具体实施方式

抗体

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括单克隆抗体(包括全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段及其抗原结合部分(例如互补位、CDR)，只要它们表现出所需的生物活性和特异性即可。

如本文所用，“抗体可变结构域”是指包括互补决定区(CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的抗体分子的轻链和重链的部分。V_H指重链的可变结构域。V_L指轻链的可变结构域。指定给CDR和FR的氨基酸位置可以根据Kabat或根据Chothia定义。术语“框架区”(FR)是指除CDR残基以外的那些可变结构域残基。

如本文所用，术语“互补决定区”(CDR)是指(通常)参与抗原结合的抗体可变结构域的部分。每个可变结构域通常具有鉴定为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。每个CDR可包含来自如例如Kabat所定义的CDR的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中约残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987,1991))。每个CDR还可以包含来自“高变环”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中约残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中约残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk 196J.Mol.Biol.901(1987))。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。Kabat残基名称不总是直接对应于氨基酸残基的线性编号(一级氨基酸序列)。实际的线性氨基酸序列可以含有比严格的Kabat编号中更少或另外的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的结构组分(无论是框架还是CDR)的缩短或插入。对于给定的抗体或其抗原结合片段，正确的残基的Kabat编号可以通过将抗体或其抗原结合片段的序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列比对来确定。Kabat编号如何与抗体的一级氨基酸序列相关的实例可见图3A、3B和3C。可替代地，CDR可根据ImMunoGeneTics(IMGT)系统定义(Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。

在一个实施方案中，本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含六个CDR，其中：

(i)重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:9；

(ii)重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:2；

(iii)重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:10；

(iv)轻链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:4；

(v)轻链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:5；并且

(vi)轻链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:11。

在另一个实施方案中，本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含六个CDR，其中：

(i)重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:9；

(ii)重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:2；

(iii)重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:10；

(iv)轻链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:4；

(v)轻链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:5；并且

(vi)轻链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:12。

在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含六个CDR，其中：

(i)重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:9

(ii)重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:2；

(iii)重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:10；

(iv)轻链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:18；

(v)轻链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:5；并且

(vi)轻链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:11。

如下文实施例中所示，人源化的非糖基化的CEACAM1抗体的CDR1H、CDR3H和CDR3L的亲和力成熟产生赋予CEACAM1结合亲和力显著改善的变体。检查所获得的变体并将这些变体与引入到亲和力成熟文库中的变异性进行比较，指示某些CDR位置(在所述位置处氨基酸保持相对不变)和其他CDR位置(在所述位置处可以引入变异)，从而导致结合改善。

在一方面，本发明提供包含CDR1H的CEACAM1抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR1H包含CEACAM1抗体的残基31-35(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:19(参见图3A)或SEQ ID NO:13(参见图3B)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基31至35)，并且包含序列X1HX2X3S(SEQ ID NO:1)，

其中CDR1H的X1是A、D、N或S；

其中CDR1H的X2是A或G；并且

其中CDR1H的X3是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸。

可替代地，可以使用IMGT定义来定义CDR1H，其中CDR1H包含CEACAM1抗体的残基26-33(对应于例如SEQ ID NO:19(参见图3A)或SEQ ID NO:13(参见图3B)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基26至33)，并且包含序列X14X15X16FX17X1HX2(SEQ ID NO:20)，

其中CDR1H的X14是G或E；

其中CDR1H的X15是包括F或Y的具有芳族侧链的氨基酸；

其中CDR1H的X16是T、S或I；

其中CDR1H的X17是包括S、T或N的具有极性不带电侧链的氨基酸；

其中CDR1H的X1是A、D、N或S；并且

其中CDR1H的X2是A或G。

在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段的CDR1H(Kabat定义)包含序列SHGMS(SEQ ID NO:9)。

在一些实施方案中，CDR1H(IMGT定义)包含序列GFIFSHG(SEQ ID NO:21)。

在一方面，本发明提供包含CDR1H区的CEACAM1抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR1H包含CEACAM1抗体的残基26-35(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:19(参见图3A)或SEQ ID NO:13(参见图3B)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基26至35)，并且包含序列X₁₄X₁₅X₁₆FX₁₇X₁HX₂X₃S(SEQ ID NO:22)，

其中X₁₄是G或E；

其中X₁₅是包括F或Y的具有芳族侧链的氨基酸；

其中X₁₆是T、S或I；

其中X₁₇是包括S、T或N的具有极性不带电侧链的氨基酸；

其中X₁是A、D、N或S；

其中X₂是A或G；并且

其中X₃是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸。

在一个实施方案中，CDR1H区包含序列GFIFSSHGMS(SEQ ID NO:23)。

在一方面，本发明提供包含CDR3H的CEACAM1抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR3H包含残基95-102(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:19(参见图3A)或SEQ ID NO:13(参见图3B)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基99至110)，并且包含序列HX4X5DYX6PX7WFAX8(SEQ ID NO:3)，

其中CDR3H的X4是D、G或P；

其中CDR3H的X5是F或P；

其中CDR3H的X6是D或F；

其中CDR3H的X7是A或Y；并且

其中CDR3H的X8是L、H或F。

在一个实施方案中，CDR3H包含残基95-102(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:19(参见图3A)或SEQ ID NO:13(参见图3B)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基99至110)，并且包含序列HX4X5DYFPYWFAX8(SEQ ID NO:7)，

其中CDR3H的X4是D、G或P；

其中CDR3H的X5是F或P；并且

其中CDR3H的X8是L、H或F。

在一个实施方案中，CDR3H包含序列HDFDYFPYWFAH(SEQ ID NO:10)。

在一方面，本发明提供包含CDR3H区的CEACAM1抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR3H区包含残基94-102(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:19(参见图3A)或SEQ ID NO:13(参见图3B)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基98至110)，并且包含序列X18HX4X5DYX6PX7WFAX8(SEQ ID NO:24)，

其中X18是R或K；

其中X4是D、G或P；

其中X5是F或P；

其中X6是D或F；

其中X7是A或Y；并且

其中X8是L、H或F。

在一方面，CDR3H区包含序列RHDFDYFPYWFAH(SEQ ID NO:25)。

在一方面，本发明提供包含CDR3L的CEACAM1抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR3L包含残基89-97(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:14(参见图3C)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基88至96)，并且包含序列QQX₉X₁₀X₁₁X₁₂PX₁₃T(SEQ ID NO:6)，

其中X₉是W或N；

其中X₁₀是S或T；

其中X₁₁是A或包括S、N和T的具有中性亲水侧链的氨基酸；

其中X₁₂是L、F或N；并且

其中X₁₃是P或F。

在一个实施方案中，CDR3L包含残基89-97(Kabat定义，对应于例如SEQ ID NO:14(参见图3C)的重可变链的一级氨基酸序列中的残基88至96)，并且包含序列QQX₉SSX₁₂PX₁₃T(SEQ ID NO:8)，

其中X₉是W或N；

其中X₁₂是L、F或N；并且

其中X₁₃是P或F。

在一个实施方案中，CDR3L包含序列QQWSSNPPT(SEQ ID NO:11)或序列QQWTSNPPT(SEQ ID NO:12)。

在一方面，本发明涉及结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区中的每一个包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中：

所述重链可变区的CDR1序列(CDR1H)包含序列X₁₄X₁₅X₁₆FX₁₇X₁HX₂X₃S(SEQ ID NO:22)；

其中X₁₄是G或E；

其中X₁₅是包括F或Y的具有芳族侧链的氨基酸；

其中X₁₆是T、S或I；

其中X₁₇是包括S、T或N的具有极性不带电侧链的氨基酸；

其中X₁是A、D、N或S；

其中X₂是A或G；并且

其中X₃是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸；

所述重链可变区的CDR2序列(CDR2H)包含序列TISSGGTYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:2)；

所述重链可变区的CDR3序列(CDR3H)包含序列HX4X5DYX6X19X7WFAX20(SEQ IDNO:45)；

其中X4是D、G或P；

其中X5是F或P；

其中X6是D或F；

其中X19是P或A；

其中X7是A或Y；并且

其中X20是L、H、Y或F；

所述轻链可变区的CDR1序列(CDR1L)包含序列RANSAVSYMY(SEQ ID NO:4)；

所述轻链可变区的CDR2序列(CDR2L)包含序列LTSNRAT(SEQ ID NO:5)；并且

所述轻链可变区的CDR3序列(CDR3L)包含序列QQX₉X₁₀X₁₁X₁₂PX₁₃T(SEQ ID NO:6)；

其中X₉是W或N；

其中X₁₀是S或T；

其中X₁₁是A或包括S、N和T的具有中性亲水侧链的氨基酸；

其中X₁₂是L、F或N；并且

其中X₁₃是P或F；并且

其中

当X₁₉是A并且/或者X₂₀是Y时，X₁₀是T，X₄是G或P，X₁是N，并且/或者X₁₆是T或S。

在一方面，本发明涉及结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区中的每一个包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中：

所述重链可变区的CDR1序列(CDR1H)包含序列X₁₄FX₂₁FX₂₂X₂₃HX₂X₃S(SEQ ID NO:46)；

其中X₁₄是G或E；

其中X₂₁是T或I；

其中X₂₂是N或S；

其中X₂₃是A、D或S

其中X2是A或G；并且

其中X3是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸；

所述重链可变区的CDR2序列(CDR2H)包含序列TISSGGTYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:2)；

所述重链可变区的CDR3序列(CDR3H)包含序列HX24FDYX6X19X7WFAX25(SEQ IDNO:47)；

其中X24是D或G；

其中X6是D或F；

其中X19是P或A；

其中X7是A或Y；并且

其中X25是H或Y；

所述轻链可变区的CDR1序列(CDR1L)包含序列RANSAVSYMY(SEQ ID NO:4)；

所述轻链可变区的CDR2序列(CDR2L)包含序列LTSNRAT(SEQ ID NO:5)；并且

所述轻链可变区的CDR3序列(CDR3L)包含序列QQWX₁₀X₁₀NPPT(SEQ ID NO:48)；

其中X₁₀是S或T；

其中

当X21是I时，X₆是F，X19是P并且/或者X7是Y。

在一方面，本发明涉及结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区中的每一个包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中：

所述重链可变区的CDR1序列(CDR1H)包含序列X₁₄FTFX₂₂X₂₆HAX₃S(SEQ ID NO:49)；

其中X14是G或E；

其中X₁₇是S或N；

其中X₂₂是N或S；

其中X26是A或D并且

其中X3是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸；

所述重链可变区的CDR2序列(CDR2H)包含序列TISSGGTYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:2)；

所述重链可变区的CDR3序列(CDR3H)包含序列HX24FDYX6X19X7WFAX25(SEQ IDNO:47)；

其中X24是D或G；

其中X₆是D或F；

其中X19是P或A；

其中X7是A或Y；并且

其中X25是H或Y；

所述轻链可变区的CDR1序列(CDR1L)包含序列RANSAVSYMY(SEQ ID NO:4)；

所述轻链可变区的CDR2序列(CDR2L)包含序列LTSNRAT(SEQ ID NO:5)；并且

所述轻链可变区的CDR3序列(CDR3L)包含序列QQWX₁₀X₁₀NPPT(SEQ ID NO:48)；

其中X₁₀是S或T。

在一方面，本发明提供了CEACAM1抗体或其抗原结合片段，所述CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含CDR1H、CDR2H和CDR3H(Kabat定义)，其中所述轻链可变区包含CDR1L、CDR2L和CDR3L(Kabat定义)，并且其中：

CDR1H的序列包含序列X₁HX₂X₃S(SEQ ID NO:1)，

CDR2H的序列包含序列TISSGGTYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:2)，

CDR3H的序列包含序列HX₄X₅DYX₆PX₇WFAX₈(SEQ ID NO:3)，

CDR1L的序列包含序列RANSAVSYMY(SEQ ID NO:4)，

CDR2L的序列包含序列LTSNRAT(SEQ ID NO:5)，并且

CDR3L的序列包含序列QQX₉X₁₀X₁₁X₁₂PX₁₃T(SEQ ID NO:6)。

X₁-X₁₈先前已经定义。

在一个实施方案中，本发明涉及结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区中的每一个包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中：

所述重可变链的序列包含序列GXXXXX₁HX₂X₃S(SEQ ID NO:43)；

其中X是任何氨基酸；

其中X₁是A、D、N或S；

其中X₂是A或G；并且

其中X₃是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸；并且

所述重链可变区的CDR2序列(CDR2H)包含序列TISSGGTYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:2)；

CDR3H的序列包含序列HX₄X₅DYFPX₇WFAX₈(SEQ ID NO:44)；

其中X₄是D、G或P；

其中X₅是F或P；

其中X₇是A或Y；并且

其中X₈是L、H或F；

所述轻链可变区的CDR1序列(CDR1L)包含序列RANSAVSYMY(SEQ ID NO:4)；

所述轻链可变区的CDR2序列(CDR2L)包含序列LTSNRAT(SEQ ID NO:5)；并且

所述轻链可变区的CDR3序列(CDR3L)包含序列QQX₉X₁₀X₁₁X₁₂PX₁₃T(SEQ ID NO:6)；

其中X₉是W或N；

其中X₁₀是S或T；

其中X₁₁是A或包括S、N和T的具有中性亲水侧链的氨基酸；

其中X₁₂是L、F或N；并且

其中X₁₃是P或F。

在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含CDR1H、CDR2H和CDR3H(Kabat定义)，其中所述轻链可变区包含CDR1L、CDR2L和CDR3L(Kabat定义)，并且其中：

CDR1H的序列包含序列X₁HX₂X₃S(SEQ ID NO:1)，

CDR2H的序列包含序列TISSGGTYTYYPDSVKG(SEQ ID NO:2)，

CDR3H的序列包含序列HX₄X₅DYFPYWFAX₈(SEQ ID NO:7)，

CDR1L的序列包含序列RANSAVSYMY(SEQ ID NO:4)，

CDR2L的序列包含序列LTSNRAT(SEQ ID NO:5)，并且

CDR3L的序列包含序列QQX₉SSX₁₂PX₁₃T(SEQ ID NO:8)。

X₁-X₁₈先前已经定义。

根据某些实施方案，所考虑的抗体及其抗原结合片段还以用于降低免疫原性的人源化框架为特征。在某些实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的CDR位于从人抗体或其抗原结合片段获得的框架中。在其他实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的表面暴露的框架残基被人抗体或其抗原结合片段的框架残基替换。CDR也可位于与人恒定区连接的鼠或人源化框架中(即嵌合抗体)。在一个优选的实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的CDR位于作为两种或更多种人抗体的复合物的框架中。在此类实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段包含两个或更多个序列区段(“复合物”)，所述序列区段衍生自无关人抗体的V区，所述V区经选择以维持对于起始前体抗人CEACAM1单克隆抗体的抗原结合重要的单克隆抗体序列，并且已经全部使用“计算机工具”(Holgate和Baker,IDrugs.2009年四月；12(4):233-7)针对潜在T细胞表位的存在进行过滤。人序列区段与起始抗体V区的所有部分的紧密配合以及在合成抗体或其抗原结合片段之前消除CD4⁺ T细胞表位允许此技术避开免疫原性，同时通过先前分析抗原特异性所必需的序列来维持最佳亲和力和特异性(Holgate和Baker,2009)。

本文还提供了与SEQ ID NO:13-16中公开的可变重链和可变轻链及其配对相似但不相同的可变重链和可变轻链序列及其配对。

在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的可变重链氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:16的可变轻链氨基酸序列。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:14的可变轻链氨基酸序列。在其他实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:15的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的可变重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:14的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的可变重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:15的可变轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:13的可变重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:16的可变轻链氨基酸序列。

如本文所用，术语“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可以通过比较出于比较目的而进行比对的每个序列中的位置来确定。例如，当比较的核苷酸序列中的位置被相同的碱基占据时，那么所述分子在该位置是相同的。核酸或氨基酸序列之间的同一性程度是共享位置处的相同或匹配核苷酸或氨基酸的数目的函数。例如，考虑与本文所述的特定多肽具有至少85％、90％、95％、98％或99％同一性且优选表现出基本相同功能的多肽，以及编码此类多肽的多核苷酸。用于确定序列同一性和相似性的方法和计算机程序是可公开获得的，包括但不限于GCG程序包(Devereux等人,Nucleic Aci dsResearch 12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990)和ALIGN程序(2.0版)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定相似性。BLAST程序可从NC BI和其他来源公开获得(BLAST Manual,Altschul,等人,NCBI NLM NIH,Bethesda,Md.20894；BLAST 2.0网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。在比较序列时，这些方法考虑了各种取代、缺失和其他修饰。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；和/或

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:14的轻链可变结构域序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:14的轻链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列

