具体实施方式

本发明提供了一种临床级人脐带间充质干细胞资源库多级库的构建方法，所述多级库包括种子库、主库、工作库和产品库；所述构建方法包括以下步骤：

将脐带剖开，清洗，去除血管，在第一冲洗液和第二冲洗液中依次浸泡，得到预处理的脐带；所述第一冲洗液包括体积百分含量为80％的无血清培养基和体积百分含量为20％的青链霉素混合液；所述第二冲洗液包括体积百分含量为90％的无血清培养基和体积百分含量为10％的青链霉素混合液；

将预处理的脐带切成1～2mm³的组织块，置于6孔板中，在二氧化碳培养箱中贴壁培养20min，加入无血清培养基进行培养，待细胞融合率达到80～90％后，消化，得到原代细胞；

将原代细胞按照0.8～1万/cm²的接种密度接种到6孔板，加入无血清培养基，培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P0代细胞；

将P0代细胞按照0.8～1万/cm²的接种密度接种至培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P1代细胞；

将P1代细胞按照0.8～1万/cm²的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养2～3d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P2代细胞；将P2代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到种子库；

将P2代细胞按照0.5～0.8万/cm²的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P3代细胞；将P3代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到主库；

将P3代细胞按照0.5～0.8万/cm²的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P4代细胞；将P4代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到工作库；

将P4代细胞按照0.5～0.8万/cm²的接种密度接种到细胞工厂中，加入无血清培养基进行培养4～5d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P5代细胞；将P5代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到产品库。

本发明的脐带优选来自健康供体；所述健康供体需要无家族传染病史、无吸毒史，检测呈阴性的项目需要包括：淋巴细胞白血病病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、巨细胞病毒IgM抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、人类免疫缺陷病毒抗体和抗原、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、人类免疫缺陷病毒核酸和EBV病毒IgM抗体。在本发明中，所述供体的年龄优选在20～35之间。按照上述条件筛选得到供体的脐带后，本发明优选剪取5～10cm脐带。本发明剪取脐带后，优选使用止血夹夹住脐带两头，4℃保存运输。对脐带进行预处理前，本发明优选打开止血夹，使用生理盐水将脐带的血液冲洗干净。冲洗后，本发明将脐带剖开，清洗，去除血管，在第一冲洗液和第二冲洗液中依次浸泡，得到预处理的脐带；所述第一冲洗液包括体积百分含量为80％的无血清培养基和体积百分含量为20％的青链霉素混合液；所述第二冲洗液包括体积百分含量为80％的无血清培养基和体积百分含量为10％的青链霉素混合液。本发明在剖开前，优选将脐带切为2cm的条状。剖开后，本发明优选使用生理盐水进行清洗，清洗的次数优选为2～3次，保证血液被清洗干净。本发明所述去除血管优选为去除3根血管，包括2根动脉和1根静脉。本发明冲洗液的配制用原料包括无血清培养基和青链霉素混合液，本发明对这两种原料的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述青链霉素混合液优选为青链霉素混合液(100×)细胞培养专用，购自Gibco，型号为15140-122。在本发明中，所述无血清培养基优选购自Gibco，型号为8122159。本发明所述第一冲洗液和第二冲洗液中两种组分不同的比例的设置进行两次浸泡可以保证血液尽可能洗去，有利于原代细胞从组织中的爬出，并且有利于之后组织块贴壁。在本发明中，所述浸泡的时间优选分别为3～5min。本发明优选使用第一冲洗液浸泡10min后再用第二冲洗液浸泡10min。

得到预处理的脐带后，本发明将预处理的脐带切成1～2mm³的组织块，置于6孔板中，在二氧化碳培养箱中贴壁培养20min，加入无血清培养基剂型培养，待细胞融合率达到80～90％后，消化，得到原代细胞。在本发明中，所述组织块在6孔板优选每个孔中放入20～25个。本发明优选将组织块均匀地放入6孔板的每个孔中。本发明加入无血清培养基后，优选进行过夜培养，本发明过夜培养后，优选再加入无血清培养基，作用是补充挥发的无血清培养基。在本发明中，所述6孔板的每个孔中，优选加入1mL无血清培养基。再加入无血清培养基后，本发明继续进行培养4～10d，待细胞融合率达到80～90％后，进行消化。在本发明中，所述消化的时间优选为3min。本发明所述消化优选在室温进行，所述室温优选为20～25℃，下文所述消化的条件和这里相同，后文不再赘述。本发明所述消化液优选购自GIBCO，型号25200-056。本发明得到原代细胞后，优选取部分原代细胞做流式检测。在本发明中，所述流式检测优选为对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR进行检测，检测干细胞的纯度是否符合干细胞特性。

