一种全蝎活性肽、药物组合物及其在制备抗肿瘤产品中的应用
阅读说明：本技术 一种全蝎活性肽、药物组合物及其在制备抗肿瘤产品中的应用 (Scorpion active peptide, pharmaceutical composition and application thereof in preparation of anti-tumor products ) 是由 魏永利 王少平 张加余 马传江 代龙 张贺 马睿 于 2021-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种全蝎活性肽、药物组合物及其在制备抗肿瘤产品中的应用。活性肽是动物类中药的药效物质基础,现有研究证实了全蝎活性肽对肺癌治疗效果明显,本发明目的在于提供一种高效抑制肿瘤的活性单体肽。基于上述目的,本发明从全蝎的肽提取物中筛选得到高活性的肽段,该肽段对肝癌、骨肉瘤等具有高效抑制作用,可通过多种机制抑制肿瘤细胞的生长,有望应用于抗肿瘤相关药物的研发。(The invention relates to scorpion active peptide, a pharmaceutical composition and application thereof in preparing anti-tumor products. The active peptide is the drug effect substance basis of animal traditional Chinese medicines, the existing research proves that the scorpion active peptide has obvious effect on treating the lung cancer, and the invention aims to provide the active monomer peptide for efficiently inhibiting the tumor. Based on the purposes, the invention screens the high-activity peptide segment from the scorpion peptide extract, the peptide segment has high-efficiency inhibition effect on liver cancer, osteosarcoma and the like, can inhibit the growth of tumor cells through various mechanisms, and is expected to be applied to the research and development of anti-tumor related medicines.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种全蝎活性肽、包含所述全蝎活性肽的药物组合物，及其在制备抗肿瘤产品中的应用。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。活性肽是动物类中药药效的物质基础，可经肠上皮细胞的肽转运通道，以完整的分子形式主动吸收进入人体发挥药效作用，具有吸收迅速、吸收完全等优点。近年来，国内外学者对来源于动物类中药的活性肽进行了研究。陈萍等采用胃蛋白酶对地龙进行酶解得到的活性肽，可显著降低小鼠血浆总胆固醇和甘油三酯的含量。徐藜栩等研究发现，水蛭活性肽可通过抑制p38AMPK信号通路下游的NKK3、P38等相关因子来调控脂质合成相关酶活性发挥降血脂的药效作用。上述研究报道充分证实了活性肽是动物类中药的药效物质基础。
经验证，以胃蛋白酶、胰蛋白酶连续酶解全蝎，并辅以超滤膜处理技术获得全蝎活性肽，全蝎活性肽对肺癌治疗效果明显。
研究表明，肺癌患者、大鼠和小鼠等模型均存在不同程度的条件致病菌数量增加，益生菌数量大幅减少的情况，如毛螺菌属和粪球菌属等有害菌种含量激增，而双歧杆菌属、乳酸杆菌属等有益菌含量大幅减少。肠道菌群的多样性可保证脂质的正常吸收与代谢，而调整肠道菌群则可降低肺癌患者血清内的血脂指数。这也说明肠道菌群与肺癌之间存在紧密联系。