(iii)并且其中：

CDR2H的序列包含SEQ ID NO:13的残基Y57和Y59，

CDR3H的序列包含SEQ ID NO:13的残基D102、Y103、F104、P105和Y106，

CDR1L的序列包含SEQ ID NO:14的残基A28、S30和Y31，

CDR2L的序列包含SEQ ID NO:14的残基S51和N52，并且

CDR3L的序列包含SEQ ID NO:14的残基S91和S92。

残基的编号基于抗体的一级氨基酸序列，参见图3A、3B和3C，例如重链和轻链序列。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:14的轻链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；以及

(iii)六个CDR，其中：

a.重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:9；

b.重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:2；

c.重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:10；

d.轻链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:4；

e.轻链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:5；并且

f.轻链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:11。

在一方面，本发明提供了结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；

其中所述重链可变区的序列包含与SEQ ID NO:13的重链可变区氨基酸序列至少85％相同的序列；

其中所述轻链可变区的序列包含与SEQ ID NO:14的轻链可变区氨基酸序列至少85％相同的序列；

其中所述重可变链的序列包含序列GXXXXX₁HX₂X₃S(SEQ ID NO:43)；

其中X是任何氨基酸；

其中X₁是A、D、N或S；

其中X₂是A或G；并且

其中X₃是包括I或M的具有疏水侧链的氨基酸；并且

其中CDR3H的序列包含序列HX₄X₅DYFPX₇WFAX₈(SEQ ID NO:44)；

其中X₄是D、G或P；

其中X₅是F或P；

其中X₇是A或Y；并且

其中X₈是L、H或F。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；和/或

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:15的轻链可变结构域序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:15的轻链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(iii)并且其中：

CDR2H的序列包含SEQ ID NO:13的残基Y57和Y59，

CDR3H的序列包含SEQ ID NO:13的残基D102、Y103、F104、P105和Y106，

CDR1L的序列包含SEQ ID NO:15的残基A28、S30和Y31，

CDR2L的序列包含SEQ ID NO:15的残基S51和N52，并且

CDR3L的序列包含SEQ ID NO:15的残基S92。

残基的编号基于抗体的一级氨基酸序列，参见图3A、3B和3C，例如重链和轻链序列。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(iv)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(v)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:15的轻链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；以及

(vi)六个CDR，其中：

a.重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:9；

b.重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:2；

c.重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:10；

d.轻链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:4；

e.轻链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:5；并且

f.轻链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:12。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；和/或

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:16的轻链可变结构域序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(i)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(ii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:16的轻链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(iii)并且其中：

CDR2H的序列包含SEQ ID NO:13的残基Y57和Y59，

CDR3H的序列包含SEQ ID NO:13的残基D102、Y103、F104、P105和Y106，

CDR1L的序列包含SEQ ID NO:16的残基S30和Y31，

CDR2L的序列包含SEQ ID NO:16的残基S51和N52，并且

CDR3L的序列包含SEQ ID NO:16的残基S91和S92。

残基的编号基于抗体的一级氨基酸序列，参见图3A、3B和3C，例如重链和轻链序列。

在另一方面，CEACAM1抗体或其抗原结合片段包含

(vii)重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:13的重链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；

(viii)轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:16的轻链可变结构域序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列；以及

(ix)六个CDR，其中：

a.重链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:9；

b.重链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:2；

c.重链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:10；

d.轻链可变区的CDR1序列包含SEQ ID NO:18；

e.轻链可变区的CDR2序列包含SEQ ID NO:5；并且

f.轻链可变区的CDR3序列包含SEQ ID NO:11。

显然，本文所述的框架中的任一种都可与本文所述的CDR和CDR基序中的任一种组合使用。在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段利用

表1中所述的框架。

在本文所述方面的一些实施方案中，考虑结合本文所述CEACAM1的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列修饰。抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列变体通过向编码抗体或其抗原结合片段的核酸中引入适当的核苷酸变化或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征，例如结合特异性、生物活性的抑制。

一种类型的变体是保守氨基酸取代变体。这些变体在抗体或其抗原结合片段中至少一个氨基酸残基被具有相似侧链特性的不同残基替换。氨基酸可根据其侧链特性的相似性进行分组(参见Lehninger,BIOCHEMISTRY(第2版,Worth Publishers,New York,1975)：

(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；

(2)不带电极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；

(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；

(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。

因此，保守氨基酸取代的非限制性实例是非极性氨基酸被另一种非极性氨基酸替换。

可替代地，可以基于共同的侧链特性将天然存在的残基进行分组：

(1)疏水性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)；

(2)中性亲水性：Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Asn(N)、Gln(Q)；

(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；

(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)；

(5)影响链取向的残基：Gly(G)、Pro(P)；

(6)芳族：Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)。

因此，保守氨基酸取代的非限制性实例是疏水性氨基酸被另一种疏水性氨基酸替换。

还考虑氨基酸序列插入，其可以包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体或其抗原结合片段或者与细胞毒性多肽融合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段的其他插入变体包括将抗体或其抗原结合片段的N或C末端与增加抗体或其抗原结合片段的血清半衰期的酶或多肽(例如生物素)融合。

不参与维持结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段的正确构象的任何半胱氨酸残基也可以被取代，例如被丝氨酸或丙氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。

相反地，可以将半胱氨酸键添加到抗体或其抗原结合片段以提高其稳定性(特别是在抗体或其抗原结合片段是抗体片段诸如Fv片段的情况下)。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有改变抗体或其抗原结合片段的原始糖基化模式的氨基酸改变。“改变原始糖基化模式”意指缺失抗体或其抗原结合片段中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体或其抗原结合片段中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。将糖基化位点添加到结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段是通过改变氨基酸序列以使其含有上述三肽序列中的一个或多个来实现的(对于N-连接的糖基化位点)。所述改变也可以通过在原始抗体或其抗原结合片段的序列中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(对于O-连接的糖基化位点)。

在一些实施方案中，本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段是去糖基化的或非糖基化的。在一些实施方案中，所考虑的CEACAM1抗体或其抗原结合片段在重链中缺少C末端赖氨酸和/或在重链的恒定区中含有S241P取代。在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段在可变轻链的CDR1中缺少糖基化位点。在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段在可变轻链的CDR1中缺少N-X-S/T共有序列。在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段在可变轻链的CDR1的CDR残基26和/或29(Kabat编号)中具有突变。当抗体或其抗原结合片段包含Fc区时，可改变与其连接的碳水化合物。例如，描述了具有成熟碳水化合物结构的抗体，其缺少连接到抗体或其抗原结合片段的Fc区的岩藻糖。参见，例如，美国专利公开号2003/0157108；2004/0093621。在WO03/011878；美国专利号6,602,684中引用了在连接到抗体或其抗原结合片段的Fc区的碳水化合物中具有二等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。在WO 97/30087中报道了在连接到抗体或其抗原结合片段的Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。还参见WO98/58964；WO 99/22764，其涉及具有连接到其Fc区的改变的碳水化合物的抗体。

在一些实施方案中，可能需要在效应子功能方面修饰本文所述的结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段，例如以增强抗体或其抗原结合片段的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体或其抗原结合片段的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。可替代地或另外地，可以在Fc区中引入一个或多个半胱氨酸残基，从而允许在此区域中形成链间二硫键。如此产生的同源二聚抗体或其抗原结合片段可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人,176J.Exp.Med.1191(1992)；Shopes,148J.Immunol.2918(1992)。如Wolff等人,53Cancer Res.2560(1993)所述，也可以使用异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚抗体。可替代地，具有双Fc区的抗体或其抗原结合片段可以被工程化，并因此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人,3Anti-CancerDrug Design 219(1989)。

例如，WO 00/42072描述了在人效应细胞存在下具有改善的ADCC功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸取代。优选地，具有改善的ADCC的抗体或其抗原结合片段在Fc区的位置298、333和/或334处包含取代(残基的Eu编号)。通常，改变的Fc区是包含在这些位置中的一个、两个或三个处的取代或由其组成的人IgG1 Fc区。此类取代任选地与增加Clq结合和/或CDC的取代组合。取代包括IgG1 Fc中的Asn297Ala突变。

具有改变的Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体描述于WO 99/51642，美国专利号6,194,551、6,242,195、6,528,624和6,538,124中。抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334中的一个或多个处包含氨基酸取代(残基的Eu编号)。

在WO 00/42072和美国专利公开号2005/0014934中描述了具有改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合和增加的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善Fc区与CEACAM1的结合。例如，Fc区可在位置238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434中的一个或多个处具有取代(残基的Eu编号)。具有改善的CEACAM1结合的包含优选Fc区的抗体变体在其Fc区的307、380和434位中的一个、两个或三个处包含氨基酸取代(残基的Eu编号)。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有307/434个突变。还考虑了具有三个或更多个(例如，四个)功能性抗原结合位点的结合CEACAM1的工程化抗体。参见例如美国专利公开号US 2002/0004587。

抗体片段和类型

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体片段是Fab片段，其包含轻链的可变(V_L)和恒定(C_L)结构域以及重链的可变结构域(V_H)和第一恒定结构域(C_H1)或基本上由其组成。

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体片段是Fab'片段，其是指在C_H1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段。

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体片段是包含V_H和C_H1结构域或基本上由其组成的Fd片段。

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体部分是包含V_H和C_H1结构域以及在C_H1结构域的C末端的一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段。

单链Fv或scFv抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域或基本上由其组成，使得这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在V_H与V_L结构域之间还包含多肽接头，其允许scFv形成用于抗原结合的所需结构。参见，例如，Pluckthun,113Pharmacology MonoclonalAntibodies 269(Rosenburg和Moore,编,Springer-Verlag,New York,1994)。因此，在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体片段是包含抗体单臂的V_L和V_H结构域或基本上由其组成的Fv片段。

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体部分是包含两个抗原结合位点的双抗体，其在同一多肽链中包含连接到轻链可变结构域(V_L)的重链可变结构域(V_H)。

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体部分是包含V_H结构域或基本上由其组成的dAb片段。

在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体部分是F(ab')2片段，其包含二价片段，所述二价片段包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab'片段。

线性抗体是指Zapata等人,Protein Engin.,8(10):1057-1062(1995)所述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联的Fd片段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。在本文所述方面的一些实施方案中，CEACAM1抗体片段是包含一对串联Fd片段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)的线性抗体，所述串联Fd片段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。

已经开发了多种技术，并可将其用于产生抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化获得。参见，例如，Morimoto等人,24J.Biochem.Biophys.Meths.107(1992)；Brennan等人,229Science 81(1985)。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。例如，可以从本文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。可替代地，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,1992)。根据另一种方法，F(ab')2片段可以直接从重组宿主细胞培养物中分离。制备抗体片段的其他技术对本领域技术人员来说是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体片段是单链Fv片段(scFv)。参见例如WO 93/16185。

在一个实施方案中，抗体是包含结合CEACAM1的互补区和结合PD-1的互补区的双特异性抗体。

在一个实施方案中，抗体是包含结合CEACAM1的互补区和结合PD-L1的互补区的双特异性抗体。

所考虑的抗体或抗原结合片段可以具有所有类型的恒定区，包括IgM、IgG、IgD和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施方案中，使用人同种型IgG1。在另一个实施方案中，使用人同种型IgG4。轻链恒定区可以是λ或κ。抗体或其抗原结合片段可包含来自一个以上类别或同种型的序列。

本文还公开了结合CEACAM1的嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)。在一个实施方案中，将本文公开的抗CEACAM抗体的一个或多个CDR移植到T细胞上的嵌合抗原受体(CAR)上。这种遗传修饰的T细胞利用CAR(也称为嵌合T细胞受体)以人白细胞抗原非依赖性方式靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。

抗体结合

人CEACAM1基因通过可变剪接产生11种同工型。每种同工型在蛋白质的氨基(N)末端具有一个可变(V)样Ig结构域。除CEACAM1-1L和CEACAM1-1S同工型外，不同的同工型还具有2或3个恒定C2样Ig结构域。八种CEACAM1同工型通过跨膜结构域锚定到细胞膜，、并且三种CEACAM1同工型(CEACAM1-4C1-3和-3C2)缺少跨膜结构域并被分泌。两种同工型(CEACAM1-3AL和-3AS)在恒定C2样Ig结构域与跨膜结构域之间具有Alu家族重复序列(A)。跨膜CEACAM1同工型还具有长(L)或短(S)胞质结构域，这通过在信使中包括或排除CEACAM1外显子7来确定。CEACAM1 L胞质结构域具有两个ITIM基序，这对于CEACAM家族成员中的CEACAM1是独特的。在一方面，本发明提供CEACAM1抗体或其抗原结合片段，包括本文通过其结构特征描述的抗体，其在CEACAM1的蛋白质的氨基(N)末端(N结构域)处结合细胞外可变(V)样Ig结构域，即CEACAM1的所有同工型共有的结构域，所述同工型包括CEACAM1同工型1L、1S、3L、3S、4L、4S、3A1、3AS、3、4C1和4C2。在一些实施方案中，提供的抗体及其抗原结合片段结合人CEACAM1。在一些实施方案中，提供的抗体及其抗原结合片段结合哺乳动物CEACAM1。CEACAM1的全长形式的序列(NCBI参考序列NP_001703.2；UNIPROT ID P13688)提供为SEQ ID NO:26(信号序列：SEQ ID NO:26的残基1-34；Ig-V N结构域：SEQ ID NO:26的残基35-142。CEACAM1的成熟形式(无信号序列)提供为SEQ ID NO:17。

如本文所用，抗体或其抗原结合片段与CEACAM1、CEACAM1上的表位或在下述某些实施方案中CEACAM1上的特定残基的“结合”包括所述抗体或其抗原结合片段与CEACAM1的选择性相互作用。因此，结合包括例如主要和次要相互作用，包括氢键、离子相互作用、盐桥以及亲水和疏水相互作用。

在某些实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段以10^-5至10^-12mol/l、10^-6至10^-12mol/l、10^-7至10^-12mol/l、10^-8至10^-12mol/l、10^-9至10^-12mol/l、10^-10至10^-12mol/l或10^-11至10^-12mol/l的K_D结合CEACAM1。在其他实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段以10^-5至10^-11mol/l、10^-6至10^-11mol/l、10^-7至10^-11mol/l、10^-8至10^-11mol/l、10^-9至10^-11mol/l或10^-10至10^-11mol/l的K_D结合CEACAM1。在其他实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段以10^-5至10^-10mol/l、10^-6至10^-10mol/l、10^-7至10^-10mol/l、10^-8至10^-10mol/l或10^-9至10^-10mol/l的K_D结合CEACAM1。在其他实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段以10^-5至10^-8mol/l、10^-6至10^-8mol/l或10^-7至10^-8mol/l的K_D结合CEACAM1。

本文中的术语“特异性”是指抗体或其抗原结合片段(诸如抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段)识别CEACAM1内的表位的能力，而与CEACAM1的其他部分仅具有很少或没有可检测的反应性。特异性可通过竞争测定或通过本文所述的表位鉴定/表征技术或本领域已知的其等同物来相对测定。

如本文所用，“表位”可由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常在特定空间构象中包括至少3个，更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。“表位”包括常规由免疫球蛋白V_H/V_L对结合的结构单位。表位定义了抗体或其抗原结合片段的最小结合位点，并因此代表了抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。在单结构域抗体的情况下，表位代表由分离的可变结构域结合的结构单位。

在特定的实施方案中，所考虑的抗体或抗原结合片段特异性结合与抗体CP08H03/Vk8 S29A相同的表位。在另一个实施方案中，所考虑的抗体或抗原结合片段结合与CP08H03/CP08F05相同的表位。

在一方面，本发明提供了抗体和其抗原结合片段，包括本文通过其结构特征描述的抗体，其中所述抗体和其抗原结合片段特异性结合CEACAM1上的同嗜性结合结构域的至少一部分(即参与CEACAM1:CEACAM1同源二聚体形成的CEACAM1蛋白的一部分)，从而阻断CEACAM1同嗜性相互作用。在某些实施方案中，提供的抗体或其抗原结合片段特异性结合包含在CEACAM1的CC'和FG环中并且在CEACAM1:CEACAM1二聚体界面处包括YQQN袋(即，SEQ IDNO:17的Y34、Q44、Q89、N97)的CEACAM1残基中的一个或多个，参见Huang等人,Nature.2015Jan15；517(7534):386-90。

