一种基于腺嘌呤的花菁探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种基于腺嘌呤的花菁探针及其制备方法和应用 (Cyanine probe based on adenine and preparation method and application thereof ) 是由 刘晓骞 秦军 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明属于化学分析测试领域,具体涉及一种基于腺嘌呤的花菁探针及其制备方法和应用。先通过四步反应合成CY5.5染料。随后将CY5.5染料与腺嘌呤在N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)条件下反应,所得粗品通过薄层色谱法分离,得到最终产物。本发明得到的花菁探针具有优良的光学性能和识别血红蛋白的作用,有利于对血红蛋白的检测。(The invention belongs to the field of chemical analysis and test, and particularly relates to an adenine-based cyanine probe and a preparation method and application thereof. CY5.5 dye is synthesized by four-step reaction. The CY5.5 dye is then reacted with adenine under N, N' -Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) conditions and the resulting crude product is separated by thin layer chromatography to give the final product. The cyanine probe obtained by the invention has excellent optical performance and hemoglobin recognition effect, and is beneficial to detection of hemoglobin.)
技术领域
本发明属于化学分析测试领域，具体涉及一种基于腺嘌呤的花菁探针及其制备方法和应用。
背景技术
血红蛋白(Hb)是一种金属蛋白，存在于红细胞中，血红蛋白对于将氧气从肺部运输到身体各个部位以及将二氧化碳从各个部分运送到肺部至关重要。血液中的血红蛋白水平与白血病、贫血、心脏病等许多临床疾病相关。由于血液中血红蛋白水平不足，全世界每年有许多人受到影响，其中大部分为妇女和儿童。因此，准确测定血液中的Hb含量对控制一些临床疾病具有重要意义。
设计与合成对血红蛋白具有选择性识别功能的化学传感器近年来备受关注，已经成为化学科学、环境科学和生命科学等领域的研究热点。荧光法由于其高选择性和高灵敏度、良好的重现性和准确度、快速和简单而优于高效液相色谱法、电化学法、比色法和化学发光法等传统方法，因此荧光法在对于血液中Hb水平的定量方面具有优势。然而，目前很多荧光传感器使用了金属络合物、SQDs等，选择性和灵敏度较低，毒性较大。因此，目前研究出一种简便、经济、灵敏、低毒的荧光传感器是非常必要的。
发明内容
为了克服现有荧光传感器使用金属络合物、SQDs等，选择性和灵敏度较低，毒性较大的不足，本发明提供了一种基于腺嘌呤的花菁探针，该探针的结构式如下式所示：
本发明还提供了一种基于腺嘌呤的花菁探针的制备方法：
(1)将2-萘肼盐酸盐与3-甲基-2-丁酮在乙酸和氮气保护条件下回流2～2.5小时分离提纯得到化合物1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚。
(2)将步骤(1)中得到的1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚与6-溴己酸在乙腈和氮气保护条件下回流24～36小时分离提纯得到化合物3-(5-羧基戊基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓。
(3)将步骤(2)中得到的3-(5-羧基戊基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓(中间体2)与N-[(1E，3E)-3-(苯基亚氨基)丙-1-烯-1-基]苯胺在醋酸与醋酸酐(1:1)并且氮气保护条件下回流3～4小时，分离提纯得到化合物3-(5-羧基戊基)-1,1-二甲基-2-((1E，3E)-4-(N-苯基乙酰胺)丁烷-1,3-二烯-1-基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓。
(4)将步骤(3)中得到的3-(5-羧基戊基)-1,1-二甲基-2-((1E，3E)-4-(N-苯基乙酰胺)丁烷-1,3-二烯-1-基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓与3-(5-羧基戊基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓在醋酸与吡啶(1:1)并且氮气保护条件下回流1～2小时，经过分离提纯得到蓝绿色固体CY5.5染料；
(5)将步骤(4)中得到的蓝绿色固体CY5.5染料与腺嘌呤首先按1:2的摩尔当量比在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的二氯甲烷溶液中室温搅拌0.5～1小时，然后加入N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)常温反应30～48小时，其中，DCC与DMAP的当量比为1.5:2，最后通过薄层色谱法提纯得到最终产品11。其中,展开剂为体积比为30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物。
