发明内容

针对现有动物药材制剂工艺消除异味效果差、不能有效去除过敏原、灭菌损失有效成分的弊端，以及现有工艺操作繁琐、处理量小、成本较高和不利于工业化生产的不足，本发明的目的在于提供一种动物药材冻干粉的制备方法，能够有效消除动物药材的腥臭味等不良气味，去除容易导致过敏的小分子成分，同时最大程度地保留药物的有效成分，进而提高患者用药的依从性，使动物药材的临床价值得以充分发挥。本发明的技术目的是通过以下技术方案实现的：

一种动物药材冻干粉的制备方法，包括下列步骤：

A、取动物药材，粉碎，加纯化水，搅拌，混匀，得混合物；

B、取步骤A混合物，振荡离心，收集上清液，备用；

C、取步骤B上清液，以微孔滤膜滤过，收集过滤液，备用；

D、取步骤C过滤液，超滤，收集截留液，备用；

E、取步骤D截留液，冷冻干燥，得动物药材冻干粉。

所述动物药材为水蛭、蜈蚣、全蝎、地龙中的一种或几种。

优选地，步骤A加5-10倍量纯化水，搅拌10-30h，混匀，得混合物；

步骤A加6倍量纯化水，搅拌20h，混匀，控制搅拌时混合物的温度≤40℃。

优选地，步骤B中振荡离心所用振荡筛孔径为30-74μm，最佳孔径为45μm。

优选地，步骤C微孔滤膜的孔径为0.22μm。

步骤D所述超滤膜的截留相对分子质量为5000-10000Da，最佳截留相对分子质量为6000-8000Da。

优选地，步骤D超滤所得截留液保留至0.25-0.30倍量动物药材质量；

步骤E冷冻干燥的冻干曲线为：

优选地，步骤E冷冻干燥时的冻干曲线为：

本发明制备方法所得的动物药材冻干粉除了可作为冻干粉单独使用外，还可进一步作为中间体灌装成胶囊，压制成片剂，制备成颗粒剂等，从而扩大动物药材的应用范围和应用方式。

本发明动物药材冻干粉制备方法，具有以下的特点和有益效果：

1)与现有动物药材单纯添加掩味剂、填充剂矫味相比，本发明采用微孔滤膜与超滤膜组合微滤工艺，可充分滤除导致腥臭味的醛、酮、氨、三甲胺等物质，除味效果好，有效提高患者实用动物药材类药物的依从性。

2)本发明采用微孔滤膜与超滤膜组合过滤技术，不仅可以滤除导致过敏的蛋白质、多糖、多肽等物质，也可以滤除作为半抗体与体内蛋白质结合成抗原的一些致敏性的物质，提高了患者使用动物类药材的安全性。

3)针对动物生活环境及动物药材干燥过程中造成的微生物超标现象，采用微孔滤膜进行过滤除菌，可有效解决动物药材冻干粉微生物超标问题，并且可有效防止常规灭菌工艺造成的动物药材有效成分损失的弊端，提高了动物药材的临床疗效。

4)本发明动物药材冻干粉可作为中间体应用于颗粒剂、胶囊剂及片剂等多种剂型，从而扩大动物药材的应用范围和应用方式。

5)工艺实现性的角度来阐述本发明方法的新创性。

本发明动物药材冻干粉制备工艺操作简单，处理量大，有效成分损失少，生产成本低廉，降低了动物药材的制备成本，可用于规模化生产。

6)本发明制备工艺所得的动物药材冻干粉，呈片状，易粉碎，酥脆性较好，稳定性好，不易结块，利于制剂成型。

为验证本发明动物药材冻干粉制备工艺的稳定性和可行性，发明人开展了腥臭味评价试验、致敏性试验、水蛭素活性测定试验研究。需要说明的是，本发明药效学试验所选取的动物药材冻干粉为本发明具有代表性的制备方法所得样品。本发明所包含的其它制备方法所得样品所涉及的试验及其结果，限于篇幅，在此不一一穷举。

实验例1腥臭味评价试验

1.试验方法

1.1腥臭味评价方法

由10名评定员(25-30岁，男女各5名)组成的评定小组对发明方法制备所得的动物药材冻干粉口感进行评价。本实验腥臭味评定采用10分制，无腥臭味的蒸馏水计为0分，以未经处理的动物药材粗粉为10分。评定时，分别取水蛭粗粉、实施例1生产的水蛭冻干粉、蜈蚣粗粉、实施例2生产的蜈蚣冻干粉、全蝎粗粉、实施例3生产的全蝎冻干粉、地龙粗粉、实施例4生产的地龙冻干粉及对比实施例1生产的水蛭冻干粉各1g，分别装杯中，再加入10mL温水(50±2℃)，搅拌均匀，评定员根据上述评分规则进行口感评价，每次品尝1mL，品尝完一个样品需用清水漱口至口中无药味后再进行下一个样品的品尝，最终取其平均值为最后得分。评分0-2：基本无腥臭味；2-4：微有腥臭味；4-6：有腥臭味；6-8：较强腥臭味；8-10：强烈腥臭味。

1.2统计分析

采用GraphPad Prism软件版本5(GraphPad Software，美国)进行数据分析，结果以平均值±标准差表示；P＜0.05被认为有统计学差异。

2.实验结果

如表1所示，口感评价结果显示，本发明制备工艺所得各动物药材冻干粉相比其动物药材粗粉，其腥臭味均明显降低(均P<0.05)，特别是水蛭、蜈蚣冻干粉基本无腥臭味，且本发明制备方法制备所得的水蛭冻干粉腥臭味较对比实施例1水蛭冻干粉明显更轻(P<0.05)。

表1口感评价结果(n＝10，x±s)