如本文所用，“阻断”抗体或抗体“拮抗剂”是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。例如，在一些实施方案中，CEACAM1拮抗剂抗体或其抗原结合片段结合CEACAM1并抑制CEACAM1的活性和/或CEACAM1与异源结合配偶体(诸如其他CEACAM蛋白或TIM-3)的结合。活性的抑制和结合的抑制包括部分抑制。本文描述了用于鉴定阻断CEACAM1同嗜性和异嗜性相互作用的CEACAM1抗体的方法，并且这些方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用本领域已知的任何合适的方法鉴定竞争抗体、交叉阻断抗体和被交叉阻断的抗体，所述方法包括竞争ELISA或测定，其中竞争抗体或交叉阻断抗体与人CEACAM1的结合阻止本文公开的抗体的结合，反之亦然。

在一个实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的重链在SEQ ID NO:17的残基F29、Y34、T56、Q89、S93和/或D94处特异性结合CEACAM1。在另一个实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的重链还在SEQ ID NO:17的残基S32、Q44、A49和/或I91处特异性结合CEACAM1。

在一个实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的轻链在SEQ ID NO:17的残基D40、G41、N42、N97和/或E99处特异性结合CEACAM1。在另一个实施方案中，所考虑的抗体或其抗原结合片段的轻链还在SEQ ID NO:17的残基L95和/或V96处特异性结合CEACAM1。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段在SEQ ID NO:17的残基F29、Y34、D40、G41、N42、T56、Q89、S93、D94、N97和/或E99处特异性结合CEACAM1。在另一个优选的实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段还在SEQ ID NO:17的残基S32、Q44、A49、I91、L95和/或V96处特异性结合CEACAM1。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段在SEQ ID NO:17的残基F29、Y34、D40、G41、N42、T56、Q89、S93、D94、N97和E99处特异性结合CEACAM1。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或抗原结合片段在SEQ ID NO:17的残基F29、S32、Y34、D40、G41、N42、Q44、A49、T56、Q89、I91、S93、D94、L95、V96、N97和E99处特异性结合CEACAM1。

在某些实施方案中，并非所有的CDR都直接参与与抗原的结合。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段的六个CDR中的四个与抗原接触。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段的六个CDR中的五个与抗原接触。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段的六个CDR中的六个与抗原接触。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段的CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L和CDR3L直接参与与抗原的结合。

在一个实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段特异性结合位于CEACAM1的N结构域上的CEACAM1的表位。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含选自SEQ ID NO:17的F29、S32、D40、A49和T56的一个或多个CEACAM1残基的CEACAM1表位。在另一个实施方案中，CEACAM1抗体特异性结合包含SEQ ID NO:17的残基F29、S32、D40、A49、T56和I91的CEACAM1表位。

在一个实施方案中，本文提供的抗体及其抗原结合片段特异性结合位于CEACAM1的N结构域上的CEACAM1的表位。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合包含选自SEQ ID NO:17的S32、D40、A49和I91的一个或多个CEACAM1残基的CEACAM1表位。在另一个实施方案中，CEACAM1抗体特异性结合包含SEQ ID NO:17的残基S32、D40、A49和I91的CEACAM1表位。

在一个实施方案中，本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段结合CEACAM1，其中

CDR2H残基Y57在残基F29处结合CEACAM1，

CDR2H残基Y59在残基S93处结合CEACAM1，

CDR3H残基D102在残基T56处结合CEACAM1，

CDR3H残基Y103在残基Y34和/或Q89处结合CEACAM1，

CDR3H残基F104在残基F29处结合CEACAM1，

CDR3H残基Y106在残基D94处结合CEACAM1，

CDR1L残基S30在残基E99处结合CEACAM1，

CDR1L残基Y31在残基N97处结合CEACAM1，

CDR2L残基S51在残基D40处结合CEACAM1，并且/或者

CDR2L残基N52在残基G41和/或N42处结合CEACAM1。

CDR残基的编号基于抗体的一级氨基酸序列，参见图3A、3B和3C，例如重链和轻链序列。CEACAM1残基根据SEQ ID NO:17编号。

在一个实施方案中，本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段结合CEACAM1，其中

CDR2H残基Y57在残基F29处结合CEACAM1，

CDR2H残基Y59在残基S93处结合CEACAM1，

CDR3H残基D102在残基T56处结合CEACAM1，

CDR3H残基Y103在残基S32、Y34、Q44和/或Q89处结合CEACAM1，

CDR3H残基F104在残基F29和/或A49处结合CEACAM1，

CDR3H残基P105在残基I91处结合CEACAM1，

CDR3H残基Y106在残基D94处结合CEACAM1，

CDR1L残基S30在残基E99处结合CEACAM1，

CDR1L残基Y31在残基N97处结合CEACAM1，

CDR2L残基S51在残基D40处结合CEACAM1，

CDR2L残基N52在残基G41和/或N42处结合CEACAM1，

CDR3L残基S91在残基L95处结合CEACAM1，并且/或者

CDR3L残基S92在残基V96处结合CEACAM1。

残基的编号基于抗体的一级氨基酸序列，参见图3A、3B和3C，例如重链和轻链序列。CEACAM1残基根据SEQ ID NO:17编号。

在一个实施方案中，本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段结合CEACAM1，其中

CDR2H残基Y57在残基F29处结合CEACAM1，

CDR2H残基Y59在残基S93处结合CEACAM1，

CDR3H残基D102在残基T56处结合CEACAM1，

CDR3H残基Y103在残基S32、Y34、Q44和Q89处结合CEACAM1，

CDR3H残基F104在残基F29和A49处结合CEACAM1，

CDR3H残基P105在残基I91处结合CEACAM1，

CDR3H残基Y106在残基D94处结合CEACAM1，

CDR1L残基S30在残基E99处结合CEACAM1，

CDR1L残基Y31在残基N97处结合CEACAM1，

CDR2L残基S51在残基D40处结合CEACAM1，

CDR2L残基N52在残基G41和N42处结合CEACAM1，

CDR3L残基S91在残基L95处结合CEACAM1，并且

CDR3L残基S92在残基V96处结合CEACAM1。

残基的编号基于抗体的一级氨基酸序列，参见图3A、3B和3C，例如重链和轻链序列。CEACAM1残基根据SEQ ID NO:17编号。

CEACAM家族成员在多种细胞类型(特别是白细胞)上广泛表达，从而影响细胞功能的幅度。例如，CEACAM1在上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞和骨髓细胞上表达，CEACAM3在粒细胞和嗜中性粒细胞上表达，CEACAM5在上皮细胞上表达，并且CEACAM6在上皮细胞和粒细胞上表达。然而，CEACAM1的N结构域与CEACAM家族成员3、5和6的N结构域具有约90％相似性，使得难以选择性地靶向CEACAM1。

尽管N结构域在CEACAM家族成员中高度相似，但在一些实施方案中，本文提供的抗体或其抗原结合片段，包括本文通过其结构特征描述的抗体，对CEACAM1具有选择性。通过选择性靶向CEACAM1，本发明的实施方案可以避免不需要的干扰，例如CEACAM3的广泛激活功能。

术语“选择性的”和“选择性”在本文中是指抗体或其抗原结合片段(即，CEACAM1抗体或其抗原结合片段)对特定区域、靶标或肽的优先结合；所述区域、靶标或肽通常是CEACAM1中的区域或表位，不是一种或多种其他生物分子，包括其他CEACAM家族成员。

在一些实施方案中，所考虑的CEACAM1抗体或其抗原结合片段不表现出与CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6和/或CEACAM8的显著结合。在一些实施方案中，所考虑的CEACAM1抗体或其抗原结合片段不表现出与CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6和/或CEACAM8的可检测结合。在一些实施方案中，所考虑的CEACAM1抗体或其抗原结合片段与CEACAM1的结合亲和力是所考虑的CEACAM1抗体或其抗原结合片段与另一靶标或多肽的结合亲和力的至少10倍，诸如至少100倍、和至少1000倍、和至多10,000倍或更强。

如本文所用，由抗原与抗原结合蛋白的解离的平衡常数(K_D)表示的“亲和力”是抗原决定簇与抗原结合蛋白(诸如抗体或其抗体片段)上的抗原结合位点之间的结合强度的量度。K_D值越小，抗原决定簇与抗原结合分子之间的结合强度越强。可替代地，亲和力也可以表示为亲和力常数(K_A)，其为1/K_D)。如本领域技术人员所清楚的，亲和力可以以本身已知的方式确定，这取决于感兴趣的特定抗原。

在一方面，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，包括本文通过其结构特征描述的抗体，其中所述抗体及其抗原结合片段特异性结合CEACAM1上的CEACAM家族的一个或多个其他成员的结合位点的至少一部分，从而阻断CEACAM1与CEACAM家族的一个或多个其他成员的相互作用。这些CEACAM家族成员包括但不限于CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6和CEACAM8(Ramani等人,Anal.Biochem.Jan.15,2012；420(2)；127-38；Scheffrahn等人,J.Immunol.May.15,2002；168(10)；5139-46)。

在一方面，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，包括本文通过其结构特征描述的抗体，其中所述抗体及其抗原结合片段特异性结合CEACAM1上的TIM家族成员的结合位点的至少一部分，从而阻断CEACAM1与TIM家族成员的相互作用。在一些实施方案中，此TIM家族成员是TIM-1、TIM-3或TIM-4。在一些实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO:17的CEACAM1残基Y34、G41、N42、Q44、Q89、S93、D94、V96和/或N97中的一个或多个，所述残基已表明参与CEACAM1与TIM-3的结合(Huang等人.,Nature.2015Jan 15；517(7534):386-90)。

在一方面，本发明提供了抗体及其抗原结合片段，包括本文通过其结构特征描述的抗体，其中所述抗体及其抗原结合片段特异性结合CEACAM1上的细菌粘附表面蛋白(粘附素)的结合位点的至少一部分，从而阻断CEACAM1与粘附素之间的相互作用。在某些实施方案中，粘附素在结合CEACAM1的致病菌的表面上表达，所述致病菌包括但不限于大肠杆菌，特别是扩散性粘附大肠杆菌(DAEC)、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、共生奈瑟氏球菌、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、幽门螺杆菌和/或沙门氏菌属(Salmonella sp.)。

在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与幽门螺杆菌表面上表达的HopQ之间的相互作用。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或抗原结合片段特异性结合CEACAM1残基F29、Y34、N42、Q89和N97中的一个或多个，所述残基已被预测参与CEACAM1与HopQ的结合。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与奈瑟氏球菌属表面上表达的混浊相关(Opa)粘附素蛋白之间的相互作用，所述粘附素蛋白包括但不限于Opas2、Opa65、Opa68、Opav0、Opa72、Opa73、Opa74和Opa75。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或抗原结合片段特异性结合CEACAM1残基Q44和A49中的一个或多个，这些残基已被预测参与CEACAM1与奈瑟氏球菌Opa蛋白的结合。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与莫拉氏菌属表面上表达的Opa样蛋白OlpA之间的相互作用。

在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与流感嗜血杆菌OMP P1之间的相互作用。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或抗原结合片段特异性结合CEACAM1残基Q44和A49中的一个或多个，这些残基已被预测参与CEACAM1与流感嗜血杆菌OMP P1的结合。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与埃及嗜血杆菌OMP P1之间的相互作用。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或抗原结合片段特异性结合CEACAM1残基F29，所述残基已被预测参与CEACAM1与埃及嗜血杆菌OMP P1的结合。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与白色念珠菌之间的相互作用。

在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与流感病毒(包括但不限于H5N1)之间的相互作用。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段抑制CEACAM1与子线虫结合的方法，所述方法包括使CEACAM1与本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段接触。在一个实施方案中，子线虫是班氏吴策线虫。

抗体缀合物

在本文所述方面的一些实施方案中，结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段缀合至功能部分。可用的功能部分的实例包括但不限于阻断部分、可检测部分、诊断部分、靶向部分和治疗部分。

示例性阻断部分包括具有足够空间位阻和/或电荷例如通过阻断糖苷酶糖基化抗体或其抗原结合片段的能力使得糖基化的发生降低的部分。另外地或可替代地，阻断部分可以例如通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力来降低效应子功能。优选的阻断部分包括半胱氨酸加合物和PEG部分。

在一个优选的实施方案中，阻断部分是半胱氨酸，优选例如在细胞培养物中例如在含Fc的多肽翻译期间或之后与游离半胱氨酸缔合的半胱氨酸。其他阻断半胱氨酸加合物包括胱氨酸、混合二硫化物加合物或二硫键。

在另一个优选的实施方案中，阻断部分是聚亚烷基二醇部分，例如PEG部分，并且优选PEG-马来酰亚胺部分。优选的聚乙二醇化部分(或相关聚合物)可以是例如聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇(“PPG”)、聚氧乙烯化甘油(“POG”)和其他聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇(“PVA”)和其他聚环氧烷、聚氧乙烯化山梨糖醇或聚氧乙烯化葡萄糖。聚合物可以是均聚物、无规或嵌段共聚物、基于以上列出的单体的三元共聚物、直链或支链的、取代或未取代的，只要它具有至少一个活性砜部分即可。聚合物部分可以具有任何长度或分子量，但这些特征会影响生物特性。在药物应用中特别可用于降低清除率的聚合物平均分子量在2,000至35,000道尔顿的范围内。此外，如果两个基团连接到聚合物，每个末端一个，则聚合物的长度可影响两个基团之间的有效距离和其他空间关系。因此，本领域技术人员可以改变聚合物的长度以优化或赋予所需的生物活性。出于若干原因，PEG可用于生物应用。PEG通常是透明的、无色的、无味的、可溶于水、对热稳定、对许多化学试剂呈惰性、不水解且无毒性。聚乙二醇化可以通过增加分子的表观分子量来改善分子的药代动力学性能。增加的表观分子量降低了皮下或全身施用后从体内的清除率。在许多情况下，聚乙二醇化可以降低抗原性和免疫原性。此外，聚乙二醇化可以增加生物活性分子的溶解度。

可用于本发明所考虑的方法和抗体及其抗原结合片段的可检测部分的实例包括荧光部分或标记、成像剂、放射性同位素部分、不透射线部分等，例如可检测标记，诸如生物素、荧光团、发色团、自旋共振探针或放射性标记。示例性荧光团包括荧光染料(例如荧光素、罗丹明等)和其他发光分子(例如鲁米那)。荧光团可以是环境敏感的，使得如果它位于修饰的蛋白质中的在结合底物(例如丹磺酰基探针)时经历结构改变的一个或多个残基附近，则其荧光发生改变。示例性放射性标记包括含有具有一个或多个低灵敏度核(¹³C、¹⁵N、²H、¹²⁵I、¹²³I、⁹⁹Tc、⁴³K、⁵²Fe、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、¹¹¹In等)的原子的小分子。其他可用的部分是本领域已知的。

可用于本发明所考虑的方法和抗体及其抗原结合片段的诊断部分的实例包括适于揭示疾病或病症存在的可检测部分。通常，诊断部分允许确定与疾病或病症相关的分子(例如靶肽、蛋白质或多种蛋白质)的存在、不存在或水平。此类诊断还适用于预测和/或诊断疾病或病症及其进展。

可用于本发明所考虑的方法和抗体及其抗原结合片段的治疗部分的实例包括，例如，抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂、抗感染剂或通常的治疗剂。功能部分也可具有上述功能中的一个或多个。

示例性治疗部分包括具有高能电离辐射的放射性核素，其能够引起核DNA中的多链断裂，并因此适用于诱导(例如癌症的)细胞死亡。示例性高能放射性核素包括：⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。这些同位素通常产生具有短路径长度的高能α粒子或β粒子。此类放射性核素杀死与其紧邻的细胞，例如缀合物已连接或已进入的赘生性细胞。它们对非定位细胞的影响很小或没有影响，并且基本上是非免疫原性的。

示例性治疗部分还包括细胞毒性剂，诸如细胞生长抑制剂(例如烷化剂、DNA合成抑制剂、DNA嵌入剂或交联剂、或DNA-RNA转录调节剂)、酶抑制剂、基因调节剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂等。

示例性治疗部分还包括烷化剂，诸如蒽环类药物家族(例如，阿霉素、洋红霉素、环孢菌素-A、氯喹、甲氨喋呤、光神霉素、紫菜霉素、链霉素、蒽二酮和氮丙啶)。在另一个实施方案中，化疗部分是细胞生长抑制剂，诸如DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤和二氯甲氨蝶呤、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨基蝶呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5′-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲、放线菌素-D和丝裂霉素C。示例性DNA嵌入剂或交联剂包括但不限于博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺二氯二氨基铂(II)(顺铂)、美法仑、米托蒽醌和奥沙利铂。

示例性治疗部分还包括转录调节剂，诸如放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、高三尖杉酯碱和伊达比星。与本发明相容的其他示例性细胞生长抑制剂包括安莎霉素苯醌、醌类衍生物(例如喹诺酮、染料木素、bactacyclin)、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、地吖醌、卡波醌、吲哚醌EO9、二乙烯亚氨基苯醌甲基DZQ、三亚乙基磷酰胺和亚硝基脲化合物(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀)。