发明内容
基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种高效抑制肿瘤的活性单体肽。本发明从全蝎的蛋白类提取物中筛选得到一种体外高效抑制肿瘤的活性肽，进一步的研究证实，所述活性肽可诱导肿瘤细胞凋亡及肿瘤细胞焦亡，有望应用于抗肿瘤相关产品的开发。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种全蝎活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如下：
(1)LERTDDPSVA；
(2)为(1)中增加、减少、替换其中一个或几种氨基酸之后仍然具有相同生理活性的氨基酸序列。
优选的方案中，所述全蝎活性肽的序列为LERTDDPSVA(LA-10)，其结构如下式1所示，等电点为11.18，疏水指数为+8.21Kcal·mol-1：
本领域公知全蝎中的多肽提取物具有良好的抗肿瘤活性，但现有技术中提供的全蝎肽提取物通常为全肽部分，是一种高分子量的混合物，实际应用过程中可能面临着失活以及生物利用度不高的缺陷。本发明设计从全蝎肽中筛选高活性的部分。上述LA-10具有较为恰当的分子量，可满足多种药物剂型对活性成分分子量的要求。并且，经验证，上述活性肽对肝癌、肉瘤具有良好的抑制作用，抑制效果显著超过全蝎肽中的其他部位。
另外，本发明还验证了上述多肽用于肺癌模型后能够影响动物模型中肠道菌群的变化，说明该多肽成分能够通过肠道菌群-抗肿瘤机制实现肿瘤抑制效果。现有研究证实，肠道菌群抗肿瘤机制包括激活机体抗肿瘤因子的释放、阻止肠内致癌物质的形成、防止基因突变、影响肿瘤端粒酶活性等多种途径实现肿瘤抑制作用，上述多肽的肠道调节作用是一种通过增强机体免疫功能实现的治疗作用，很好的体现了中药扶正固本的治疗思路。
优选的方案中，所述活性肽还包括所述活性肽的修饰物形式，所述修饰物包括但不限于为了改善水溶性等物理性质进行的成盐修饰，为了改善药理活性进行的活性基团修饰，或发光基团、示踪基团修饰等。
优选的方案中，所述活性肽还包括包含所述活性肽的融合肽，具体实例如采用穿膜肽等对LA-10修饰后的融合肽，所述穿膜肽为天然蛋白、嵌合肽及人工合成肽中的任意一种；进一步优选的，为包括但不限于TAT、R9、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、Transportan、Pep-1中的任意一种。
进一步优选的，所述穿膜肽与LA-10的连接方式为包裹、静电相互作用或共价键连接中的一种。
优选的，所述融合肽还包括连接臂，所述连接臂用于连接穿膜肽及LA-10。
进一步优选的，所述连接臂为氨基酸数目为1～6个的短肽。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述全蝎活性肽。
优选的，所述药物组合物中，包括其他具有抗肿瘤活性的成分。
优选的，所述药物组合物中，还包括用于维持所述多肽活性的缓冲试剂等。
优选的，所述药物组合物中，还包括药学上所必需的载体。
本发明第三方面，提供一种抗肿瘤产品，所述抗肿瘤产品中包括第一方面所述全蝎活性肽或第二方面所述药物组合物。
优选的，所述抗肿瘤产品述包括抗肿瘤药物、抗肿瘤保健品及抗肿瘤模型药物。
优选的，所述抗肿瘤产品包括但不限于抗脑肿瘤、抗口腔肿瘤、抗肺癌、抗胃癌、抗肝癌、抗肠道癌症、抗子宫肿瘤或抗骨肉瘤的制剂。
本发明第四方面，提供一种调节肠道菌群的产品，所述产品中包括第一方面所述活性肽或第二方面所述药物组合物。
优选的，所述调节肠道菌群的药物包括但不限于用于调节厚壁菌门、拟杆菌门、软壁菌门肠道菌群；进一步的，所述肠道菌群调节药物用于上调厚壁菌门，或下调拟杆菌门、软壁菌门。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述门相对丰度分析；
其中，图1A为门相对丰度平均值；图1B为所有样本门相对丰度；图1C为门相对丰度热图。
图2为实施例1中所述纲相对丰度分析；
其中，图2A为纲相对丰度平均值；图2B为所有样本纲相对丰度；图2C为纲相对丰度热图。
图3为实施例1中所述目相对丰度分析；
