或107G3存在下产生的巨噬细胞允许同种异体CD3+T细胞的增殖和Th1功能(IFNγ产生)，类似于M1巨噬细胞。

参考抗BTN2A mAb 101G5和107G3触发NK细胞活化和细胞毒性

由于在NK细胞的质膜上发现了BTN2A1，因此研究了101G5和107G3调节NK细胞活化的潜在能力。来自健康供体的纯化NK细胞在101G5或107G3存在下培养5天，有或没有进一步激活(分别为IL-2和IL-15或仅仅IL-2)。如图10所示，101G5和107G3在所有测试条件下都增强NK细胞质膜上CD69的表达(图10A)。此外，101G5和107G3还增强了由IL-2和IL-15处理NK细胞诱导的CD25的表达(图10B)。由于101G5和107G3能够激活纯化的NK细胞，我们研究了这些mAb是否也能增强NK细胞的细胞毒性。因此，在存在101G5或107G3，有或没有IL-2和IL-15刺激的情况下评估了针对癌细胞系HL-60(骨髓性白血病)、HT-29(结肠癌)、MDA-MB-231(乳腺癌)和A549(肺腺癌)的NK细胞脱粒(％CD107+细胞)。如所预期，在存在对照IgG1的情况下，只有HL-60细胞触发NK细胞脱粒(图10C)，这通过用IL-2和IL-15刺激而增强(图10D)。在存在对照IgG1和IL2+IL-15的情况下，也观察到针对实体瘤细胞系HT-29、MDA-MB-231和A549的适度NK细胞脱粒。表8总结了针对这些和测试的其他(Raji,HCT116,DU-145)癌细胞系的NK细胞脱粒。有趣的是，参考mAb 101G5和107G3增强了针对实体瘤细胞系MDA-MB-231和A549的NK细胞脱粒，并且在没有IL-2+IL-15刺激的情况下，对HT-29的作用较小。添加IL-2和IL-15增强101G5和107G3在MDA-MB-231、A549和DU145细胞中的作用(表8)。通过添加参考101G5或107G3 mAb，在HL-60和Raji血癌细胞系中没有观察到这种增强(表8和图10C和D)。此外，在共培养前与NK细胞预孵育时，参考mAb 101G5和107G3能够触发针对A549细胞的NK细胞脱粒，而无需进一步将mAb添加至共培养(图10E)。这表明参考107G3和101G5 mAb通过直接与NK细胞结合引发针对癌细胞的细胞毒性的直接影响。此外，评估了101G5和107G3对增强NK细胞脱粒针对抗前列腺腺癌DU-145细胞系的剂量依赖性。实际上，101G5和107G3以剂量依赖性方式增强NK细胞针对DU-145细胞的脱粒作用(分别对于101G5和107G3，EC_{50(无刺激)}＝0.14和0.54nM；EC_{50(IL-2+IL-15)}＝0.08和0.2nM)。

表8：在没有IL-2和IL-15刺激的情况下，针对不同癌细胞系的NK细胞脱粒(％CD107+细胞)

最后，我们通过评估纯化NK细胞与白血病细胞系HL-60或肺腺癌细胞系A459共培养后caspase 3/7细胞的百分比，测试了101G5和107G3增强NK细胞介导的癌细胞杀伤的能力。如图11所示，101G5和107G3增强NK细胞介导的对腺癌A549细胞的杀伤作用(～2倍)，但对HL-60白血病细胞没有作用。总之，这些观察结果表明101G5和107G3优先增强NK细胞针对来自实体瘤的癌细胞的细胞毒性。

参考抗BTN2A 101G5和107G3 mAb识别BTN2A1的不同表位

101G5和107G3均结合BTN2A1并共享抑制M2巨噬细胞极化和增强NK细胞活化和细胞毒性的能力。因此，我们研究了这些mAb是否识别BTN2A蛋白上的相同表位区域。因此，进行了基于octet的分箱实验，其中101G5和107G3使用“串联”设置竞争BTN2A1结合。如图12所示，101G5和107G3没有阻断彼此与BTN2A1的结合，表明这两种mAb不与BTN2A1上的相同表位区域结合。

参考mAb 101G5和107G3的表位定位

为了表征BTN2A1，我们将样品提交给胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶水解，然后进行nLC-LTQ-Orbitrap MS/MS分析。胰蛋白酶水解后，在BTN2A1序列中鉴定出32个肽，覆盖序列的79.84％；胰凝乳蛋白酶水解后鉴定出27个肽，覆盖BTN2A1序列的94.76％；ASP-N蛋白水解后鉴定出2个肽，覆盖BTN2A1序列的12.50％；弹性蛋白酶水解后鉴定出33个肽，覆盖BTN2A1序列的89.11％；嗜热菌蛋白酶水解后鉴定出29个肽，覆盖BTN2A1序列的78.23％。基于获得的结果，设计了胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、ASP-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶肽的重叠定位(图13)。结合胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、ASP-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶蛋白水解的肽，覆盖了BTN2A1序列的96.37％。为了以高分辨率确定BTN2A1/107G3和BTN2A1/101G5复合物的表位，将蛋白质复合物与氘化交联剂一起孵育，然后进行多酶裂解。在蛋白质复合物BTN2A1/107G3的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、ASP-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶蛋白水解后，nLC-orbitrap MS/MS分析检测到BTN2A1和抗体107G3之间的17个交联肽。

表9：BTN2A1/107G3之间交联的序列和位置

因此，我们的分析表明BTN2A1和107G3 mAb之间的相互作用包括BTN2A1上的以下氨基酸：65、68、69、72、78、84、85、95、97、100。这些结果在图14A和图15中说明。

在蛋白质复合物BTN2A1/101G5的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、ASP-N、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶蛋白水解后，nLC-orbitrap MS/MS分析检测到BTN2A1和抗体101G5之间的14个交联肽。

表10：BTN2A1/101G5之间交联的序列和位置

因此，我们的分析表明BTN2A1和101G5之间的相互作用包括BTN2A1上的以下氨基酸：212、213、218、220、224、229。这些结果如图14B和图16所示。

参考抗BTN2A 101G5和107G3 mAb与食蟹猴BTN2A1直系同源物存在交叉反应性

BTN2A1直系同源物存在于大多数非人灵长类动物中，包括食蟹猴(Macacafascicularis)。为了确定参考mAbs 101G5和107G3与食蟹猴BTN2A1直系同源物(cynoBTN2A1；NCBI ref.XM_015448906.1，与人BTN2A1具有93.31％的同一性)的交叉反应性，我们产生了含有cynoBTN2A1胞外域的重组Fc融合蛋白(cynoBTN2A1-Fc)，并且我们进行了ELISA测定以评估参考mAb与该蛋白质的结合。我们还使用重组人BTN2A1-Fc蛋白进行了ELISA，以比较人和食蟹猴BTN2A1直系同源物之间参考mAb的亲和力。如图13所示，101G5和107G3均能够结合cynoBTN2A1胞外域，EC₅₀分别为0.60和0.57nM，这与在huBTN2A1上获得的相应EC₅₀(分别为0.82和0.56nM)相当。

表11：用于实践的有用氨基酸和核苷酸序列的简要说明

本发明：

参考文献：

在本申请中，各种参考文献描述了与本发明相关的现有技术。这些参考文献的公开在此通过引用并入本公开。