示例性治疗部分还包括细胞毒性核苷，例如像腺嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟和6-巯基嘌呤；微管蛋白结合剂，诸如紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛、紫杉烷)、诺考达唑、根毒素、多拉司他汀(例如多拉司他汀10、11或15)、秋水仙碱和类秋水仙碱(例如ZD6126)、考布他汀(例如考布他汀A-4、AVE-6032)和长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨(诺维本))；抗血管生成化合物，诸如血管抑素K1-3、DL-α-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素和(±)-沙利度胺。

示例性治疗部分还包括激素和激素拮抗剂，诸如皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮或甲羟孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄激素(例如睾酮)、芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特)、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素A、西咪替丁、二氯亚甲基-二膦酸、亮丙瑞林(leuprolide(leuprorelin))、促黄体激素释放激素、pifithrin-α、雷帕霉素、性激素结合球蛋白和毒胡萝卜素。

示例性治疗部分还包括酶抑制剂，诸如S(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯-咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美坦、福司曲星、牛奶树碱(hispidin)、2-亚氨基-1-咪唑烷乙酸(环肌酸)、麦维诺素(mevinolin)、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑制剂AG34和酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879。

示例性治疗部分还包括基因调节剂，诸如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化固醇(维生素D3)、4-羟基他莫昔芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛(维生素A醛)、视黄酸、维生素A酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬和曲格列酮。

示例性治疗部分还包括细胞毒性剂，例如像蝶啶家族药物、烯二炔类和鬼臼毒素类。这些种类中特别可用的成员包括，例如，甲氨喋呤、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，诸如依托泊苷或磷酸依托泊苷、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。

与本文教导相容的再其他细胞毒素包括奥瑞他汀类(例如奥瑞他汀E和单甲基奥瑞他汀E)、卡奇霉素、短杆菌肽D、美登木素生物碱(例如美登素)、新制癌菌素、托泊替康、紫杉烷、细胞松弛素B、溴化乙锭、依米汀、替尼泊苷、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。

将此类治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如Amon等人,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(编),第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人,"Antibodies For Drug Delivery",Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等人(编),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(编),第475-506页(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy,Baldwin等人(编),第303-16页(Academic Press 1985)，以及Thorpe等人,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。

为了增加含有本文所述氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可将补救受体结合表位连接到抗体或其抗原结合片段(尤其是抗体片段)，如例如美国专利号5,739,277中所述。术语“补救受体结合表位”可指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位(例如Ghetie等人,18Ann.Rev.Immunol.739(2000)。在其Fc区中具有取代且血清半衰期增加的抗体也描述于WO 00/42072、WO 02/060919；Shields等人,276J.Biol.Chem.6591(2001)；Hinton,279J.Biol.Chem.6213-6216(2004)中。例如，编码补救受体结合表位的核酸分子可以与编码本文所述多肽序列的核酸框内连接，使得由工程化核酸分子表达的融合蛋白包含补救受体结合表位和本文所述的多肽序列。在另一个实施方案中，血清半衰期也可以例如通过连接其他多肽序列而增加。例如，可用于本发明方法的抗体或其抗原结合片段可连接到结合CEACAM1受体或血清白蛋白结合肽的血清白蛋白或血清白蛋白的一部分，使得血清白蛋白结合抗体或其抗原结合片段，例如WO 01/45746中公开的此类多肽序列。在一个实施方案中，通过这些方法增加Fab的半衰期。关于另外的血清白蛋白结合肽序列，还参见Dennis等人,277J.Biol.Chem.35035(2002)。

其他类型的功能部分是本领域已知的，并且可以基于本文包含的教导容易地用于本发明的方法和组合物中。

核酸

本文还提供了编码CEACAM1抗体及其抗原结合片段的核酸，以及载体、宿主细胞和表达系统。如本文所用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。

编码CEACAM1抗体及其抗原结合片段的核酸可以是，例如，包含单独或组合的那些多核苷酸中的任一种的DNA、cDNA、RNA、合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子。例如，提供了包含编码本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的表达载体，所述多核苷酸序列可操作地连接到适于在真核和/或原核宿主细胞中表达的表达控制序列。

术语“载体”指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。“载体”包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成。在一些实施方案中，所使用的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达与其连接的核酸(表达载体)的载体。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且是可商购获得的。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒，AAV)、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒诸如小核糖核酸病毒和甲病毒、以及双链DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽类白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒。

已经开发了多种表达载体用于在原核细胞(诸如细菌)中和在真核系统(包括但不限于酵母和哺乳动物细胞培养系统)中有效合成抗体及其抗原结合片段。载体可包含染色体、非染色体和合成DNA序列的区段。还提供了包含用于表达预期的CEACAM1抗体或其抗原结合片段的表达载体的细胞。

抗体制备和表达系统

本发明的抗体或其抗原结合片段通常通过重组表达产生。将编码轻链和重链可变区的核酸(任选地连接到恒定区)插入到表达载体中。轻链和重链可以克隆在相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA区段可操作地连接到表达载体中的控制序列，以确保免疫球蛋白多肽的表达。表达控制序列包括但不限于启动子(例如天然相关或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体被整合到合适的宿主中，将宿主维持在适合高水平表达核苷酸序列以及收集和纯化交叉反应抗体的条件下。

这些表达载体通常可作为游离基因体或作为宿主染色体DNA的整体部分在宿主生物体中复制。通常，表达载体包含选择标记(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞(参见例如Itakura等人，美国专利号4,704,362)。

本发明考虑的抗体和抗原结合片段的表达可以在原核或真核细胞中发生。合适的宿主包括细菌或真核宿主，包括体内或原位的酵母、昆虫、真菌、鸟和哺乳动物细胞或者哺乳动物、昆虫、鸟或酵母来源的宿主细胞。哺乳动物细胞或组织可以是人、灵长类动物、仓鼠、兔、啮齿动物、牛、猪、绵羊、马、山羊、狗或猫来源，但可以使用任何其他哺乳动物细胞。

大肠杆菌是一种特别可用于克隆本发明的多核苷酸(例如DNA序列)的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，和其他肠杆菌科，诸如沙门氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)属物种。

其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属和毕赤酵母属是示例性酵母宿主，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

此外，通过使用例如酵母泛素水解酶系统，可以实现泛素-跨膜多肽融合蛋白的体内合成。如此产生的融合蛋白可以在体内加工或在体外纯化和加工，从而允许合成具有特定氨基末端序列的本发明的CEACAM1抗体或其抗原结合片段。此外，可以避免与在直接酵母(或细菌)表达中保留起始密码子衍生的甲硫氨酸残基相关的问题。Sabin等人,7Bio/Technol.705(1989)；Miller等人,7Bio/Technol.698(1989)。

当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时，掺入了大量产生的编码糖酵解酶的活性表达基因的启动子和终止元件的一系列酵母基因表达系统中的任一种都可用于获得本发明的重组CEACAM1抗体或肽。已知的糖酵解基因也可以提供非常有效的转录控制信号。例如，可以利用磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止子信号。

可以实现在昆虫中产生CEACAM1抗体或其抗原结合片段。例如，通过本领域技术人员已知的方法，用被工程化以表达跨膜多肽的杆状病毒感染昆虫宿主。参见Ausubel等人,1987,1993。

除微生物外，哺乳动物组织培养物也可用于表达和产生本发明的抗体或其抗原结合片段(例如，编码免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。参见Winnacker,From Genes toClones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。真核细胞实际上是优选的，因为本领域已经开发了许多能够分泌异源蛋白(例如完整免疫球蛋白)的合适宿主细胞系，并且所述细胞系包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子和增强子(Queen等人,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。参见Co等人,J.Immunol.148:1149(1992)。

可替代地，可以将编码抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列掺入转基因中，用于导入转基因动物的基因组中，并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如，Deboer等人,美国专利号5,741,957，Rosen,美国专利号5,304,489，和Meade等人,美国专利号5,849,992)。合适的转基因包括轻链和/或重链的编码序列，其与来自乳腺特异性基因诸如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作地连接。

另外，植物已经成为用于重组抗体生产的方便、安全且经济的替代主流表达系统，其基于微生物或动物细胞的大规模培养。抗体或其抗原结合片段可在植物细胞培养物或常规生长的植物中表达。在植物中的表达可以是系统性的、限于亚细胞质体或限于种子(胚乳)。参见，例如，美国专利公开号2003/0167531；美国专利号6,080,560和6,512,162；和WO0129242。几种植物来源的抗体已经达到发展的成熟阶段，包括临床试验(参见，例如，Biolex,NC)。

含有感兴趣的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，这取决于细胞宿主的类型。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物射弹或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press,第2版,1989)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般参见Sambrook等人，同上)。为了生产转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的细胞核转移到去核卵母细胞中。

本发明的抗体及其抗原结合片段可使用单个载体或两种载体表达。当将抗体重链和轻链克隆到单独的表达载体上时，将载体共转染以获得完整免疫球蛋白的表达和组装。一旦表达，本发明的完整抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准程序纯化，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。对于药物用途，至少约90％至95％均一性的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，并且98％至99％或更高均一性是最优选的。

调节CEACAM1活性的方法

在一方面，本发明提供了使用本文所述的抗体及其抗原结合片段来降低CEACAM1与CEACAM家族的另一成员(包括但不限于CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5、CEACAM6和CEACAM8)之间的相互作用的方法。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1单体之间的同嗜性相互作用。

在另一方面，本发明提供了使用本发明的抗体及其抗原结合片段来降低CEACAM1和TIM家族成员(包括但不限于TIM-1、TIM-3和TIM-4)之间的相互作用的方法。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与TIM-3之间的异嗜性相互作用。通过使用本发明考虑的抗体及其抗原结合片段破坏CEACAM1与TIM-3之间的相互作用可以逆转CEACAM1抑制功能，同时保持TIM-3激活功能。

本发明的实施方案可用于降低免疫抑制，例如T细胞耐受性。“降低”是指与未治疗的对照相比，引起约20％或更大、30％或更大、40％或更大、45％或更大、50％或更大、55％或更大、60％或更大、65％或更大、70％或更大、或75％、80％、85％、90％、95％或更大的总体降低的能力。免疫抑制可由免疫细胞表面上表达的免疫抑制受体及其与其配体的相互作用介导。例如，细胞毒性CD8 T细胞可进入“功能耗竭”或“无应答”状态，由此它们表达阻止抗原特异性应答(诸如增殖和细胞因子产生)的抑制性受体。因此，通过抑制此类抑制性受体的活性和/或表达，可以增强或不抑制被阻抑、抑制或无应答的对癌症或肿瘤的免疫应答。此类免疫应答抑制的增强或逆转可导致更高的T细胞活性、应答性和/或关于激活的能力或接受性。

测量T细胞活性的方法是本领域已知的。作为非限制性实例，可通过使T细胞与回忆抗原、抗CD3(在不存在共刺激的情况下)和/或离子霉素接触来诱导T细胞耐受性。可以监测例如IL-27、LDH-A、RAB10和/或ZAP70(细胞内或分泌的)的水平，例如以确定T细胞致耐受性的程度(其中IL-2、干扰素-γ和TNF的水平与增加的T细胞耐受性相关)。还可以测量用例如离子霉素预处理的细胞对抗原的应答以便确定细胞或细胞群体中T细胞耐受性的程度，例如通过监测分泌的和/或细胞内IL-2和/或TNF-α的水平(参见例如Macian等人Cell2002109:719-731)。具有适应性耐受性的T细胞的其他特征包括Fyn和ZAP-70/Syk、Cbl-b、GRAIL、Ikaros、CREM(cAMP应答元件调节剂)、B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1(Blimp-1)、PD1、CD5和SHP2的水平增加；ZAP-70/Syk、LAT、PLCyl/2、ERK、PKC-Θ/ΙKΒΑ的磷酸化增加；细胞内钙水平的激活增加；组蛋白乙酰化或低乙酰化减少和/或IL-2基因座处的CpG甲基化增加。因此，在一些实施方案中，可以测定任何这些参数中的一个或多个以确定本文公开的抑制CEACAM1的抗体或其抗原结合片段是否降低免疫耐受性。T细胞耐受性的降低还可以通过检查肿瘤浸润性淋巴细胞或从已建立的肿瘤排出的淋巴结内的T淋巴细胞来评估。此类T细胞通过细胞表面分子(诸如PD1、TIM-3或LAG-3)的表达以及细胞因子(诸如干扰素-γ)的分泌减少而表现出“耗竭”特征。因此，在存在CEACAM1抗体或其抗原结合片段的情况下T细胞耐受性已降低的证据包括例如相对于在不存在抑制剂的情况下所观察到的T细胞数量增加，所述T细胞具有(a)对肿瘤相关抗原的抗原特异性(例如，如通过含有肿瘤相关肽的主要组织相容性复合物I类或II类四聚体所测定)和(b)分泌高水平干扰素-γ和细胞溶解性效应分子(诸如粒酶-B)的能力。

CEACAM1抗体及其抗原结合片段还可用于增强T细胞扩增、激活和增殖。

另一方面，本发明提供了使用本发明的抗体及其抗原结合片段来降低CEACAM1与细菌粘附素之间相互作用的方法。在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段有效减少和/或防止哺乳动物上皮的定殖。在一些实施方案中，粘附素由表达大肠杆菌，特别是扩散性粘附大肠杆菌(DAEC)、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、共生奈瑟氏球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、幽门螺杆菌和/或沙门氏菌属。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与幽门螺杆菌表面上表达的HopQ之间的相互作用。在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与奈瑟氏球菌属表面上表达的混浊相关(Opa)粘附素蛋白之间的相互作用。在另一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与嗜血杆菌属表面上表达的OMP粘附素蛋白之间的相互作用。

在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与白色念珠菌之间的相互作用。在一个实施方案中，CEACAM1抗体或其抗原结合片段破坏CEACAM1与流感病毒(包括但不限于H5N1)之间的相互作用。在一个实施方案中，本发明提供了使用本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段抑制CEACAM1与子线虫结合的方法。在一个实施方案中，子线虫是班氏吴策线虫。

治疗方法

在一方面，本发明提供了CEACAM1抗体及其抗原结合片段，其也可用于治疗有需要的受试者。

在本文所述的方法中，将治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合部分施用于有需要的哺乳动物。尽管本文所述的抗体或其抗原结合部分特别可用于施用于人，但它们也可施用于其他哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验室动物、家养宠物和农场动物。“治疗有效量”意指当本文所述抗体或其抗原结合部分施用于哺乳动物时，有效产生所需治疗效果的量。

在一些方面，抗体或其抗原结合片段结合由耗竭的T细胞或天然杀伤(NK)细胞表达的CEACAM1，从而恢复T细胞和NK细胞活性并导致增加的抗肿瘤应答。在其他方面，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤细胞表达的CEACAM1，从而抑制肿瘤细胞转移和癌症干细胞龛的形成。在又一方面，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤环境中与纤维化相关的巨噬细胞表达的CEACAM1，从而抑制纤维化。在另一方面，抗体或其抗原结合片段结合肿瘤微环境中其他基质细胞(诸如血管内皮细胞)表达的CEACAM1，从而抑制血管生成。

因此，本文还提供了治疗患有癌症或肿瘤的受试者和/或减少肿瘤生长的方法，其包括施用有效量的本文提供的CEACAM1抗体或其抗原结合片段。“减少”包括抑制和/或逆转，并且可以指例如所治疗的病症的症状、转移瘤或微转移瘤的存在或大小、原发性肿瘤的大小、休眠肿瘤的存在或大小。

术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理病状。此定义包括良性和恶性癌症，以及休眠肿瘤或微转移瘤。因此，如本文所用，术语“癌症”是指细胞的不受控制的生长，其干扰身体器官和系统(包括癌症干细胞和肿瘤血管龛)的正常功能。患有癌症的受试者是受试者体内存在可客观测量的癌细胞的受试者。此定义包括良性和恶性癌症，以及休眠肿瘤或微转移瘤。从其原始位置转移并接种重要器官的癌症可通过受影响器官的功能退化而最终导致受试者死亡。造血系统癌症，诸如白血病，能够胜过受试者的正常造血区室，从而导致造血功能失败(以贫血、血小板减少症和中性粒细胞减少症的形式)，最终导致死亡。