其中，图3A为目相对丰度平均值；图3B为所有样本目相对丰度；图3C为目相对丰度热图。
图4为实施例1中所述菌群差异物种分析；
其中，图4A为差异物种相对丰度平均值；图4B为所有样本差异物种相对丰度；图4C为差异物种相对丰度热图。
图5为实施例1中LA-10降低原位肺癌模型小鼠血清内IL-6含量的结果图。
图6为实施例1中LA-10降低原位肺癌模型小鼠血清内IL-8含量的结果图。
图7为实施例1中LA-10降低原位肺癌模型小鼠血清内TNF-α含量的结果图。
图8为LA-10对S180肉瘤细胞焦亡情况的形态学观察；
其中，左图为给药前的细胞形态图，右图为给药后的细胞形态图。
图9为LA-10对HepG2肝癌细胞焦亡情况的形态学观察；
其中，左图为给药前的细胞形态图，右图为给药后的细胞形态图。
图10为流式细胞仪测定LA-10促细胞焦亡结果；
其中，左图为LA-10对HepG2人肝癌细胞焦亡结果；右图为LA-10对S180肉瘤细胞焦亡结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1.活性肽LA-10的制备
(1)全蝎仿生酶解液的制备：取全蝎药材，粉碎，过50目筛，加10倍量去离子水，搅拌加热至沸，放至室温，用稀盐酸溶液调pH至1.5-2.5，加入底物量1％的胃蛋白酶并搅拌均匀，37℃保温振荡2h，再用10％氢氧化钠调pH至7.5-8.5，加入底物量2％的胰蛋白酶并搅拌均匀，50℃保温振荡4h，并时时调pH，使pH保持在8.0左右，煮沸杀酶，放至室温，5000r·min-1离心15min，分离上清液，得全蝎活性肽。
(2)全蝎活性肽质谱法全序列分析：
①样品准备：取样品加入200μl 25mM碳酸氢铵溶液溶解，加入2μL 1M DTT 60℃水浴放置>40min，再加入8μL新鲜配置的1M碘乙酰胺，室温避光放置30min。利用微量脱盐柱对样品进行脱盐处理，干燥后的样品加入10μL上样缓冲液振荡溶解待测。
②测试方法：纳升液相色谱分析柱为C18反相分析柱(50mm×15cm×3μm)；流动相A为99.9％水和0.1％甲酸混合液，流动相B为80％乙腈和0.1％甲酸混合液。液相梯度为：0-3min，2-8％B；3-42min，8-20％B；42-48min，20％-35％B；48-49min，35-100％B；49-60min，100％B。流动相流速为300nL/min。ESI+模式，采用数据依赖性扫描模式，在分辨率为70 000(AGC 3e6)的轨道阱中进行全扫描采集(m/z 200-1600)。将分离出的前20个肽信号(电荷态≥+1)母离子通过高能碰撞(HCD)破碎，标准化碰撞能(NCE)为28.0。毛细管的温度是275℃，喷雾电压是1800V。子离子在分辨率为17500(AGC 1e5)的轨道上测量。全扫描和MS-MS扫描的最大填充时间分别设置为50ms和45ms，动态排除时间设置为30s。
③数据分析：利用Peaks studio10.0软件搜索引擎对供试品的数据进行序列分析。分析参数为：母离子质量容差：10ppm，二级谱图质量容差：0.020u，可变修饰为Deamidation(NQ)，Oxidation(M)，非酶切方式。选择peptide FDR≤1％的多肽序列为鉴定到的多肽序列。通过Peaks studio10.0软件搜索引擎对供试品的质谱数据进行分析，搜库获得的相对含量前十位的多肽序列见表1，其中相对含量最高的肽序为AVFPSIVGR。
表1全蝎活性肽质谱法序列分析结果
(3)LA-10与其他9个活性肽的固相合成：
1)树脂处理
①树脂溶胀：选择Fmoc-Leu-Wang Resin(摩尔取代系数为0.6mmol/g)为起始树脂加入500mL反应柱中，加入DCM浸泡，抽干，完成树脂的溶胀。
②脱保护：加入20％哌啶的DMF溶液，通N2搅拌30min，滤干溶剂；再用DMF洗涤树脂6次，抽干，完成树脂的脱保护。
2)氨基酸偶联反应
①检测方法：采用茚三酮法对反应进程进行监测。