将原代细胞按照0.8～1万/cm²的接种密度接种到6孔板，加入无血清培养基，培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P0代细胞。在本发明中，所述6孔板的每个孔中，优选加入1.5mL无血清培养基，消化液优选每孔加入0.3mL。本发明所述无血清培养基和消化液的来源优选同上文，下文所述无血清培养基和消化液的来源也同上文，后文不再赘述。在本发明中，所述消化的时间优选为3min。在本发明中，所述离心的条件为：2000～3000转/min，5min。在本发明中，得到P0代细胞前，优选还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测。

将P0代细胞按照0.8～1万/cm²的接种密度接种至培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P1代细胞。在本发明中，所述培养瓶优选为T25培养瓶。每个培养瓶中优选添加5mL无血清培养基。在本发明中，当使用T25培养瓶时，消化液的添加量优选为1mL，消化的时间优选为3min。在本发明中，所述离心的条件为：2000～3000转/min，5min。在本发明中，得到P1代细胞前，优选还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测。

将P1代细胞按照0.8～1万/cm²的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养2～3d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P2代细胞；将P2代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到种子库。在本发明中，所述培养瓶优选为T75培养瓶。每个培养瓶优选加入15mL无血清培养基。在本发明中，所述消化使用的消化液的体积优选为每瓶T75培养瓶添加2mL。本发明所述消化的时间优选为3min。在本发明中，所述离心的条件为：2000～3000转/min，5min。在本发明中，得到P2代细胞前，优选还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测，以及对细胞进行活率检测、流式检测和传染病核酸检测；所述流式检测包括对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR进行检测(本发明增加了表面标记物的数量，可以获得更加准确的结果)；所述传染病核酸检测的指标包括新型冠状病毒核酸、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、梅毒螺旋体抗体和人类免疫缺陷病毒核酸。本发明优选取20万细胞做活率检测、流式检测和传染病核酸检测。在本发明中，活率检测优选保持活率在90％以上，流式检测要求：CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性、HLA-DR为阴性。传染病核酸检测要求上述指标检测均呈阴性。在本发明中，所述种子库中P2代干细胞的冻存密度优选为每毫升细胞冻存液300万个干细胞。在本发明中，所述冻存的条件优选为：4℃保持15min，1℃/min降至-7℃，60℃/min降至-60℃，30℃/min升至-30℃，1℃/min降至-90℃。在本发明中，所述冻存前，优选还包括：在冻存管上贴防冻二维码进行标记。

将P2代细胞按照0.5～0.8万/cm²的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P3代细胞；将P3代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到主库。在本发明中，所述培养瓶优选为T175培养瓶。每个培养瓶优选加入25mL无血清培养基。当使用T175培养瓶，每个培养瓶加入的消化液优选为4mL。在本发明中，所述消化的时间优选为3min。在本发明中，所述离心的条件优选为：2000～3000转/min，5min。在本发明中，得到P3代细胞前，还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测，以及对细胞进行活率检测、流式检测和传染病核酸检测；所述流式检测包括对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR进行检测(本发明增加了表面标记物的数量，可以获得更加准确的结果)；所述传染病核酸检测的指标包括新型冠状病毒核酸、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、梅毒螺旋体抗体和人类免疫缺陷病毒核酸。本发明优选取20万细胞做活率检测、流式检测和传染病核酸检测。在本发明中，活率检测优选保持活率在90％以上，流式检测要求：CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性和HLA-DR为阴性。传染病核酸检测要求上述指标检测均呈阴性。在本发明中，所述主库中P3代干细胞的冻存密度优选为每毫升细胞冻存液1000万个干细胞。在本发明中，所述冻存的条件优选为：4℃保持15min，1℃/min降至-7℃，60℃/min降至-60℃，30℃/min升至-30℃，1℃/min降至-90℃。在本发明中，所述冻存前，优选还包括：在冻存管上贴防冻二维码进行标记。