“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、绵羊或猫等。个体和患者也是本文的受试者。

如本文所用，术语“治疗(treat、treated、treating或treatment)”是指治疗性治疗，其中目的是减缓(减轻)不需要的生理病状、病症或疾病，或获得有益或所需的临床结果。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于减轻症状；减少病状、病症或疾病的程度；稳定(即，不恶化)病状、病症或疾病的状态；延迟病状、病症或疾病的发作或减缓其进展；改善病状、病症或疾病状态；以及缓解(部分或完全)、可检测或不可检测或增强或改善病状、病症或疾病。治疗包括引起临床上显著的应答而没有过量水平的副作用。治疗还包括与未接受治疗的预期存活相比延长存活。术语“预防(prevent)”、“预防(prevention)”等是指在明显的疾病或病症发作之前起作用，以防止疾病或病症发展或使疾病或病症的程度最小化，或减缓其发展过程。

本发明的实施方案可用于治疗转移，其涉及癌症从其原发部位扩散到体内其他部位。癌细胞可以脱离原发性肿瘤，渗入淋巴和血管，通过血流循环，并在身体其他地方的正常组织中的远处病灶(转移)中生长。转移可以是局部的或远处的。转移是连续的过程，取决于肿瘤细胞从原发性肿瘤脱落、穿过血流并在远处部位停止。在新的部位，细胞建立血液供应并且可以生长以形成危及生命的肿块。肿瘤细胞内的刺激和抑制分子途径都调节这种行为，并且肿瘤细胞与远处部位的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。除监测特定症状外，转移最常通过单独或组合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层(CT)扫描、血液和血小板计数、肝功能研究、胸部X射线和骨扫描来检测。

还考虑了降低癌症干性的方法，其包括施用本文公开的CEACAM1抗体或其抗原结合片段。癌症干性可以指细胞自我更新和产生另外的表型上不同的细胞类型的能力。癌症干细胞(CSC)是表现出干细胞样特性的癌细胞。CSC通常表现出至少一种癌症标志，并且能够产生至少一种另外的表型上不同的细胞类型。此外，癌症干细胞能够进行不对称和对称复制。应理解，癌症干细胞可由获得干性性状的分化的癌细胞和/或获得与癌细胞相关的表型的干细胞产生。可替代地，癌症干细胞可在肿瘤内重建非基质细胞类型。

CEACAM1由许多肿瘤类型表达，并且CEACAM1可以调节肿瘤的生长和转移行为。在另一个实施方案中，CEACAM1抑制将减少肿瘤生长和转移。

巨噬细胞亚群上的CEACAM1表达与癌发生期间的纤维化相关。在另一个实施方案中，CEACAM1抑制将减少肿瘤相关的纤维化。

可通过本发明所考虑的组合物和方法治疗的癌症包括未血管化或尚未实质血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(诸如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体肿瘤。待治疗的癌症类型包括但不限于良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状上皮细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；以及其他癌和肉瘤；以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小型非裂解细胞NHL；大体积疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和Waldenstrom巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与咽病、水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征相关的异常血管增殖。患者可患有一种以上类型的癌症。

包括包含本文所述的抗体及其抗原结合片段的组合物的治疗制剂的癌症治疗方法的功效可通过通常用于评价癌症治疗的各种终点来测量，所述终点包括但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或大小缩小、进展时间、存活持续时间、无进展存活、总应答率、应答持续时间和生活质量。在癌症的情况下，治疗有效量的重组CEACAM1抗体或其抗原结合片段可减少癌细胞的数目；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与所述病症相关的一种或多种症状。在患者具有一种以上类型的癌症的情况下，重组CEACAM1抗体或其抗原结合片段的治疗有效量是有效治疗所述癌症中的至少一种的量。就重组CEACAM1抗体或其抗原结合片段用于防止生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可例如通过评估存活持续时间、无进展存活持续时间(PFS)、应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量。

检查点蛋白与特定配体相互作用，将信号发送到T细胞并切断或抑制T细胞功能。通过在其表面上表达高水平的检查点蛋白，癌细胞可以控制进入肿瘤微环境的T细胞的功能，从而抑制抗癌免疫应答。免疫检查点蛋白程序性死亡-1(PD-1)是由激活的T和B细胞表达的关键免疫检查点受体并且介导免疫抑制。PD-1是CD28受体家族的成员，其包括CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1和BTLA。已经鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，程序性死亡配体-1(PD-L1)和程序性死亡配体-2(PD-L2)，其在抗原呈递细胞以及许多人类癌症上表达并且已表明在结合PD-1时下调T细胞激活和细胞因子分泌(Freeman等人,2000；Latchman等人,2001)。抑制PD-1/PD-L1相互作用可促进有效的抗肿瘤活性。PD-1抑制剂的实例包括但不限于派姆单抗(MK-3475)、纳武单抗(MDX-1106)、西米普利单抗-rwlc(REGN2810)、匹地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(PDR001)、tisellizumab(BGB-A317)、PF-06801591、AK105、BCD-100、BI 754091、JS001、LZM009、MEDI0680、MGA012、Sym021、TSR-042。PD-L1抑制剂的实例包括但不限于：阿特珠单抗(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿维单抗(MSB0010718C)、BGB-A333、CK-301、CS1001、FAZ053、KN035、MDX-1105、MSB2311、SHR-1316。

然而，存在大量接受检查点抑制剂疗法的癌症患者群体，其(1)对这种类型的疗法没有应答(先天性或原发性抗性)或(2)最初有应答但最终发展为疾病进展(继发性或获得性抗性)。抗性癌症也可称为难治性癌症。如下文实施例中所示，分离自对PD-1/PD-L1抑制剂具有获得性抗性的患者的肿瘤相关细胞相对于分离自未暴露于PD-1抑制剂的原初患者的肿瘤相关细胞上调CEACAM1表达。当CEACAM1在获得性抗性的情况下表达时，携带CEACAM1的细胞更可能是效应记忆细胞而不是中枢记忆细胞，这与抗性患者中抗癌应答的降低一致。

因此，本文还提供了使用CEACAM1抗体及其抗原结合片段(包括但不限于本文提供的特异性CEACAM1抗体及其抗原结合片段)治疗对检查点抑制剂(诸如PD-1、PD-L1和/或CTLA-4的抑制剂)具有抗性的患者的方法。在一些实施方案中，用于治疗对PD-1、PD-L1和/或CTLA-4的抑制剂具有抗性的患者的CEACAM1抗体是CP08H03/Vk8 S29A或CP08H03/CP08F05。在一些实施方案中，抗性是先天性或原发性抗性。在一些实施方案中，抗性是继发性或获得性抗性。在一些实施方案中，施用的CEACAM1抗体(包括但不限于本文提供的CEACAM1抗体及其抗原结合片段)逆转对检查点抑制剂疗法有抗性的患者中的T细胞耗竭。任何表现出PD-1、PDL-1和/或CTLA-4抗性的癌症都适合用本发明的方法进行治疗。在一些实施方案中，将CEACAM1抗体或抗原结合片段施用于先前未接受检查点抑制剂疗法的患者。

在另一方面，本发明提供了本文提供的CEACAM1抗体和抗原结合片段在治疗对使用其他检查点抑制剂的疗法具有抗性的患者中的用途，所述其他检查点抑制剂包括但不限于PD-L2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM-3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族并且在所有NK、γδ和记忆CD8⁺(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7)。

在另一方面，本发明提供了使用本文公开的CEACAM1抗体及其抗原结合片段治疗需要减少和/或预防白色念珠菌和/或表达细菌粘附素的细菌(包括但不限于大肠杆菌，特别是扩散性粘附大肠杆菌(DAEC)、奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、共生奈瑟氏球菌、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、幽门螺杆菌和/或沙门氏菌属)对哺乳动物上皮的定殖。在另一方面，本发明提供了使用本文公开的CEACAM1抗体及其抗原结合片段减少流感病毒的复制和/或减少与流感病毒感染相关的促炎细胞因子或趋化因子的释放的方法。在一些实施方案中，流感病毒是H5N1。在另一方面，本发明提供了使用本文公开的CEACAM1抗体剂其抗原结合片段治疗需要减少和/或预防子线虫(诸如班氏吴策线虫)感染的受试者的方法。在另一方面，本发明提供了使用本文公开的CEACAM1抗体及其抗原结合片段治疗需要减少和/或预防与子线虫(诸如班氏吴策线虫)感染相关的淋巴水肿和/或鞘膜积液发展的受试者的方法。在一个实施方案中，本发明提供了使用本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段在有需要的受试者中减少丝虫对受试者的淋巴系统的侵袭的方法。在一个实施方案中，子线虫是班氏吴策线虫。受试者可被一种以上的表达细菌粘附素的细菌、白色念珠菌、流感病毒和/或子线虫感染。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段在有需要的受试者中减少癌细胞对受试者的淋巴系统的侵袭的方法。

筛选方法

本文还提供了鉴定可能对用本文提供的CEACAM1抗体和抗体片段(包括但不限于CP08H03/Vk8 S29A和CP08H03/CP08F05)的治疗有应答的患者群体的方法。

在一些实施方案中，筛选癌症患者的某些细胞类型上的CEACAM1表达，所述细胞类型包括T细胞、NK细胞、肿瘤细胞或肿瘤微环境中的其他细胞，诸如巨噬细胞。在一些实施方案中，选择与对照相比在某些细胞类型上示出增加的CEACAM1表达的癌症患者，用于用本文提供的CEACAM1抗体和抗体片段进行治疗。CEACAM1表达的“对照”水平可指不患有癌症的一个或多个个体中的CEACAM1表达的水平。所述水平可以在逐个个体的基础上测量，或者在诸如平均值的聚合基础上测量。在一些实施方案中，来自其病状被监测的同一个体但在不同时间获得的CEACAM1表达的对照水平。在某些实施方案中，“对照”水平可指在较早时间(例如，数周、数月或数年前)从同一患者获得的水平。在一些实施方案中，对照水平在患者接受任何癌症疗法之前从所述患者获得。在一些实施方案中，对照水平在患者接受检查点抑制剂治疗之前从所述患者获得。

在一些实施方案中，针对对检查点抑制剂疗法(包括但不限于用PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制剂的疗法)有抗性的患者测定CEACAM1表达。在一些实施方案中，选择对检查点抑制剂疗法具有抗性并且与对照相比在某些细胞类型上示出增加的CEACAM1表达的患者，用于用本文提供的CEACAM1抗体和抗体片段(包括但不限于CP08H03/Vk8 S29A和CP08H03/CP08F05)治疗。

在一些实施方案中，测定患者的人CEACAM1的等位基因变体。基于患者表达的人CEACAM1的等位基因变体，与表达CEACAM1的野生型变体的患者相比，可以向患者施用更多或更少的抗CEACAM1抗体。在一些实施方案中，测定患者中CEACAM1的Y34C、Q44L和/或Q89H等位基因变体的存在。在一些实施方案中，与表达CEACAM1的野生型变体的患者相比，向表达CEACAM1的Y34C、Q44L和/或Q89H等位基因变体的患者施用更高和/或更频繁剂量的抗CEACAM1抗体。

药物组合物

在另一方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配制的治疗有效量的本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合片段。

活性剂的剂量可根据使用原因、个体受试者和施用模式而变化。可以基于受试者的体重、受试者的年龄和健康以及化合物或组合物的耐受性来调整剂量。例如，根据疾病，对于抗体或其抗原结合片段，这可能需要0.1、1.0、3.0、6.0或10.0mg/Kg。对于分子量为150,000g/摩尔的IgG(两个结合位点)，这些剂量对应于5L血液体积的约18nM、180nM、540nM、1.08μM和1.8μM的结合位点。

可以根据本领域已知的方法将活性剂和赋形剂配制成组合物和剂型。本发明的药物组合物可以被特别配制成固体或液体形式，包括适于肠胃外施用的那些形式，例如通过皮下、肿瘤内、肌内或静脉内注射，例如作为无菌溶液或悬浮液。

包含结合CEACAM1的抗体或其抗原结合片段的治疗组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配制，所述药学上可接受的赋形剂可以是药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、载剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、溶剂或包封材料，其涉及携带或转运用于向受试者施用的治疗化合物、填充剂、盐、表面活性剂和/或防腐剂。可用作药学上可接受的赋形剂的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；明胶；滑石；蜡；油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如乙二醇和丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂；水；等渗盐水；pH缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒性相容物质。

填充剂是增加药物制剂的质量并有助于冻干形式的制剂的物理结构的化合物。根据本发明合适的填充剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。

表面活性剂的使用可以减少重构蛋白质的聚集和/或减少重构制剂中颗粒的形成。所加入的表面活性剂的量应能减少重构蛋白质的聚集并使重构后颗粒的形成最小化。根据本发明的合适的表面活性剂包括聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、椰油酰胺基丙基、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基-二甲胺；甲基椰油基钠或甲基油基牛磺酸二钠；和聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。

防腐剂可用于本发明的制剂中。用于本发明制剂的合适的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲铵氯化物、苯扎氯铵(烷基苄基-二甲基氯化铵的混合物，其中烷基是长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇诸如苯酚、丁基和苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。其他合适的赋形剂可以在标准药学教科书中找到，例如"Remington'sPharmaceutical Sciences",The Science and Practice of Pharmacy,第19版MackPublishing Company,Easton,Pa.,(1995)。

包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂的组合物可以包含各种浓度的本文所述的CEACAM1抗体或其抗原结合部分。例如，组合物可包含10mg/ml至200mg/ml、25mg/ml至130mg/ml、50mg/ml至125mg/ml、75mg/ml至110mg/ml或80mg/ml至100mg/ml的抗体或其抗原结合片段。组合物还可以包含约10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml或150mg/ml的抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，将包含抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂的组合物冻干并提供在组合物中，用于在施用前重构。

施用方法

包含所考虑的抗体或其抗原结合片段的治疗组合物可以以任何方便的方式施用，包括通过注射、输液、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、颅内、通过静脉内或淋巴内注射或腹膜内施用于患者。在一个实施方案中，本发明的细胞组合物优选通过静脉内注射施用。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过静脉内输注施用于哺乳动物，即在一定时间段内将抗体或其抗原结合片段引入哺乳动物的静脉。在某些实施方案中，所述时间段为约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时或约8小时。

在某些实施方案中，化合物或组合物的剂量每天、每隔一天、每两天、每三天、每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次或每月一次施用于受试者。在其他实施方案中，两剂、三剂或四剂化合物或组合物每天、每两天、每三天、每周一次、每两周一次或每月一次施用于受试者。在一些实施方案中，化合物或组合物的剂量施用2天、3天、5天、7天、14天，21天或28天。在某些实施方案中，化合物或组合物的剂量施用1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。

组合疗法

在一方面，本发明提供了与另外的治疗剂一起施用的CEACAM1抗体或其抗原结合片段。此类另外的药剂包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、生长抑制剂、抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂和抗感染剂。用于此类组合疗法中的药剂可属于一种或多种前述类别。抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂的施用可以是同时或连续的。抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂的施用可以是分开的或作为混合物。此外，本发明所考虑的治疗方法可涉及与一种或多种癌症疗法组合的治疗，所述癌症疗法选自抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法的组。

示例性的另外的治疗剂还包括具有高能电离辐射的放射性核素，其能够引起核DNA中的多链断裂，并因此适用于诱导(例如癌症的)细胞死亡。示例性高能放射性核素包括：⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。这些同位素通常产生具有短路径长度的高能α或β粒子。此类放射性核素杀死与其紧邻的细胞，例如缀合物已连接或已进入的赘生性细胞。它们对非定位细胞的影响很小或没有影响，并且基本上是非免疫原性的。

示例性的另外的治疗剂还包括细胞毒性剂，诸如细胞生长抑制剂(例如烷化剂、DNA合成抑制剂、DNA嵌入剂或交联剂、或DNA-RNA转录调节剂)、酶抑制剂、基因调节剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血管生成剂等。

示例性的另外的治疗剂还包括烷化剂，诸如蒽环类药物家族(例如，阿霉素、洋红霉素、环孢菌素-A、氯喹、甲氨喋呤、光神霉素、紫菜霉素、链霉素、蒽二酮和氮丙啶)。在另一个实施方案中，化疗部分是细胞生长抑制剂，诸如DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤和二氯甲氨蝶呤、3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物、氨基蝶呤、胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟-5′-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲、放线菌素-D和丝裂霉素C。示例性DNA嵌入剂或交联剂包括但不限于博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、顺二氯二氨基铂(II)(顺铂)、美法仑、米托蒽醌和奥沙利铂。

示例性另外的治疗剂还包括转录调节剂，诸如放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、高三尖杉酯碱和伊达比星。与本发明相容的其他示例性细胞生长抑制剂包括安莎霉素苯醌、醌类衍生物(例如喹诺酮、染料木素、bactacyclin)、白消安、异环磷酰胺、氮芥、三亚胺醌、地吖醌、卡波醌、吲哚醌EO9、二乙烯亚氨基苯醌甲基DZQ、三亚乙基磷酰胺和亚硝基脲化合物(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀)。