②具体操作过程如下：称取相应量的TBTU和保护氨基酸于烧杯中，加入DMF溶解；然后将反应液加入到树脂中，再加入DIEA，通入N2鼓吹90min左右，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，用DMF洗涤树脂3次。再向树脂中加入20％哌啶的DMF溶液，通入N2继续鼓吹30分钟，然后移除溶剂，用DMF洗涤树脂6次，即完成氨基酸的偶联。重复以上反应程序，直至完成所有保护氨基酸的缩合反应。完成后对多肽进行收缩，DMF/DCM/甲醇依次洗3遍，抽干后称取重量。
3)TFA裂解
将树脂加入事先配好的裂解液中(86％TFA/5％EDT/5％苯甲硫醚/3％苯酚/2％纯水)，搅拌150min。然后将树脂和裂解液抽离，加入乙醚使多肽充分析出。用布氏漏斗将多肽过滤，并用乙醚充分洗涤6次，纯化后得包括LA-10在内的10个肽。
2.LA-10对原位肺癌小鼠血清内IL-6、IL-8和TNF-α的影响
(1)LLC细胞培养
取Lewis肺癌细胞株(LLC)进行复苏，采用DMEM培养基添加10％胎牛血清(FBS)培养；培养条件：37℃、5％CO2的饱和湿度下进行培养，细胞融合度至70％～80％，用胰酶将其消化并传代。
(2)慢病毒转染构建LLC-GFP稳转细胞系
取绿色荧光蛋白(GFP)过表达慢病毒悬液，转染对数生长期的LLC细胞，24h后倒置荧光显微镜下观察荧光数量及强度，并更换新的培养基，48h后用G418进行筛选阳性克隆细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态，倒置荧光显微镜下观察荧光，胰蛋白酶消化后培养，筛选获得LLC-GFP稳转细胞系。
(3)C57BL/6小鼠肺部原位接种LLC-GFP细胞
将LLC-GFP细胞扩增，取对数期细胞，胰酶消化，离心，用PBS重悬，细胞计数仪计数，调整细胞数量级到1×105个/mL，与等体积Matrigel胶混匀，备用。8周龄雄性C57BL/6小鼠麻醉后左侧胸部肋弓上缘手术剪开肌肉，用微量进样器抽取混匀的细胞基质胶混合物100μL，缓慢进针向左肺叶缓慢注射混合液，缝合切口。术后观察呼吸频率，待其自然苏醒，评估小鼠体温，观察小鼠一般状态，毛发的光泽度，每日称量小鼠体重。
(4)小鼠LLC-GFP肺癌原位模型的评价
接种10d后用小动物辐射仪扫描小鼠胸部断层CT成像，观察肺部是否存在瘤体，同时用小动物活体成像系统(条件：激发波长483nm，发射波长535nm，曝光时间1.2s)观察肺部瘤体的生物学活性，进一步采用HE染色法观察左肺是否具有肿瘤组织特征，鉴定肺部原位肿瘤模型是否成功。
(5)分组与给药
造模成功后，将小鼠分为模型组，阳性药组(五氟尿嘧啶)，LA-10高剂量组，LA-10低剂量组。各组小鼠饲养方式保持不变，同时采用灌胃给药。阳性药组给药剂量为20.00mg·kg-1，LA-10高剂量组给药剂量为50.00mg·kg-1、LA-10低剂量组给药剂量为25.00mg·kg-1，各药物溶于生理盐水配制成浓度分别为2mg·mL-1，5mg·mL-1，2.5mg·mL-1的溶液，灌胃体积为0.2mL，空白组与模型组每日给予等体积的生理盐水，连续给药3周。
(6)取材与测定
①取材：小鼠取材前禁食12h，不禁水。各组小鼠用10％水合氯醛麻醉后，于腹主动脉取血，装于肝素钠抗凝试管中，3500r·min-1离心10min，上层血浆-20℃保存备用。取新鲜粪便，保存于-80℃冰箱。
②生化指标测定：采用ELISA试剂盒测定IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子数值。实验结果得出，LA-10可明显降低原位肺癌模型小鼠血清内IL-6、IL-8和TNF-α的含量，提示LA-10具有较明显的抗肿瘤活性，结果见表2。
表2 LA-10对原位肺癌模型小鼠血清内IL-6、IL-8和TNF-α含量的作用
3.LA-10对原位肺癌小鼠肠道菌群的调节作用
(1)原位肺癌模型制备：同上。
(2)分组与给药：各组小鼠饲养方式保持不变，同时采用灌胃给药。阳性药组给药剂量为20.00mg·kg-1，LA-10高剂量组给药剂量为50.00mg·kg-1、LA-10低剂量组给药剂量为25.00mg·kg-1，各药物溶于生理盐水配制成浓度分别为2mg·mL-1，5mg·mL-1，2.5mg·mL-1的溶液，灌胃体积为0.2mL，空白组与模型组每日给予等体积的生理盐水，连续给药3周。
(3)取材与测定