以上制备方法的化学反应为：
本发明还提供了一种上述染料探针的应用：所制备的基于腺嘌呤的花菁探针在十二烷基苯磺酸钠(SDBS)作为溶液的条件下，快速简便地检测血红蛋白。
本探针中采用了3-(5-羧基戊基)-2-((1E，3E，5E)-5-(3-(5-羧基戊基)-1,1-二甲基-1,3-二氢-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基)五-1,3-二烯-1-基)-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓作为分子内电子的给体，增大了分子的共轭，有利于电子在分子内的传导，使荧光波长发生红移至720nm左右。化合物9(CY5.5染料)是一种共轭的荧光基团，收到特定波长的激发能够产生强的荧光。当特异性的能够识别血红蛋白的腺嘌呤与化合物9通过酰胺键链接后，形成了最终花菁探针。它在识别血红蛋白后，荧光强度有显著了的增强，从而达到了检测血红蛋白的目的。
所制备探针的结构中，以腺嘌呤作为血红蛋白识别的靶点，腺嘌呤结构的氮杂六元环中的氮原子可提供孤对电子，提供配位；使得基于腺嘌呤的花菁探针能够识别血红蛋白。
本发明解决了基于腺嘌呤的花菁探针对血红蛋白识别的问题，从反应现象上看，加入基于腺嘌呤的花菁探针后可以引起荧光增强。
本发明的有益效果在于：本发明原料容易获得，合成方法较为简单，反应条件易于控制，反应结束后通过简单的后处理就能够得到纯的产物；作为血红蛋白检测的化学传感器，基于腺嘌呤的花菁探针灵敏度高、可以识别出血红蛋白，例如在4×10-3mol/L的十二烷基苯磺酸钠(SDBS)溶液中可以识别血红蛋白。
附图说明
：图1为实施例1在血红蛋白溶液中加入制备的探针前后荧光强度变化的光谱图。
图2为实施例1制备的探针以4×10-3mol/L浓度在SBDS中与不同浓度的血红蛋白作用后的荧光光谱图。
图3为实施例1制备的探针的氢谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述，但不限于此。
实施例1：
(1)将原料1(0.5000g，2.57mmol)、原料2(0.2214g，2.57mmol)在乙酸(8ml)和氮气保护条件下120℃回流2.5小时，反应结束后除去溶剂，用石油醚和乙酸乙酯的展开剂(体积比4:1)过硅胶柱，得到中间体3(0.5100g，2.44mmol，产率为94.94％)。
(2)将中间体3(0.5100g，2.44mmol)、原料4(2.2700g，11.6mmol)在乙腈(8ml)和氮气保护条件下110℃回流36小时，除去溶剂后用3ml二氯甲烷溶解随后加入3ml乙醚析出固体后过滤收集固体5(0.6610g，2.04mmol，产率为83.61％)。
(3)将中间体5(0.6610g，2.04mmol)、中间体6(0.4986g，2.24mmol)溶于8mL乙酸和8mL乙酸酐的混合溶液，在氮气下120℃回流4小时，反应结束后除去溶剂，得到粗品固体中间体7(1.0105g，2.04mmol，产率为99.99％)。
(4)将中间体7(1.0105g，2.04mmol)与中间体8(0.6610g，2.04mmol)溶于8mL乙酸和8mL吡啶的混合溶液，在氮气下120℃回流2小时，反应结束后除去溶剂，用二氯甲烷和甲醇的展开剂(体积比10:1)过硅胶柱，得到蓝色固体中间体9(0.9748g，1.43mmol，产率为70.10％)。
(5)将步骤(4)中得到的中间体9(0.0683g，0.10mmol)与7H-嘌呤-6-胺(0.0270g，0.2mmol)溶解于4-二甲氨基吡啶(0.0252g，0.2mmol)的二氯甲烷溶液中常温搅拌1小时，随后加入二环己基碳二亚胺(0.0315g，0.15mmol)继续反应48小时，减压除去溶剂后得到蓝色固体，薄层色谱法(展开剂体积比：二氯甲烷：甲醇＝30:1)分离提纯后得到最终产品(0.0606g，0.07mmol，产率为70.00％)。
具体应用方法为：做两组平行实验，对照组：向96孔板中加入2uL浓度为10mgml-1血红蛋白、198uL的4mM十二烷基苯磺酸钠(SDBS)溶液；实验组：向96孔板中加入2uL浓度为10mgml-1血红蛋白、196uL的4mM十二烷基苯磺酸钠(SDBS)溶液和2uL的基于腺嘌呤的花菁探针(浓度为4×10-3mol/L)，两组平行实验重复三次。将每个孔的溶液混合均匀，测出每孔中溶液的荧光强度。结果显示：含花菁探针溶液的荧光强度在720nm处是没有花菁探针溶液的3500倍；从而表明花菁探针对于血红蛋白具有识别作用。
图1为实施例1在血红蛋白溶液中加入制备的探针前后荧光强度变化的光谱图。图中显示，滴加探针前后，血红蛋白溶液荧光强度变化情况，当加入制备的探针后，在720nm处的荧光强度发生了显著的升高(箭头所指曲线)；而在该探针没有加入前，血红蛋白溶液荧光的很弱，从而显示出在该体系中探针对于血红蛋白具有识别作用。
图2为实施例1制备的探针以4×10-3mol/L的浓度在SDBS中与不同浓度的血红蛋白作用后的荧光光谱图。图中显示，随着血红蛋白浓度的降低，探针的荧光强度逐渐减弱。在其最终浓度为10μg/L时，在720nm处的荧光峰仍能与不加蛋白背景荧光曲线区别，得出该探针对血红蛋白的检测线为10μg/L。
图3为实施例1制备的基于腺嘌呤的花菁探针的氢谱。1H NMR(400MHz,Chloroform-d):δ8.52(s,1H),8.39(s,1H),8.14(q,J＝8.0Hz,6H),7.96-7.92(m,4H),7.62(t,J＝7.7Hz,2H),7.48(t,J＝7.5Hz,2H),7.37(d,J＝8.8Hz,2H),6.98(t,J＝12.5Hz,1H),6.53(d,J＝13.6Hz,2H),4.41-4.36(m,2H),4.23(t,J＝7.7Hz,2H),4.00(d,J＝6.8Hz,1H),2.52(t,J＝7.1Hz,4H),2.04(s,3H),1.89(d,J＝7.5Hz,1H),1.61(q,J＝8.2Hz,8H),1.38(d,J＝6.7Hz,4H),1.30-1.20(m,12H),0.88(t,J＝7.7Hz,3H).