示例性另外的治疗剂还包括细胞毒性核苷，例如像腺嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、替加氟和6-巯基嘌呤；微管蛋白结合剂，诸如紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛、紫杉烷)、诺考达唑、根毒素、多拉司他汀(例如多拉司他汀10、11或15)、秋水仙碱和类秋水仙碱(例如ZD6126)、考布他汀(例如考布他汀A-4、AVE-6032)和长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨(诺维本))；抗血管生成化合物，诸如血管抑素K1-3、DL-α-二氟甲基-鸟氨酸、内皮抑素、烟曲霉素、染料木黄酮、米诺环素、星形孢菌素和(±)-沙利度胺。

示例性另外的治疗剂还包括激素和激素拮抗剂，诸如皮质类固醇(例如泼尼松)、孕激素(例如羟孕酮或甲羟孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬)、雄激素(例如睾酮)、芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特)、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺、芹菜素、布雷菲德菌素A、西咪替丁、二氯亚甲基二膦酸、亮丙瑞林、促黄体激素释放激素、pifithrin-α、雷帕霉素、性激素结合球蛋白和毒胡萝卜素。

示例性另外的治疗剂还包括酶抑制剂，诸如S(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、5,6-二氯苯咪唑1-β-D-呋喃核糖苷、依托泊苷、福美坦、福司曲星、牛奶树碱、2-亚氨基-1-咪唑烷乙酸(环肌酸)、麦维诺素、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑制剂AG 34和酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879。

示例性另外的治疗剂还包括基因调节剂，诸如5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、胆钙化固醇(维生素D3)、4-羟基他莫昔芬、褪黑激素、米非司酮、雷洛昔芬、反式-视黄醛(维生素A醛)、视黄酸、维生素A酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬和曲格列酮。

示例性另外的治疗剂还包括细胞毒性剂，例如像蝶啶家族药物、烯二炔类和鬼臼毒素类。这些种类中特别可用的成员包括，例如，甲氨喋呤、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，诸如依托泊苷或磷酸依托泊苷、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱等。

与本文教导相容的再其他另外的治疗剂包括奥瑞他汀类(例如奥瑞他汀E和单甲基奥瑞他汀E)、卡奇霉素、短杆菌肽D、美登木素生物碱(例如美登素)、新制癌菌素、托泊替康、紫杉烷、细胞松弛素B、溴化乙锭、依米汀、替尼泊苷、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同系物。

在一个实施方案中，CEACAM抗体或其抗原结合片段与作为检查点抑制剂的药剂组合施用。此类抑制剂可包括小分子抑制剂或可包括结合并阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段或者结合并阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可以被靶向以用于阻断或抑制的说明性检查点分子包括但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM-3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2家族分子并且在所有NK、γδ和记忆CD8⁺(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。检查点抑制剂包括结合并阻断或抑制CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、TIM-3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049中的一种或多种的活性的抗体或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂或小分子。说明性免疫检查点抑制剂包括曲美木单抗(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40和Yervoy/伊匹单抗(抗CTLA-4检查点抑制剂)以及上述PD-1和PD-L1抑制剂。检查点蛋白配体包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。

在一些实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体及其抗原结合片段与TIGIT、LAP、Podoplanin、蛋白C受体、ICOS、GITR、CD226或CD160抑制剂一起施用。

在一些实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体及其抗原结合片段与CTLA-4、PD-1、PD-L1或PD-L2抑制剂一起施用。在一些实施方案中，本文所述的CEACAM1抗体及其抗原结合片段与TIM-3抑制剂一起施用。

应当理解，本发明不限于所述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可以变化。与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案。还应理解，本说明书中本发明的公开内容包括此类特定特征的所有可能组合。例如，在本发明的特定方面或实施方案或特定权利要求的上下文中公开了特定特征的情况下，所述特征也可以在可能的程度上与本发明的其他特定方面和实施方案组合使用和/或在本发明的其他特定方面和实施方案的上下文中使用，并且通常在本发明中使用。

在本文中提及包括两个或更多个定义的步骤的方法的情况下，定义的步骤可以以任何顺序或同时进行(除非上下文排除该可能性)，并且所述方法可以包括在任何定义的步骤之前，在两个定义的步骤之间或在所有定义的步骤之后进行的一个或多个其他步骤(除非上下文排除那些可能性)。

所有其他引用的专利和申请通过引用整体并入本文。此外，在以引用的方式并入本文中的参考文献中的术语的定义和使用与本文中提供的这个术语的定义不一致或相矛盾时，以本文中提供的这个术语的定义为准并且参考文献中的这个术语的定义不再适用。

为了便于更好地理解本发明，给出具体实施方案的以下实施例。以下实施例不应理解为限制或限定本发明的整个范围。

实施例

实施例1：完全人源化CEACAM1抗体的产生

1.人源化抗体变体的产生

复合人抗体可变区序列的设计和抗体的表达

首先，使用Swiss PDB产生亲本鼠CEACAM1抗体的V区的结构模型，并进行分析以便鉴定V区中可能有助于抗体结合特性的潜在“限制”氨基酸。对于CDR之外且侧接CDR的区域，广泛选择的人序列区段被鉴定为新的人源化V区的可能组分。

基于结构分析，选择可用于产生人源化CEACAM抗体变体的一大组初步序列区段，并使用用于计算机分析结合人MHC II类等位基因的肽的iTope^TM技术(Perry等人,2008.Drugs RD 9(6):385-396)以及使用TCED^TM已知抗体序列相关的T细胞表位(Bryson等人2010,Biodrugs 21(1):1-8)进行分析。将鉴定为人MHC II类的重要非人种系结合物或对TCED^TM获得显著命中得分的序列区段丢弃。这种分析得到一组减少的区段，并如上所述再次分析这些区段的组合，以确保区段之间的连接不含有潜在的T细胞表位。将所选择的序列区段组装成完全V区序列，其缺乏重要的T细胞表位。选择用于基因合成、在哺乳动物细胞中表达和活性测试的重链和轻链列于

表1中。

表1中的一些重链和轻链在根据Kabat CDR定义但不根据IMGT CDR定义被认为是CDR的一部分的位置处含有变异。

表1.选择用于基因合成的重链和轻链。

接着，合成具有侧翼限制酶位点的亲本鼠CEACAM1抗体和人源化CEACAM抗体变体的V_H和Vκ序列，用于克隆到IgG4(S241P)重链和κ轻链的pANT表达载体系统中(图1)。V_H区克隆在MluI与HindIII限制位点之间，并且Vκ区克隆在BssHII与BamHI限制位点之间。通过测序确认所有构建体。

使用PEI转染方法将三十九个重链和轻链配对瞬时转染到HEK EBNA粘附细胞中，并在转染后孵育5-7天。这39个配对包括三个对照：(1)嵌合抗体V_H0/Vκ0(由融合至人IgG4的恒定重链区的鼠V_H区(V_H0)和融合至人IgG4的恒定轻链区的鼠Vκ区(Vκ0)组成)；(2)嵌合VH重链(V_H0)与轻链变体Vκ1的配对；和(3)V_H1重链与嵌合Vκ轻链变体(Vκ0)的配对。其他36个是复合IgG4 V_H和Vκ变体的组合：V_H1与Vκ1至Vκ12配对，V_H2与Vκ1至Vκ12配对，V_H3与Vκ1至Vκ6配对，并且V_H4与Vκ1至Vκ6配对。

在蛋白质A琼脂糖柱上从细胞培养物上清液中纯化抗体，将缓冲液更换为PBS pH7.4，并使用基于预测的氨基酸序列的消光系数通过OD 280nm进行定量。通过SDS-PAGE分析1μg的每种抗体，并且观察到对应于典型抗体谱的条带。轻链的大小和在25kDa处微弱条带的存在表明基本上利用了轻链中鉴定的糖基化基序。

结合CEACAM1的人源化变体的竞争ELISA分析

在竞争ELISA测定中评估价纯化的抗体与人CEACAM1的结合。将Nunc ImmunoMaxiSorp 96孔平底微量滴定板用1x PBS中的1μg/ml GST-CEACAM1预涂覆，在4℃过夜。第二天，将平板在室温(“RT”)下用2％BSA/PBS封闭1小时，然后用PBST pH 7.4洗涤3次。将100μg/ml至0.07或0.002μg/ml的嵌合抗体V_H0/Vκ0、无关IgG4抗体和人源化CEACAM1抗体的3倍稀释系列与恒定浓度的亲本鼠抗体(0.45μg/ml终浓度)预混合，加入到平板中并在室温下孵育1小时。3x PBST洗涤后，用抗小鼠-HRP和TMB底物检测亲本鼠CEACAM1抗体的结合。用3MHCl终止反应，在Dynex Technologies MRX TC II酶标仪上在450nm处读取吸光度并绘制结合曲线。将人源化CEACAM抗体变体与CEACAM1的结合与包含在各平板上的嵌合抗体(V_H0/Vκ0)进行比较。36个人源化CEACAM抗体变体中的十二个显示不结合CEACAM1(包括Vκ3、Vκ4和Vκ5的那些)。与嵌合抗体V_H0/Vκ0相比，结合CEACAM1的变体显示0.9至5.2的相对IC50值范围。数据总结在表2中。

表2.人源化CEACAM抗体变体和对照抗体滴度和结合数据的总结。抗体表达滴度(μg/ml)来自静态HEK EBNA瞬时转染。将竞争测定中获得的IC50值归一化为同一平板上的嵌合抗体V_H0/Vκ0。未结合的抗体不包括在表中。将以粗体表示的抗体用于多循环动力学分析。

结合CEACAM1的人源化变体的动力学分析

作为评估36种抗体组合和三种对照抗体与CEACAM1的结合的替代方法，在运行Biacore T200评价软件V2.0.1(Uppsala，Sweden)的Biacore T200(系列号1909913)上进行动力学分析。所有实验均在25℃下用HBS-P+运行缓冲液(pH 7.4)(GE Healthcare，目录号BR100671)进行。使用His标记的CEACAM1作为分析物进行所有动力学实验。对于所有实验，将抗体固定在S系列蛋白质A传感器芯片表面上。对于动力学实验，限制固定/捕获配体的量以避免芯片表面的质量传递效应，其中所述表面理想地具有50-150RU的分析物结合水平(R_max)。对于所有样品抗体的捕获设定使用CEACAM1分析物的45kDa的MW、150kDa的抗体配体(IgG的估计值)、50RU的Rmax以及因为每个抗体能够结合2个靶分子而为2的化学计量(Sm)，约75RU的靶应答水平，。

对纯化的抗体(Vκ1至Vκ6变体)或瞬时转染的HEK EBNA细胞的上清液(Vκ7至Vκ12变体)进行36种抗体组合和三种对照抗体的单循环分析。在一些情况下，当上清液不可用时，将纯化的嵌合抗体V_H0/Vκ0添加到HEK EBNA培养基中以用作阳性对照。将抗体在HBS-P+中稀释至1μg/ml的浓度(通过IgG定量ELISA测定)。在每个循环开始时，将抗体加载到蛋白质A芯片的Fc2、Fc3和Fc4上，并以8μl/分钟的流速捕获IgG，以得到约75的RU。然后使表面稳定。以50μl/分钟的流速获得单循环动力学数据以使任何潜在的传质效应最小化。对嵌合抗体V_H0/Vκ0进行多次重复以在动力学循环中检查表面和分析物的稳定性。从Fc2、Fc3和Fc4的信号中减去来自参考信道Fc1(无抗体)的信号，以校正与参考表面的非特异性结合的差异。使用在各浓度之间没有再生的3.125至50nM CEACAM1的5点2倍稀释范围。监测5次递增浓度的CEACAM1注射的缔合相100秒并在CEACAM1的最后一次注射后，测量单个解离相150秒。使用2次注射10mM甘氨酸-HCl pH 1.5进行蛋白质A表面的再生，然后是500秒的稳定期。减去来自每种抗体空白运行(无CEACAM1)的信号以校正表面稳定性的差异。单循环动力学(

表3)表明24个人源化变体与CEACAM1结合，而12个变体不结合。当与任何人源化重链组合时，Vκ3、Vκ5和Vκ6的轻链消除了CEACAM1结合。这些数据与竞争ELISA数据一致(表2)。

表3.使用Biacore T200测定的人源化CEACAM抗体变体和对照抗体与CEACAM1-HIS结合的单循环动力学参数。通过将人源化CEACAM1抗体变体的K_D除以同一实验中测定的嵌合抗体V_H0/Vκ0的K_D来计算与嵌合抗体V_H0/Vκ0相比的相对K_D。将以粗体表示的抗体用于多循环动力学分析。S/N，上清液。表中不包括非结合变体。

在结合CEACAM1的24种抗体中，将表现出在嵌合抗体V_H0/Vκ0的2倍内且具有0.9至1.8范围内的相对IC50的结合的抗体变体用于使用Biacore的多循环动力学分析：V_H1/Vκ2、V_H1/Vκ7、V_H1/Vκ8、V_H1/Vκ9、V_H1/Vκ10、V_H1/Vκ12、V_H2/Vκ7、V_H2/Vκ8、V_H2/Vκ9、V_H2/Vκ10、V_H2/Vκ11和V_H2/Vκ12(见表2和

表3，以粗体突出显示)。

对于多循环动力学分析，将纯化的抗体以1μg/ml的蛋白质浓度固定在HBS-P+中。在每个循环开始时，在蛋白质A上捕获抗体，以得到约75的RU，并使表面稳定。以80μl/分钟的流速获得动力学数据以使任何潜在的传质效应最小化。将空白(无CEACAM1)的多次重复和单一浓度的分析物的重复编程到动力学运行中，以便在动力学循环中检查表面和分析物的稳定性。对于动力学分析，选择200至3.125nM或100至1.5625nM CEACAM1的2倍稀释范围。监测CEACAM1的缔合相50或150秒，并且测量解离相100秒。在每个循环结束时，使用两次注射10mM甘氨酸-HCL pH 1.5进行蛋白质A表面的再生。

从Fc2、Fc3和Fc4的信号中减去来自参考信道Fc1的信号以校正与参考表面的非特异性结合的差异，在1对1结合模型中使用全局Rmax参数。通过将人源化CEACAM抗体变体的K_D除以同一芯片上的嵌合抗体V_H0/Vκ0的K_D来计算与V_H1/Vκ0相比的相对K_D。针对CEACAM1与人源化CEACAM抗体变体的相互作用测量的动力学参数在表4中示出。表5总结了使用多循环动力学分析的12种抗体组合获得的平均相对K_D。

结合CEACAM1的人源化变体的选择性分析

通过流式细胞术在用CEACAM1、3、5、6和8转染的HeLa细胞上测试结合CEACAM1的24种人源化抗体变体(参见表3)以及嵌合对照抗体V_H0/Vκ0对CEACAM1的结合选择性。如图2所示，大多数变体对CEACAM1具有高度选择性，并且对CEACAM3、5、6或8表现出很少的结合或没有结合。与嵌合对照抗体V_H0/Vκ0相比，所有24种变体表明与CEACAM5的结合降低。没有HeLa-CEACAM3或HeLa-CEACAM8转染子的任何染色的证据。因此，未报告此数据。由于其对CEACAM1的有利亲和力和选择性以及其有利的表达水平，因此选择V_H1/Vκ8作为亲和力成熟的框架。

表4.使用Biacore T200测定的结合CEACAM1-HIS的复合人抗体变体的多循环动力学数据(n＝1)。通过将人源化CEACAM抗体变体的K_D除以在同一芯片上测定的嵌合抗体V_H0/Vκ0的K_D来计算与嵌合抗体V_H0/Vκ0相比的相对K_D。

表5.从使用Biacore T200测定的多循环动力学获得的所有人源化CEACAM抗体变体与嵌合抗体V_H0/Vκ0相比的相对K_D的总结。通过将测试抗体变体的K_D除以每个芯片上测试的嵌合抗体V_H0/Vκ0的K_D来计算与嵌合抗体V_H0/Vκ0相比的K_D的倍数差异。示出了每个变体的独立实验的数目。

2.N-连接的/HEK-衍生的糖基化的去除

序列分析在原始小鼠杂交瘤轻链CDR1中示出了潜在的N连接的糖基化基序。亲本鼠抗体的CDR1L含有N-X-S/T共有序列(根据Kabat编号的N26和S29，对应于轻可变链的一级氨基酸序列中的残基26和28，参见图3C)，这使得N26残基成为N连接的糖基化的靶标。为了降低潜在的糖基化相关的免疫原性，设计两个CDR突变以去除N-X-S/T共有序列(糖基化位点)：N26Q和S29A(Kabat编号方案)。任一残基的突变都消除糖基化，如图4所示。