将P3代细胞按照0.5～0.8万/cm²的接种密度接种到培养瓶中，加入无血清培养基进行培养3～4d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P4代细胞；将P4代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到工作库。在本发明中，所述培养瓶优选为T175培养瓶。每个培养瓶优选加入25mL无血清培养基。当使用T175培养瓶，每个培养瓶加入的消化液优选为4mL。在本发明中，所述消化的时间优选为3min。在本发明中，所述离心的条件为：2000～3000转/min，5min。在本发明中，得到P4代细胞前，还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测，以及对细胞进行活率检测、流式检测和传染病核酸检测；所述流式检测包括对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b和CD19进行检测(本发明增加了表面标记物的数量，可以获得更加准确的结果)；所述传染病核酸检测的指标包括新型冠状病毒核酸、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、梅毒螺旋体抗体和人类免疫缺陷病毒核酸。本发明优选取20万细胞做活率检测、流式检测和传染病核酸检测。在本发明中，活率检测优选保持活率在90％以上，流式检测要求：CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性、HLA-DR为阴性、CD11b为阴性和CD19为阴性。传染病核酸检测要求上述指标检测均呈阴性。在本发明中，所述工作库中P4代干细胞的冻存密度优选为每毫升细胞冻存液1000万个干细胞。在本发明中，所述冻存的条件为：4℃保持15min，1℃/min降至-7℃，60℃/min降至-60℃，30℃/min升至-30℃，1℃/min降至-90℃。在本发明中，所述冻存前，还包括：在冻存管上贴防冻二维码进行标记。

将P4代细胞按照0.5～0.8万/cm²的接种密度接种到细胞工厂中，加入无血清培养基进行培养4～5d，待融合度达到90～95％，消化，离心，去上清，得到P5代细胞；将P5代细胞重悬于冻存液，冻存，构建得到产品库。本发明所述细胞工厂优选为10层的细胞工厂。在本发明中，每个细胞工厂优选添加100mL消化液，消化的时间优选为3min。培养基添加量是什么情况呢？在本发明中，得到P5代细胞前，优选还包括对上清进行内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测，以及对细胞进行活率检测、流式检测和传染病核酸检测；所述流式检测包括对CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b和CD19进行检测(本发明增加了表面标记物的数量，可以获得更加准确的结果)；所述传染病核酸检测的指标包括新型冠状病毒核酸、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、梅毒螺旋体抗体和人类免疫缺陷病毒核酸。本发明优选取20万细胞做活率检测、流式检测和传染病核酸检测。在本发明中，活率检测优选保持活率在90％以上，流式检测要求：CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性、HLA-DR为阴性、CD11b为阴性和CD19为阴性。传染病核酸检测要求上述指标检测均呈阴性。在本发明中，所述产品库中P5代干细胞的冻存密度优选为每毫升细胞冻存液1000万个干细胞。在本发明中，优选取1000万P5代细胞，按每管100万细胞冻存10支，作为质控品。在本发明中，所述冻存的条件为：4℃保持15min，1℃/min降至-7℃，60℃/min降至-60℃，30℃/min升至-30℃，1℃/min降至-90℃。在本发明中，所述离心的条件为：2000～3000转/min，5min。在本发明中，所述冻存前，还包括：在冻存管上贴防冻二维码进行标记。