实施例2
(1)将原料1(0.2500g，1.29mmol)、原料2(0.1107g，1.29mmol)在乙酸(4ml)和氮气保护条件下115℃回流2小时，反应结束后除去溶剂，用石油醚和乙酸乙酯的展开剂(体积比4:1)过硅胶柱，得到中间体3(0.2318g，1.11mmol，产率为86.05％)。
(2)将中间体3(0.2318g，1.11mmol)、原料4(1.0293g，5.3mmol)在乙腈(4ml)和氮气保护条件下105℃回流30小时,除去溶剂后用1.5ml二氯甲烷溶解随后加入1.5ml乙醚析出固体后过滤收集固体5(0.3305g，1.02mmol，产率为91.89％)。
(3)将中间体5(0.3305g，1.02mmol)、中间体6(0.2493，1.12mmol)溶于4mL乙酸和4mL乙酸酐的混合溶液，在氮气下115℃回流3.5小时，得到粗品固体中间体7(0.5053g，1.02mmol，产率为99.99％)。
(4)将中间体7(0.5053g，1.02mmol)与中间体8(0.3305g，1.02mmol)溶于4mL乙酸和4mL吡啶的混合溶液，在氮气下115℃回流1.5小时，反应结束后除去溶剂，用二氯甲烷和甲醇的展开剂(体积比10:1)过硅胶柱，得到蓝色固体中间体9(0.4874g，0.71mmol，产率为69.87％)。
(5)将步骤(4)中得到的中间体9(0.0342g，0.05mmol)与7H-嘌呤-6-胺(0.0135g，0.1mmol)溶解于4-二甲氨基吡啶(0.0126g，0.1mmol)的二氯甲烷溶液中常温搅拌1小时，随后加入二环己基碳二亚胺(0.0158g，0.08mmol)继续反应36小时，减压除去溶剂后得到蓝色固体，薄层色谱法(展开剂体积比：二氯甲烷：甲醇＝30:1)分离提纯后得到最终产品0.0303g。(0.0303g，0.033mmol，产率为66.00％)。
实施例3
(1)将原料1(0.1250g，0.645mmol)、原料2(0.0554g，0.645mmol)在乙酸(2ml)和氮气保护条件下110℃回流2小时，反应结束后除去溶剂，用石油醚和乙酸乙酯的展开剂(体积比4:1)过硅胶柱，得到中间体3(0.1172g，0.56mmol，产率为86.82％)。
(2)将中间体3(0.1172g，0.56mmol)、原料4(0.5071g，2.6mmol)在乙腈(2ml)和氮气保护条件下100℃回流24小时,除去溶剂后用1.0ml二氯甲烷溶解随后加入1.0ml乙醚析出固体后过滤收集固体5(0.1653g，0.51mmol，产率为91.07％)。
(3)将中间体5(0.1653g，0.51mmol)、中间体6(0.1247，0.56mmol)溶于2mL乙酸和2mL乙酸酐的混合溶液，在氮气下110℃回流3小时，得到粗品固体中间体7(0.2527g，0.51mmol，产率为99.99％)。
(4)将中间体7(0.2527g，0.51mmol)与中间体8(0.1653g，0.51mmol)溶于2mL乙酸和2mL吡啶的混合溶液，在氮气下110℃回流1小时，反应结束后除去溶剂，用二氯甲烷和甲醇的展开剂(体积比10:1)过硅胶柱，得到蓝绿色固体中间体9(0.2437g，0.36mmol，产率为70.59％)。
(5)将步骤(4)中得到的中间体9(0.0171g，0.025mmol)与7H-嘌呤-6-胺(0.0068g，0.05mmol)溶解于4-二甲氨基吡啶(0.0063g，0.05mmol)的二氯甲烷溶液中常温搅拌0.5小时，随后加入二环己基碳二亚胺(0.0079g，0.04mmol)继续反应30小时，减压除去溶剂后得到蓝色固体，薄层色谱法(展开剂体积比：二氯甲烷：甲醇＝30:1)分离提纯后得到最终产品0.0152g(0.0152g，0.016mmol，产率为64.00％)。
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