进行竞争ELISA实验(参见表6)、多循环动力学分析(参见表7)和选择性分析(参见表8)以证实突变嵌合体与CEACAM1的结合。与抗体突变体N26Q相比，抗体突变体S29A(Kabat编号方案)表现出更高的表达水平和与未突变的抗体更相似的K_D(参见表9)，同时保持对CEACAM1的高选择性。因此，在进一步开发期间，将S29A突变(Kabat编号方案)并入CEACAM1前导抗体中。

表6.使用非糖基化嵌合抗体的竞争ELISA实验的结果。CDR1L残基根据Kabat编号方案编号。

表7.使用非糖基化嵌合抗体的多循环动力学分析。CDR1L残基根据Kabat编号方案编号。

表8非糖基化人源化变体的选择性分析。CDR1L残基根据Kabat编号方案编号。使用分别用表达CEACAM1、CEACAM5和CEACAM6的载体转染的HeLa细胞，通过流式细胞术评估抗体变体的结合选择性。所示为表达由所示抗体结合的相应抗原的细胞的相对量。

表9.非糖基化嵌合抗体的实验总结。CDR1L残基根据Kabat编号方案编号。

3.非糖基化的CEACAM1抗体VH1/VK8 S29A的亲和力成熟噬菌体载体构建和亲本V_H1/VK8 S29A scFv的结合测试

为了前导抗体V_H1/VK8之一的亲和力成熟，构建编码V_H1和VK8的基因并使用重叠PCR将其转化成scFv形式，其中重链经由15个氨基酸(G₄S)₃接头连接至轻链。CDR1L残基S29根据Kabat编号方案编号并且对应于轻可变链的一级氨基酸序列中的残基28(图3C)。然后使用限制酶Sfi I和Not I将scFv序列克隆到噬菌粒载体pANT43中，使得scFv在噬菌体表面上作为基因III融合蛋白展示(图5)。将克隆的scFv转化到大肠杆菌(TG1)中并通过测序确认所有构建体。制备含有亲本V_H1/VK8 S29A scFv或无关的scFv的噬菌体并测试与GST-CEACAM1的结合(图6)。衍生自亲本V_H1/VK8 S29A序列的噬菌体与抗原特异性结合，因为无关的噬菌体没有观察到结合。

诱变和文库构建

为了构建亲和力成熟文库，使用半随机密码子靶向非糖基化人源化抗体V_H1/Vκ8S29A的CDR1H、CDR3H和CDR3L内的特定氨基酸用于“热点”诱变。分析可能的接触残基的序列位置，并在每个块内按顺序排序。此信息与CDR3中任何给定位置的氨基酸偏好和亲本鼠抗体的晶体结构一起使用。在可能的情况下，优先考虑每个块内排序最高的接触残基。

生成四个不同的文库：一个文库用于CDR1H(HC)的突变，两个文库用于CDR3H的突变，一个文库用于CDR3L的突变(参见图7)。

CDR1H被鉴定为长度为五个氨基酸(S31至S35)(Kabat定义，对应于重可变链的一级氨基酸序列的残基31-35，参见图3A)，其中IMGT CDR1H定义(G26至G33)覆盖更延伸的区域。综合考虑并结合亲本鼠抗体的晶体数据，G26至S35包含在单个文库中，其中每个位置包括氨基酸的子集。

CDR3H被鉴定为长度为12个氨基酸(根据Kabat定义的H95-Y102，对应于重可变链的一级氨基酸序列的残基99-110，参见图3A)。对于诱变，将CDR3H分成在D100处重叠的两个文库(根据Kabat定义，对应于重可变链的一级氨基酸序列的残基104，参见图3A和3B)：块1(根据Kabat定义的R94至D100，对应于重可变链的一级氨基酸序列中的残基98至104，参见图3A和3B)和块2(根据Kabat定义的D100至Y102，对应于重可变链的一级氨基酸序列中的残基104至110，参见图3A和3B)，其中每个块在所有位置中含有氨基酸的子集。包括位置R94(根据Kabat定义，对应于重可变链的一级氨基酸序列的残基98，参见图3A和3B)(块1)以允许锚定CDR的种系残基中更多的多样性。

CDR3L被鉴定为长度为9个氨基酸(Q89-T97)(根据Kabat定义，对应于轻可变链的一级氨基酸序列的残基88至96，参见图3C)。区域Q90至P96(根据Kabat定义，对应于轻可变链的一级氨基酸序列的残基89至97，参见图3C)包含在单个文库中，其中每个位置包括氨基酸的子集。Kabat编号用于所有蛋白质序列坐标。

图8A、8B和8C示出了文库构建的概述。制备含有V_H1/Vκ8S29A亲本scFv的截短片段以及待随机化区域中的两个连续终止密码子的非表达质粒。此步骤的目的是降低亲本scFv产生并主导选择的可能性(如在亲和力成熟过程中偶尔观察到的)，使得只有通过PCR产生的重组抗体片段能够在噬菌粒载体中形成功能性scFv。

对于CDR3L文库，通过进行两次PCR进行CDR3L的随机化。在第一次PCR中，使用随机化3′引物和含有Sfi I限制性位点的V_H FW1特异性5′引物来扩增大部分scFv基因并将突变引入VκCDR3中。第二次PCR添加了scFv的其余部分并附加了限制性位点(Not I)，用于片段的亚克隆。

对于V_H文库，通过使用含有全长亲本scFv部分的两个模板进行两次PCR来进行V_H库的PCR。最初，用随机化的5′文库引物和对Vκ轻链FW4具有特异性的3′引物扩增V_H。在单独的PCR中，用基于重链FW1区的5′引物加上与V_H CDR随机化引物的一部分互补的3′引物扩增V_H的其余部分。然后通过退火两个扩增片段并通过使用附加两个用于片段的亚克隆的限制性位点(Sfi I或Not I)的引物的PCR再扩增scFv来构建全长V_H CDR随机化scFv文库。

为了评估生成的文库的多样性，然后使用Sfi I和Not I消化所有四个文库的纯化的扩增DNA，并连接到类似切割的噬菌粒载体(pANT43)中。将连接的DNA沉淀，重悬于无核酸酶的水中，并通过电穿孔转化到新鲜制备的电感受态TG1细胞中。第二天，计数集落，刮平板并制备甘油储液。将文库电穿孔多次以便充分覆盖理论文库多样性。在所有情况下，获得4.0倍或更大的覆盖率。对来自四个文库中每一个的单个集落进行测序以证实适当的CDR块已经突变。

使用至少10x观察到的文库多样性的接种物将来自每个文库的细菌接种到150ml2TYCG(2％)培养物中。培养物生长至对数中期(OD_600nm≈0.5-0.6)，并且估计细胞总数(基于OD_600nm为1≈5x10⁸个细胞/ml)。加入辅助噬菌体并孵育1小时，然后离心，重悬于2TYCK培养基中并在30℃生长过夜。第二天，通过离心回收培养上清液，然后使用4/10x体积的冷却的20％PEG/2.5M NaCl沉淀来收获噬菌体。在冰上孵育1小时后，通过离心回收沉淀的噬菌体，并将沉淀重悬于1x PBS pH 7.4中。再离心上清液以除去任何细胞碎片，然后如上所述再沉淀上清液。将沉淀的噬菌体重悬于1x PBS pH 7.4中并过滤除菌。为了增加获得具有增加的亲和力的scFv的机会，由于起始抗体的相对低的亲和力，多价超噬菌体M13 K07ΔpIII辅助噬菌体以20的感染复数用于文库复苏。在第一轮选择之后，由于预期抗原结合物的富集，使用感染复数为10的单价M13K07辅助噬菌体。

亲和力改善的噬菌体选择

实施两种单独的选择策略以增加获得亲和力改善的噬菌体的可能性。CEACAM1在整个选择中被生物素化(用于可溶性选择)或未生物素化(用于固相淘选)。在第1轮在不同的选择级联中使用可溶性选择(活动1)或固相淘选(活动2)以富集功能性结合噬菌体和多样性。使用密切相关的家族成员CEACAM5和CEACAM6的取消选择通过以1μg/ml每种蛋白质的单独淘选来进行，以尝试和降低交叉反应性。这通过或者在任何一轮选择之前和第2轮之前(活动1)或者在第二和第三轮选择之前(活动2)取消选择在每个活动期间进行两次。对于两个活动，四个文库在所有阶段保持分离。

对于可溶性选择，用PBSB预封闭每个文库，然后将噬菌体与递减浓度的生物素化CEACAM1抗原一起孵育至多三小时。孵育后，将链霉亲和素顺磁珠(如上预封闭)加入到每个选择，并颠倒旋转15分钟。链霉亲和素-抗原-噬菌体复合物在每轮连续选择中使用递增次数的PBST洗涤进行洗涤，然后是PBS洗涤，在每个步骤之间用磁体捕获。通过加入50mM HCl从珠上洗脱噬菌体，然后通过加入1M Tris-HCl pH 9.0中和溶液。

固相淘选和所有取消选择在用抗原涂覆的Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板上在4℃过夜进行，然后用PBSB封闭。为了取消选择，将预封闭的噬菌体与CEACAM5一起孵育，然后与CEACAM6一起孵育，然后除去未结合的噬菌体并用于随后的选择。对于CEACAM1淘选，将预封闭的噬菌体与8μg/ml抗原一起孵育，然后用3x PBST和2x PBS洗涤平板。与可溶性选择一样，用50mM HCl洗脱结合的噬菌体。对于可溶性选择和淘选，将洗脱的噬菌体加入到对数中期大肠杆菌TG1中，并在37℃下感染细胞1小时，然后在2TYCG(2％)平板上铺板并在37℃生长过夜。第二天，挑取集落进行筛选，或者刮取平板，并如上所述复苏噬菌体。图9A和9B示出了所使用的不同选择策略的概述。

scFv的表达和初始测试

可溶性scFv最初作为粗周质提取物表达和测试。将单个集落挑入1ml 2TYCG(0.1％)培养基中并通过在37℃下振荡5小时使其生长。通过加入IPTG至终浓度为1mM来诱导培养物，然后在30℃振荡生长过夜。第二天，将培养物离心并弃去上清液。将细菌沉淀重悬于三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液pH 7.4中并在冰上孵育30分钟。然后将细胞离心并弃去上清液。将沉淀重悬于冰冷的5mM MgSO₄中。然后将平板离心，将含有scFv的上清液转移到新鲜平板上用于测定。

在单点结合测定中根据其结合GST-CEACAM1的能力筛选来自不同轮次选择的菌落的周质提取物。在每个测定平板上包括亲本scFv(V_H1/Vκ8S29A)和无关scFv用于比较。

通过用PBSB 1:1稀释封闭周质提取物，然后在用1.0μg/ml GST-CEACAM1预涂覆的Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板上在室温下孵育1小时。随后洗涤平板，并且用抗HIS6-HRP抗体和TMB底物检测scFv的结合。用1M HCl终止反应，在Dynex TechnologiesMRX TC II酶标仪上在450nm处读取吸光度，并绘制结合数据。

基于在结合ELISA中相对于亲本scFv V_H1/Vκ8S29A(其含有小鼠CDR)和在同一平板上测定的无关scFv的活性来鉴定改善的克隆。分析了大于4400个周质提取物，对在两个独立实验中结合比亲本至少高1.5的34种前导序列进行测序，并鉴定了独特的克隆。对所获得的序列的检查显示，在几个位置发现了亲本氨基酸，但由与亲本不同的密码子编码。这表明选择按预期发生，但亲本氨基酸是此位置的优选氨基酸。基于此序列分析，将19种独特的CDR1H、三种CDR3H块1、三种CDR3H块2和9种独特的CDR3L克隆用于大规模scFv表达。表10示出了被选择作为纯化的scFv用于进一步分析的34种前导序列的总结以及这些突变体的CDR突变。

表11、表12和表13突出了使用GST-CEACAM1结合ELISA鉴定的scFv变体前导序列中亲和力成熟的CDR的保守性/可变性。

表10.使用GST-CEACAM1结合ELISA鉴定的34种scFv变体前导序列的总结。总结了scFv来源的文库和scFv进行的取消选择轮次。亲本(Vκ8S29A)CDR示于表的顶部。CDR1H、CDR3H B1、CDR3H B2和CDR3L中与亲本序列不同的突变以粗体突出显示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

表11.scFv变体前导序列中重链CDR1的CDR基序使用GST-CEACAM1结合ELISA进行鉴定。^$残基编号基于Kabat编号方案。*残基编号基于重可变链的一级氨基酸序列。CDR1H包含根据Kabat CDR定义的残基31-35和根据IMGT定义的残基26-33。

表12.使用GST-CEACAM1结合ELISA鉴定的scFv变体前导序列中重链CDR3的CDR基序。^$残基编号基于Kabat编号方案。*残基编号基于重可变链的一级氨基酸序列。^#不是根据Kabat定义的CDR的一部分。在诱变中包括残基以允许锚定CDR的种系残基中更多的多样性。

表13使用GST-CEACAM1结合ELISA鉴定的scFv变体前导序列中轻链CDR3的CDR基序。^$残基编号基于Kabat编号方案。*残基编号基于轻可变链的一级氨基酸序列。#残基在亲和力成熟过程中没有突变。

大规模ScFv表达和纯化

表达、纯化并定量所选择的克隆，以通过结合ELISA准确地测试scFv。简言之，将单个集落挑入15ml 2TYCG(2％)培养基中，并通过在30℃下振荡生长过夜。起始培养物用于接种500ml 2TYCG(0.1％)并在30℃下生长直至OD₆₀₀nm＝～0.8。通过加入IPTG至终浓度为1mM来诱导培养物，然后在30℃振荡生长过夜。第二天，将培养物离心并弃去上清液。将细菌沉淀重悬于15ml TES中并在冰上孵育15分钟。然后加入22.5ml TES(在冷水中以1:5稀释)并在冰上再孵育30分钟。然后将细胞离心，并将含有scFv的上清液转移到新试管中，然后加入MgCl₂、NaCl和咪唑至终浓度分别为1mM、300mM和20mM，以减少非特异性结合。加入Ni-琼脂糖珠并通过在4℃下旋转孵育2小时使scFv结合。通过离心使珠沉淀并用洗涤缓冲液(25mMTris pH 7.4，300mM NaCl，20mM咪唑)洗涤两次，然后使用洗脱缓冲液(25mM Tris pH 7.4，300mM NaCl，400mM咪唑)从珠上洗脱scFv。通过测量OD 280nm并使用基于预测的氨基酸序列的消光系数来定量样品。通过SDS-PAGE分析约1μg的每种scFv。观察到对应于典型scFv谱的条带。

通过ELISA测定对scFv与GST-CEACAM1的结合的评估

使用GST-CEACAM1分析亲和力成熟的纯化scFv与人CEACAM1的结合。将NuncImmuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板在4℃下用1.0μg/ml GST-CEACAM1预涂覆过夜。第二天，将V_H1/Vκ8S29A亲本scFv或测试scFv(50μg/ml至0.8μg/ml)在PBSB中的两倍稀释系列在预涂覆的ELISA平板上在RT下孵育2小时。用抗HIS6-HRP抗体和TMB底物检测scFv的结合。用3M HCl终止反应，在Dynex Technologies MRX TC II酶标仪上在450nm处读取吸光度并绘制结合曲线。示例性结合测定数据示于图10中。在每个ELISA平板上包括亲本scFv(V_H1/Vκ8S29A scFv)作为参考。在至少一个平板上包括无关scFv作为阴性对照。观察到与亲本V_H1/Vκ8S29A scFv相比，许多scFv具有改善的与CEACAM1的结合。来源于V_H和Vκ文库的scFv观察到改善的结合。所有34种scFv变体重新格式化为完整IgG以提供关于纯度和定量的更高准确度。重新格式化进一步允许分析抗体结合的亲合力组分，其受IgG的二价性质影响。如本文所用，“亲合力”是抗原结合分子(诸如本文所述的抗体或其抗体片段)与相关抗原之间的结合强度的量度。

亲和力成熟的完整抗体的构建和测试

scFv重新格式化为完整IgG

通过scFv筛选鉴定的34种变体使用引物进行PCR扩增，所述引物引入侧接的限制性酶位点用于克隆到IgG4 S241P pANTVhG4载体和κ轻链pANTVK载体中。使用Mlu I和HindIII限制性位点将25种亲和力成熟的V_H变体亚克隆到IgG4 S241P pANTVhG4载体中。类似地，使用BssH II和BamH I限制性位点将9种亲和力成熟的Vκ序列亚克隆到κ轻链pANTVK载体中。通过测序确认所有构建体。