本发明提供的构建方法由采集、分离、培养和冻存组成，临床级人脐带间充质干细胞库由种子库、主库、工作库和产品库组成。

具体组成优选如下：

种子库：P2代干细胞，2ml冻存管，300万个干细胞/管，1ml细胞冻存液；

主库：P3代干细胞，2ml冻存管，500万个干细胞/管，1ml细胞冻存液；

工作库：P4代干细胞，2ml冻存管，1000万个干细胞/管，1ml细胞冻存液；

产品库：P5代干细胞，5ml冻存管，5000万个干细胞/管，5ml细胞冻存液；

结构：4级库结构，种子库：P2代细胞，作为主库原料。

主库：P3代细胞，作为工作库原料。

工作库：P4代细胞，用于产品库原料或直接用于临床

产品库：P5代细胞，直接用于临床。

本发明提供一种临床级人脐带间充质干细胞资源库多级库的构建方法，通过对各阶段细胞接种密度进行设置，经多次验证试验，可以让细胞在规定的时间到达到规定的融合度，与传统的比例扩增的方式，可以更加精准的控制细胞扩增的代次，以达到细胞质量的统一。原代细胞分离方法可以让原代细胞在规定的时间内完成分离，提高了之后细胞库内的细胞活率(目前医院按照一个月20例左右的脐带进行试验，90％以上的脐带都可以分离出干细胞)。通过对各个指标进行检测，即进行细胞安全性指标的检测：支原体、内毒素、厌氧菌、需氧菌、传染病指标的检测，要求都为阴性。细胞干性指标：活率在90％以上，流式检测CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性、HLA-DR为阴性、CD11b为阴性、CD19为阴性。上述检测环节，保证入库的细胞能符合中国药典对生物制剂的检测要求。细胞的冻存条件的设置保证了细胞在冻存后的活率。本发明提供了构建方法各个步骤的关键参数、检测的关键点、规模化的产品库概念和二维码管理概念，为未来干细胞临床化应用奠定基础。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种临床级人脐带间充质干细胞资源库多级库的构建方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

种子库建立方案：

供体筛选：供体检测项目：淋巴细胞白血病病毒抗体检测、丙型肝炎病毒抗体、巨细胞病毒IgM抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、人类免疫缺陷病毒抗体和抗原、梅毒螺旋体抗体、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、人类免疫缺陷病毒核酸、EBV病毒IgM抗体检测为阴性，无家族传染病史、无吸毒史、年龄在20～35之间的健康女性。

原料采集：剪取脐带5～10cm，使用一次性止血夹分别夹住脐带两头，将脐带装入医用自封袋中，贴供体条码，装入4℃转运箱，传染病检测报告、知情同意和采集记录表装入材料袋转运至制备间。

原料预处理：打开止血夹，使用生理盐水冲洗血液净，使用医用手术刀将脐带切为长度为2cm的条状，使用剪子将脐带剖开，使用生理盐水冲洗2～3次，将血液洗净。使用镊子将脐带中的3根血管(2根动脉，1根静脉)剔除，配置2X冲洗液：80％无血清培养基+20％双抗(青链霉素混合液(100×)细胞培养专用)共30ml，配置1X冲洗液：90％无血清培养基+10％双抗共计30ml，使用2X冲洗液浸泡10min后再用1X冲洗液浸泡10min。

干细胞分离：使用手术刀将脐带切为1～2mm³的组织块，6孔板每个孔均匀放入20～25个组织块，放入二氧化碳培养箱20min贴壁，每个孔加入37℃的无血清培养基1ml，放入二氧化碳培养箱过夜，第二天加入培养基1ml。

扩增培养：原代细胞融合率到达80％～90％后，使用消化液室温消化3min，取5～10万细胞做流式检测，按接种密度0.8～1万/cm²，转入6孔板中，每孔加入无血清培养基1.5ml，放入二氧化碳培养箱培养3-4天，待融合度达到90～95％，使用消化液0.3ml室温消化3min，重悬液2000～3000转/min离心5min，去上清，取上清液做内毒素、支原体、厌氧菌和需氧菌的检测，细胞(P0代)按接种密度0.8～1万/cm²接种至T25培养瓶中，每瓶加入无血清培养基5ml，培养3～4天，待融合度达到90～95％，使用消化液1ml室温消化3min，重悬液2000～3000转/min离心5min，去上清，取上清液做和原代相同检测，细胞(P1代)按接种密度0.8～1万/cm²接种至T75培养瓶中，每瓶加入培养基15ml，待融合度达到90～95％，使用消化液2ml室温消化3min，重悬液2000～3000转/min离心5min，去上清，取上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体和内毒素检测，取20万细胞做活率、计数、流式检测、检测新型冠状病毒核酸、乙型肝炎病毒核酸、丙型肝炎病毒核酸、梅毒螺旋体抗体、人类免疫缺陷病毒核酸。取1000万细胞(P2代)，按接种密度0.5～0.8万/cm²接种至10个T175培养瓶中，其余按每毫升冻存液重悬300万细胞加入冻存液重悬，使用冻存程序：4℃保持15min，1℃/min降至-7℃，60℃/min降至-60℃，30℃/min升至-30℃，1℃/min降至-90℃。冻存5～10管，每管贴防冻二维码。