①取材：小鼠取材前禁食12h，不禁水。各组小鼠用10％水合氯醛麻醉后，于腹主动脉取血，装于肝素钠抗凝试管中，3500r·min-1离心10min，上层血浆-20℃保存备用。取新鲜粪便，保存于-80℃冰箱。
②小鼠菌群测定：取空白组、模型组、LA-10高剂量组小鼠新鲜粪便，提取肠道微生物DNA，根据序列中的保守区域设计相应引物，并添加样本特异性Barcode序列，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶对rRNA基因可变区(单个或连续的多个)或特定基因片段进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，接着采用lllumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，最后使用MiSeq测序仪进行2×300bp的双端测序。
(4)数据处理方法
应用SMCAP 15.1软件(USA；2016)采用组学数据处理方法进行基于有效数据的OTUs聚类分析，再对所获得的OTU进行Alpha多样性和Beta多样性计算，结合t检验，以P＜0.05为阈值得出代表序列的物种注释、物种信息和基于物种的丰度分布情况。
(5)菌群测定结果
见图1门相对丰度分析：与空白组进行比较，模型组小鼠肠道内厚壁菌门的相对丰度明显下降，而拟杆菌门、软壁菌门的相对丰度则明显增加。而经LA-10干预后，给药组小鼠肠道内厚壁菌门的相对丰度增加，而拟杆菌门、软壁菌门的相对丰度显著下降。
见图2纲相对丰度分析：与空白组比较，模型组小鼠肠道内拟杆菌纲相对丰度则明显上升，而梭状芽胞杆菌相对丰度明显下降。经LA-10干预后，给药组小鼠肠道内双歧杆菌、梭状芽胞杆菌丰度明显升高，而拟杆菌纲则明显下降。
见图3目相对丰度分析：与空白组小鼠进行比较，模型组小鼠肠道内拟杆菌目、梭菌目相对丰度明显上升，而乳杆菌目相对丰度明显下降。经LA-10干预后，给药组小鼠肠道内乳杆菌目、杆菌目丰度明显升高。而梭菌目、拟杆菌目丰度明显下降。
见图4菌群差异物种分析：与空白组比较，模型组小鼠肠道菌群组成发生明显变化，芽孢杆菌、乳酸杆菌、狄氏副拟杆菌、双歧杆菌明显下降，而马赛博斯氏菌含量乳酸菌噬菌体含量、旋毛形线虫数量则明显上升，经LA-10干预后，给药组小鼠肠道内乳酸杆菌、芽孢杆菌和双歧杆菌含量明显增加，而拟杆菌属的产酸菌、马赛博斯氏菌含量则明显下降。
实施例2体外抗肿瘤活性验证
基于HepG2细胞和S180细胞评价LA-10体外抗肿瘤活性
(1)细胞处理
1)细胞复苏
①将细胞从-80℃低温冰箱取出迅速置于37℃金属浴中使细胞冻存液完全融化；
②将细胞冻存液置于超净工作台轻轻吹打并转移至1.5mL EP管中，1000rpm，离心5min；
③离心结束后，弃上清，加入1mL PBS缓冲液轻轻混匀再次离心；
④离心完成，弃上清，加入1mL DMEM培养基重悬细胞，将细胞转移至6孔板中，补加1mL DMEM培养基，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中，次日观察细胞生长情况。
2)细胞传代
①从培养箱中取出细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，细胞形态正常且细胞融合度达80％时即可传代；
②弃去原培养基，将细胞用PBS轻轻润洗3遍，每孔加入300μL 0.25％胰酶，轻柔晃动培养板使胰酶与细胞充分接触后弃胰酶，将细胞放入培养箱消化3min，倒置显微镜下观察细胞形态变圆则证明消化结束；
③每孔加入1mL DMEM，轻柔吹打使细胞从孔底脱落并被吹散成单细胞悬液，继续补加适量DMEM调整细胞浓度，按照1：2或1：3进行细胞传代。
3)细胞计数
①取传至第二代、生长旺盛细胞，PBS清洗3遍，0.25％胰酶消化后1mL DMEM重悬制备单细胞悬液；
②取10uL细胞悬液，轻轻从盖玻片一侧加样使细胞悬液恰好充满计数板与盖玻片之间的空隙，切勿过多溢出盖玻片或过少出现空泡；
③倒置显微镜下计数，统计计数板四大方格内的细胞总数，按下列公式计算细胞密度：
细胞数(/mL)＝(4大格细胞数总和/4)×104。
同一细胞悬液连续计数3次，取平均值。