注：与动物药材原粉比较，“*”表示P<0.05；与本发明水蛭冻干粉相比，“△”表示P<0.05。

实验例2致敏性试验

1.试验方法

1.1致敏BALB/c小鼠方案

分别将水蛭粗粉、实施例1生产的水蛭冻干粉、蜈蚣粗粉、实施例2生产的蜈蚣冻干粉、全蝎粗粉、实施例3生产的全蝎冻干粉、地龙粗粉、实施例4生产的地龙冻干粉及对比实施例1生产的水蛭冻干粉与PBS(pH＝7.4)混合，形成免疫过程中喂养小鼠的匀浆。

90只4周龄雌性BALB/c小鼠(鲁南制药集团股份有限公司提供，实验动物许可证号：SYXK(鲁)20180008)，随机分为9组：对照组、水蛭粗粉组、水蛭冻干粉组、蜈蚣粗粉组、蜈蚣冻干粉组、全蝎粗粉组、全蝎冻干粉组、地龙粗粉组、地龙冻干粉组。小鼠在SPF级动物房中饲养7d后开始免疫，致敏方式：9组小鼠在第1、2、3、7、14、21、28、35天分别灌胃0.5mL浓度为5mg/mL的PBS溶液、水蛭粗粉匀浆、水蛭冻干粉匀浆、蜈蚣粗粉匀浆、蜈蚣冻干粉匀浆、全蝎粗粉匀浆、全蝎冻干粉匀浆、地龙粗粉匀浆和地龙冻干粉匀浆，在第35天进行大剂量刺激，分别灌胃0.5mL浓度为50mg/mL的PBS溶液、水蛭粗粉匀浆、水蛭冻干粉匀浆、蜈蚣粗粉匀浆、蜈蚣冻干粉匀浆、全蝎粗粉匀浆、全蝎冻干粉匀浆、地龙粗粉匀浆和地龙冻干粉匀浆。

1.2肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒的观察

大剂量刺激后30min，将小鼠断颈处死，将3mLHank’s液注入小鼠腹腔内，轻柔地按摩1min后，解剖小鼠，吸出Hank’s液，取其中300μl至载玻片上，静置至干燥。用甲苯胺蓝染色液(武汉谷歌生物科技有限公司)染色2min，用水冲洗载玻片表面至无染色液被冲下，静置干燥，蔡司Stemi-305光学显微镜下观察腹腔灌洗液中肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

1.3统计分析

数据分析方法同实验例1。

2.试验结果

使用甲苯胺蓝染色各组小鼠的肠液，在光学显微镜下观察肠液中肥大细胞与嗜碱性粒细胞的变化，结果如表2所示。与对照组相比，各动物药材粗粉致敏小鼠后，小鼠肠液中肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒程度显著增加(均P<0.05)，说明动物药材粗粉对小鼠的致敏性。与相应动物药材粗粉相比，各动物药材冻干粉致敏小鼠后，小鼠肠液中肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒程度显著降低(均P<0.05)，说明本发明动物药材冻干粉制备方法所制备动物药材冻干粉相比动物药材粗粉对小鼠的致敏性降低。与本发明水蛭冻干粉相比，对比实施例1生产的水蛭冻干粉致敏小鼠后，小鼠肠液中肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒程度明显更高(均P<0.05)，说明本发明动物药材冻干粉制备方法所制备动物药材冻干粉相比对比实施例1生产的水蛭冻干粉对小鼠的致敏性降低。

表2细胞脱颗粒率(％，n＝10，)

注：与对照组比较，“*”表示P<0.05；与相应动物药材粗粉组比较，“△”表示P<0.05；与本发明水蛭冻干粉比较，“#”表示P<0.05。

实验例3水蛭素活性测定试验

1.材料和方法

1.1实验材料

待测样品为水蛭粗粉、实施例1生产的水蛭冻干粉及及对比实施例1制备的水蛭冻干粉，注射用生理盐水(广东天之娇药物开发有限公司)，冷冻干燥凝血酶(安徽桑原生物技术研究所)。

1.2测定方法

向2支试管(8mm×38mm)中分别加入水蛭粗粉和实施例1生产的水蛭冻干粉各1g，再分别加入0.9％生理盐水5ml，充分搅拌，浸提30min，并时时振摇，离心，量取上清液各100μl，分别加入含0.5％(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(现用现配)200μl，摇匀，置37℃水浴5min，分别滴加每1ml中含40单位的凝血酶溶液(每1分钟滴加1次，每次5μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：

式中U为每1g含凝血酶活性单位，U/g；C₁为凝血酶溶液的浓度，U/ml；C₂为供试品溶液的浓度，g/mL；V₁为消耗凝血酶溶液的体积，μl；V₂为供试品溶液的加入量，μl。中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。所有实验步骤重复3次。

1.3统计分析

数据分析方法同实验例1。

2.试验结果

如表3所示，抗凝血酶比活性检测结果显示，本发明水蛭冻干粉中抗凝血酶活性单位含量明显高于粗粉(均P<0.05)，约为15倍，并且明显高于对比实施例1生产的水蛭冻干粉(P<0.05)，表明本发明动物药材冻干粉制备方法所制备动物药材冻干粉可以更大程度地保留药物的有效成分，降低水蛭药材入药的药粉量，减少患者的服药量。

表3抗凝血酶活性单位检测结果(n＝3，)

注：与相应动物药材粗粉组比较，“*”表示P<0.05；与本发明水蛭冻干粉比较，“#”表示P<0.05

以上结果表明，本发明动物药材冻干粉制备方法相比现有技术，能够更大程度地去除动物药材腥臭气味和致敏性，提高患者用药依从性，且能有效避免动物药材有效成分损失，有利于动物药材临床疗效的充分发挥。