主库建立方案：

种子库建立过程中获得装有P2细胞的T175培养瓶10个，培养3～4天，待融合度达到90～95％，加入消化液4ml室温消化3min，重悬液2000～3000转/min离心5min，去上清，取上清做同种子库的检测项目，取20万细胞做活率、计数、流式，取2000万细胞，按接种密度0.5～0.8万/cm²接种至20个T175培养瓶中，其余按每毫升冻存液重悬500万细胞加入冻存液重悬，使用同种子库的冻存程序。冻存10～15管，每管贴防冻二维码。

工作库建立方案：

主库建立过程中获得装有P3细胞的T175培养瓶20个，培养3～4天，待融合度达到90～95％，每瓶加入消化液4ml室温消化3min，重悬液2000～3000转/min离心5min，去上清，取上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体和内毒素检测，取20万细胞做活率、计数、流式。取2000万细胞，按接种密度0.5～0.8万/cm²接种至2个10层细胞工厂中，其余按每毫升冻存液重悬1000万细胞加入冻存液重悬，使用同种子库的冻存程序。冻存10～15管，每管贴防冻二维码。

产品库建立方案：

工作库建立过程中获得装有P4细胞的10层细胞工厂2个，培养4～5天，待融合度达到90～95％，每个工厂加入消化液100ml室温消化3min，重悬液2000～3000转/min离心5min，去上清，取上清液进行厌氧菌、需氧菌、支原体和内毒素检测，取20万细胞做活率、计数、流式。取1000万细胞，按每管100万细胞冻存10支，作为质控品，其余按每毫升冻存液重悬1000万细胞加入冻存液重悬，使用同种子库的冻存程序。冻存10～15管，每管贴防冻二维码。

抽取总供体数的1％进行检测

检测方法：

内毒素：凝胶法

支原体：PCR法

厌氧菌、需氧菌：培养法

活率：MTT法

流式：流式细胞术

传染病核酸检测：PCR

以上检测方法以试剂和设备操作说明为准。

复苏方法：

使用细胞复苏仪将细胞解冻，3000转/min离心5min，去冻存液上清，收集上清做检测，细胞加入2ml无血清基础培养基重旋后做细胞检测。

本发明构建和检测的流程图如图1所示。

检测结果：

表1活率检测结果

如表1所示，细胞活率在冻存前活率到96～99％，活率较高。冻存后，细胞结果程序降温、复温、离心的过程，细胞活率会下降，相比于细胞冻存前降低2～11％之间。

冻存前的活率较高说明本发明的种子库构建的方法是有效的，可以从脐带组织中提取干细胞并培养出活性较好的细胞，在冻存后，细胞的活性大部分可以达到90％以上。

相比于现有技术，提高了整体细胞库的细胞活率。

表2流式检测结果

种子库和主库的的流式检测项目，包括6种表面标记物，分别为CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR，冻存前和冻存后所有检测结果均为CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性和HLA-DR为阴性。工作库和产品库的流式检测项目，包括8种表面标记物，分别是CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b和CD19，冻存前和冻存后所有检测结果均为CD73为阳性、CD90为阳性、CD105为阳性、CD34为阴性、CD45为阴性、HLA-DR为阴性、CD11b为阴性和CD19为阴性。

如表2所示，流式结果表明的细胞符合干细胞特性，说明本发明的细胞库构建方法可以分离培养出干细胞，并且在存储的过程中其干细胞特性不会发生变化。

表3内毒素、支原体、厌氧菌、需氧菌检测结果

如表3所示，冻存前后内毒素、支原体、厌氧菌、需氧菌检测结果均为阴性。说明本发明的细胞库构建方法对细胞的安全性有保证，并且在细胞的保存过程中，不会对细胞产生污染。相比于目前的技术，采用分区管理(即设置种子库、主库、工作库和产品库)和气相液氮罐存储，避免了细胞之间的交叉污染，保证了细胞的安全性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。