(2)CCK-8检测LA-10对肿瘤细胞毒性：本试验使用对数生长期细胞进行。96孔板中每孔加入100μL细胞悬液预培养，悬液浓度为70000个/mL。细胞长至对数生长期后弃去原培养液，加入预先配好的LA-10和其他9个合成肽溶液100μL，其浓度分别为0μM(只含溶剂DMSO)、0.5μM、2μM、8μM，并设置对照孔(不加药)和背景调零孔(只有培养液)。为防止试验孔内液体蒸发影响待测孔OD值，应在试验孔外围一圈加入同体积PBS。到达药物预定作用时间每孔加入溶液体积10％的CCK-8试剂，操作时注意避光。将96孔板左右轻轻摇匀后放到培养箱中孵育1h，使用酶标仪检测450nm吸光度。细胞抑制率计算按照说明书进行。(3)细胞形态观察：本试验使用对数生长期细胞进行。6孔板内细胞长至可进行试验水平后，PBS冲洗两次，对照组每孔加入2.5mL新鲜培养液，试验组每孔加入2μM LA-10溶液，移入培养箱中培养24h。到达预定时间取出6孔板在3目倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
(4)流式细胞术检测细胞焦亡：将对数生长期细胞消化重悬计数，稀释至1×105个/mL。6孔板内分别加入2mL细胞悬液，每组各设三个平行对照孔共三组。将6孔板转入细胞培养箱中培养。当细胞密度适当时取出平板，彻底移除原培养液。对照组每孔加入2mL新鲜培养液，给药组分别加入10μM、20μM LA-10的新鲜培养液，放入细胞培养箱中继续培养24h。到达预定给药时间，取出6孔板。吸出培养液转移至离心管中备用。PBS洗涤一次，加入胰酶消化液。应注意防止胰酶过度消化，损伤细胞，影响检测结果。加入收集的各孔培养液加回原孔中，终止胰酶消化。将细胞悬液离心后保留细胞沉淀，用PBS重悬并计数。取10万重悬的细胞，1000g离心5min，保留底部细胞沉淀。按说明书要求逐步添加荧光染料染色。用铝箔纸包裹避光室温孵育20min后，转至冰上保存。1h内完成流式上机检测。
(5)实验结果
1)LA-10对肿瘤细胞抑制率的影响
HepG2人肝癌细胞和S180肉瘤细胞经不同浓度的10个活性肽分别作用24h、48h、72h后，获得各组在450nm吸光度OD值，计算细胞抑制率。药物作用时间一定，不同浓度LA-10对细胞抑制率与对照组相比有极显著升高(P<0.01)，如表3所示。相同的给药浓度，与培养24h比较，2μM及8μM组48h与72h的抑制效果极显著(P<0.01)，如表4所示。因此细胞毒性试验结果提示，LA-10对HepG2人肝癌细胞和S180肉瘤细胞的抑制率随浓度及作用时间的升高而增加，呈时间浓度依赖。
表3 LA-10对HepG2人肝癌细胞抑制率结果
表4 LA-10对S180肉瘤细胞抑制率结果
本实施例中，还针对其他9种活性肽的抗肿瘤效果进行了考察，对比表3与表5活性肽对肝癌细胞的抑制率、表4和表6中对S180肉瘤细胞抑制率，可以看出，LA-10相比其他活性肽具有更好的抗肿瘤活性。考虑到LA-10在全蝎活性肽中具有较高的质量占比，这启示LA-10可能是全蝎活性肽中发挥抗肿瘤效果的重要位点，对于全蝎活性肽相关抗肿瘤药物的开发具有重要指导意义。
表5其他9个活性肽的对HepG2人肝癌细胞72h抑制率结果
表6其他9个活性肽的对S180肉瘤细胞72h抑制率结果
2)细胞形态观察
LA-10(2μM)作用于HepG2人肝癌细胞和S180肉瘤细胞24h后，光镜结果显示，对照组细胞呈不规则的鳞状上皮形态，给药组细胞形态发生明显变化。其中一些细胞体积缩小变圆，与周围细胞脱离连接，细胞质密度显著升高增加，呈现典型的凋亡细胞特征，提示LA-10可能通过促进细胞凋亡抑制HepG2人肝癌细胞和S180肉瘤细胞的生长；部分细胞肿胀膨胀，细胞膜有许多突出物，提示LA-10还可通过诱导焦亡抑制细胞的生长。
3)细胞焦亡情况检测
LA-10(2μM)处理HepG2人肝癌细胞和S180肉瘤细胞24h后，流式细胞术检测结果显示，LA-10使HepG2人肝癌细胞和S180肉瘤细胞发生焦亡。LA-10(2μM)处理HepG细胞发生焦亡率为(7.67±0.45)％，LA-10(2μM)处理S180肉瘤细胞焦亡率为(15.4±1.2)％。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。