为了表达，将25种前导人源化亲和力成熟的IgG4 V_H变体与亲本人源化非糖基化轻链(Vκ8S29A)组合。将9种前导人源化亲和力成熟的κ轻链与亲本人源化重链(V_H1)组合。使用PEI转染方法将这些组合瞬时转染到HEK EBNA粘附细胞(在6孔板中)中。转染后五至七天，收获上清液，将其通过ELISA定量并过滤用于Biacore单循环动力学分析。

人源化和亲和力成熟的前导IgG与CEACAM1的结合的单循环动力学分析

为了评估人源化亲和力成熟的重新格式化的前导IgG的结合，使用运行BiacoreT200控制软件V2.0.1和Biacore T200评价软件V3.0的Biacore T200对粗上清液进行单循环动力学分析。将抗体在HBS-P+中稀释至终浓度为0.5μg/ml。在每个循环开始时，将抗体加载到蛋白质A芯片的Fc2、Fc3和Fc4上。以10μl/分钟的流速捕获IgG，以得到约100RU的固定化水平(RL)(所计算的结合分析物后获得约50-150RU的R_max的水平)。然后使表面稳定。使用CEACAM1作为分析物以80μl/分钟的流速获得单循环动力学数据，以最小化任何潜在的传质效应。用亲本(V_H1/Vκ8S29A)抗体进行多次重复以检查表面和分析物在动力学循环中的稳定性。从Fc2、Fc3和Fc4的信号中减去来自参考信道Fc1(无抗体)的信号，以校正与参考表面的非特异性结合的差异。使用在各浓度之间没有再生的70nM至280nM CEACAM1的三点两倍稀释范围。减去来自每种抗体空白运行(无CEACAM1)的信号以校正表面稳定性的差异。每次监测三次递增浓度的CEACAM1注射的解离相80秒并在CEACAM1的最后一次注射后，测量单个解离相150秒。使用两次注射10mM甘氨酸-HCLpH 1.5进行蛋白质A表面的再生，然后是250秒的稳定期。

单循环动力学常数(

表14)表明除了一种人源化的亲和力成熟的抗体外，所有抗体都结合CEACAM1。

表14.人源化和亲和力成熟的变体和亲本(V_H1/Vκ8S29A)抗体与CEACAM1结合的单循环动力学常数。通过将人源化和亲和力成熟的变体的K_D除以在同一实验中多次测定的亲本的K_D来计算与亲本IgG相比的相对K_D。所进行的变体以粗体示出。含有突变的CDR用“+”表示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。以粗体显示的变体具有与亲本V_H1/Vκ8S29A相比>两倍的相对K_D。

鉴定了八种人源化和亲和力成熟的重链和轻链变体，其显示与亲本相比>两倍的相对K_D(在

表14中以粗体突出显示)。这些包括三种V_H变体(CP08H03、CP09B03和CP09C02)和五种κ轻链变体(CP08E01、CP08E05、CP08F05、CP08D02和CP08G09)。

CP09C02(其源自CDR1H文库)在CDR3H B1(D96G)中含有另外的点突变，其最可能在文库构建阶段通过PCR引入(参见“实施例1,1.人源化抗体变体的生成”部分)。因此，还获得了另外的重链克隆CP09E05，因为它被鉴定为在V_H CDR3 B1中仅具有这种单点突变，并因此可能有助于鉴定哪个区域参与所观察到的亲和力增加。随后获得四种V_H和五种Vκ变体用于确定重组亲和力成熟的重链和轻链是否可以具有改善的效果。

组合的前导重链和轻链抗体的表达

用亲本轻链表达后鉴定的四种人源化亲和力成熟的IgG4 V_H变体(CP08H03、CP09B03、CP09C02和CP09E05)中的每一种与五种前导人源化亲和力成熟的κ轻链(CP08E01、CP08E05、CP08F05、CP08D02和CP08G09)组合(即总共20种配对，参见表15)。作为对照，将人源化亲和力成熟的IgG4 V_H变体与亲本轻链(Vκ8S29A)组合，并将五种前导人源化亲和力成熟的κ轻链与亲本重链(V_H1)组合(即总共10种对照抗体，参见表15)。如上所述，使用PEI转染方法将组合瞬时转染到6孔板中的HEK EBNA粘附细胞中并在转染后孵育5-7天。收获上清液，将其通过ELISA定量并过滤用于在Biacore上进行单循环动力学分析。

表15.亲本V_H或前导人源化亲和力成熟的IgG4 V_H变体与亲本Vκ或前导人源化亲和力成熟的Vκ轻链的组合。具有重组的亲和力成熟的重链和轻链(黑色)的转染抗体，用亲本重链或轻链表达的亲和力成熟的抗体和亲本抗体。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

组合的前导重链和轻链抗体的单循环动力学分析

如前所述进行使用瞬时HEK上清液的单循环动力学。示出了单循环动力学的拟合数据

表16.十五种重链和轻链组合与亲本相比具有至少两倍的相对K_D。其中，六种组合(CP08H03/CP08E05、CP08H03/CP08F05、CP08H03/Vк8S29A、CP09B03/CP08E05、CP09C02/CP08E05、和CP09C02/CP08F05)获得的K_D比亲本大四倍以上(在

表16中以粗体突出显示)。将这六种变体用于大规模生产和蛋白质A纯化以用于进一步分析。单循环动力学还揭示，当组合时，发现三种变体无功能。

表16.前导V_H和Vκ组合抗体和亲本抗体与CEACAM1结合的单循环动力学常数。通过将前导V_H和Vκ组合变体的K_D除以在同一实验中测定的亲本的K_D来计算与亲本相比的相对K_D。以粗体突出显示的变体是K_D是亲本的>四倍的前导组合。含有突变的CDR用“+”表示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

四种亲和力成熟的重链CDR产生六种另外的重链变体的重组

具有大于四倍改善的六种组合包含在四个不同V_H CDR中具有突变的三种独特重链：CP08H03(CDRH3 B2)；CP09B03(CDR1H)和CP09C02(CDR3H B2和在CDR3H B1中的单个突变，其也独特地存在于CP08E05中)，参见表17。为了确定是否可以获得进一步的改善，进行了四种突变V_H CDR的重组(表18)。使用scFv特异性引物，使用穿透式PCR重组各个V_H CDR，随后使用Mlu I和Hind III限制性位点将其克隆到IgG4 S241P重链表达载体中，以产生六种新的V_H变体(8H3_9B3、8H3_9C2、8H3_9E5、9B3_9E5、8H3_9C2(CDR1)和9B3_9E5_8H3)。

表17用于重组的VH CDR。

表18重组的重链克隆。将来自四种前导V_H克隆的各个CDR重组以产生六种重组的亲和力成熟的重链。CDR1H、CDR3H B1和CDR3H B2中与亲本序列不同的突变以粗体突出显示。*残基104基于对CDR3H B2选择的序列选择。

重组V_H CDR1和CDR3重链与前导轻链的表达：

将六种重组V_H CDR1和CDR3变体(参见表18)与(1)亲本轻链(Vκ8S29A)，(2)轻链CP08E05或(3)轻链CP08F05组合。当与亲和力成熟的重链组合时，后两种轻链先前给出改善的效果(参见表16)。所得的18种组合总结于表19中。使用PEI转染方法将这些组合在6孔板中瞬时转染到HEK EBNA粘附细胞中，并在转染后孵育5-7天。收获上清液，将其通过ELISA定量并过滤用于在Biacore上进行单循环动力学分析。

表19重组的V_H CDR1和CDR3前导人源化亲和力成熟的IgG4V_H变体与亲本Vκ或两种前导人源化亲和力成熟的κ轻链的组合。与两种亲和力成熟的轻链的组合用“AM”表示，与亲本轻链的组合用“P”表示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

重组的V_H与前导V_L抗体的单循环动力学分析：

如前所述进行使用瞬时HEK上清液的单循环动力学。单循环动力学的拟合数据示出于表20中。

发现八种变体具有亲本相比大于四倍的相对K_D。其中，五个获得的K_D是亲本的六倍以上(表20中的粗体)。将五种抗体(8H3_9B3/CP08E05、8H3_9B3/CP08F05、8H3_9B3/Vк8S29A、8H3_9C2/CP08F05和9B3_9E5/CP08E05)用于大规模生产和蛋白质A纯化以用于进一步分析。

表20重组的前导人源化亲和力成熟的IgG4 V_H变体与亲本Vκ或两种前导人源化亲和力成熟的κ轻链中的一种的单循环动力学常数。通过将人源化和亲和力成熟的变体的K_D除以在同一实验中测定的亲本的K_D来计算与亲本相比的相对K_D。以粗体突出显示与亲本相比>六倍的变体。含有突变的CDR用“+”表示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

前导抗体的表达、纯化和测试

使用PEI方法将六种改善最多的组合变体(CP08H03/CP08E05、CP08H03/CP08F05、CP08H03/Vк8S29A、CP09B03/CP08E05、CP09C02/CP08E05和CP09C02/CP08F05，

在表16中以粗体突出显示)与五种改善最多的V_H CDR1和V_H CDR3重组变体(8H3_9B3/CP08E05、8H3_9B3/CP08F05、8H3_9B3/Vк8S29A、8H3_9C2/CP08F05和9B3_9E5/CP08E05，在表20中以粗体突出显示)一起瞬时转染到三角烧瓶中的HEK EBNA粘附细胞中，并在转染后孵育5-7天。在蛋白质A琼脂糖柱上从细胞培养物上清液中纯化抗体，将缓冲液更换为PBSpH 7.2，并使用基于预测的氨基酸序列的消光系数通过OD_280nm进行定量。通过SDS-PAGE分析2μg的每种抗体，并且观察到对应于典型抗体谱的条带。

纯化的前导人源化和亲和力成熟的抗体的单循环动力学分析(使用纯化的蛋白质)

使用纯化的抗体代替HEK上清液，如上所述进行单循环动力学。单循环动力学的拟合数据如表21所示。单个突变体的表达水平提供在表22中。

所有11种前导变体的结合与亲本抗体相比>四倍(参见表21)。使用纯化的IgG获得的数据与先前使用上清液获得的数据一致。

表21纯化的前导人源化亲和力成熟的抗体的单循环动力学常数。通过将人源化和亲和力成熟的变体的K_D除以在同一实验中测定的亲本的K_D来计算与亲本相比的相对K_D。CDRCDR1H、CDR3H B1、CDR3H B2或CDR1L的突变在适用时用“+”表示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

表22纯化的前导人源化亲和力成熟的抗体的表达水平。CDR CDR1H、CDR3H B1、CDR3H B2或CDR1L的突变在适用时用“+”表示。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

潜在的CD4+T细胞表位的去除

使用用于与人MHC II类等位基因结合的肽的计算机分析的iTope^TM技术(Perry等人2008)并且使用已知抗体序列相关的T细胞表位的TCED^TM(Bryson等人2010)分析11个前导抗体的序列(参见表21)，以确保在亲和力成熟过程中没有引入显著的T细胞表位。在CP09C02的重链中存在的CDR1突变(G26E，根据IMGT的CDR定义)与亲本序列中未观察到混杂高表位的引入相关(参见表21)。

前导抗体的选择性分析

对几种前导抗体的初始选择性分析表明，与在CDR3H位置104具有天冬氨酸(D)的抗体相比，在CDR3H位置104具有苯丙氨酸(F)的抗体平均表现出对CEACAM1的选择性增加(图11)。

多循环动力学分析

使用运行Biacore T200评价软件V3.0.1的Biacore T200仪器，使用多循环动力学分析进一步分析变体CP08H03/Vк8S29A和CP08H03/CP08F05。将纯化的抗体在HBS-P+中稀释至1μg/ml的浓度。在每个循环开始时，在蛋白质A表面上捕获每种抗体，以得到约100RU的RL。捕获后，使表面稳定。使用80μl/分钟的流速获得动力学数据以使任何潜在的传质效应最小化。将空白(无CEACAM1)的多次重复和单一浓度的分析物的重复编程到动力学运行中，以便在动力学循环中检查表面和分析物的稳定性。对于动力学分析，选择从100至1.56nMCEACAM1的两倍稀释范围。监测CEACAM1的缔合相150秒，并且测量解离相150秒。在每个循环结束时，使用两次注射10mM甘氨酸-HCL pH 1.5进行蛋白质A表面的再生。

从Fc2、Fc3和Fc4的信号中减去来自参考信道Fc1的信号以校正与参考表面的非特异性结合的差异，并在1对1结合模型中使用全局Rmax参数。通过将亲和力成熟的复合人抗体变体的K_D除以同一芯片上的亲本的K_D来计算与亲本(V_H1/Vκ8S29A)相比的相对K_D。针对CEACAM1与亲和力成熟的CEACAM1抗体变体CP08H03/Vк8S29A和CP08H03/CP08F05的相互作用测量的动力学参数示于表23中。与V_H1/Vκ8S29A亲本相比，两种亲和力成熟的CEACAM1抗体变体表现出>四倍的亲和力改善。

表23使用Biacore T200测定的抗体V_H1/Vκ8S29A(亲本)、嵌合抗体(VH0/VK0)和两种亲和力成熟的前导序列与CEACAM1结合的多循环动力学数据。通过将亲和力成熟的变体的K_D除以在同一芯片上测定的亲本的K_D来计算与亲本(V_H1/Vκ8S29A)相比的相对K_D。所有可变轻链在CDR1L中含有S29A突变(Kabat编号方案，对应于可变轻链的一级氨基酸序列中的S28A突变)。

实施例2：CEACAM1抗体的选择性

为了进一步评估CEACAM1抗体V_H0/Vκ0、CP08H03/Vк8S29A、CP08H03/CP08F05CEACAM1相对于其他蛋白质的结合选择性，使用如上所述进行的单循环动力学分析比较对CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5和CEACAM6的结合亲和力。使用280nM至70nM的CEACAM浓度进行单循环动力学。将抗体以下列浓度(考虑到不同的分析物MW)加载到芯片上：CEACAM1为100RU，CEACAM3为375RU，CEACAM5为71.4RU，并且CEACAM6为150RU。对于CEACAM3、CEACAM5和CEACAM6，没有观察到三种CEACAM1抗体CP08H03/Vк8S29A、CP08H03/CP08F05和V_H0/Vκ0的显著结合(参见图12A)。

这些结果与通过用ELISA测量抗体特异性获得的数据一致。对于ELISA实验，用0.5或1.0μg/ml的CEACAM1涂覆96孔板。用2％BSA/Dulbecco PBS封闭非特异性结合。在2％BSA/PBS中制备CP08H03/Vκ8S29A、CP08H03/CP08F05或V_H0/Vк0的1:3稀释系列(50μg/mL起始浓度)。将100μL样品加入到预涂覆的平板中并在RT下孵育1小时。使用抗人Igκ链-过氧化物酶二抗(AP502P)检测CEACAM抗体。将平板用TMB显影并用3M HCl终止。通过减去背景分析结果。基本上没有观察到三种CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A、CP08H03/CP08F05和V_H0/Vκ0与CEACAM3、CEACAM5或CEACAM6的结合(参见图12B和12C)。

尽管不同CEACAM的N结构域具有高度同源性，但可以观察到这种高度选择性：CEACAM1和CEACAM3的N结构域为88％相同，CEACAM1和CEACAM5的N结构域为89％相同，并且CEACAM1和CEACAM6的N结构域为90％相同，如使用Clustal2.1产生的同一性百分比矩阵所示(参见图13)。

实施例3：CEACAM1抗体的表位分析

为了确定CEACAM1上的哪些残基参与与本发明考虑的某些CEACAM1抗体的结合，将单点突变引入FLAG标记的CEACAM1中。将每个FLAG标记的CEACAM1突变体转染到293T细胞中。转染后48小时，对CEACAM1蛋白进行蛋白质印迹。将CEACAM1抗体VH0/VK0(嵌合抗体)、VH1/VK8、VH2/VK4、VH3/VK1和VH4/VK1用作检测抗体。CEACAM1残基Y34、V39、G41、N42、R43、Q44、G47和Q89(它们是CEACAM1 GFCC面的一部分)的突变导致CEACAM1与CEACAM1抗体的结合降低，表明这些CEACAM1残基可能参与结合(参见图14)。

实施例4：CEACAM抗体和CEACAM1的晶体结构

为了更精确地描绘CEACAM1和CP08H03/VK8 S29A之间的结合界面，测定了与CP08H03/VK8 S29A Fab片段复合的人CEACAM1的晶体结构。

由用表达无标记形式的CEACAM1的基于pET21D的质粒转化的大肠杆菌表达CEACAM1。蛋白质在含精氨酸的缓冲液中重折叠，并纯化。通过抗体消化制备Fab片段，浓缩至约18mg/ml后，使用固定化木瓜蛋白酶树脂，然后通过蛋白质A亲和和凝胶过滤色谱法纯化。在结晶筛选之前将纯化的CEACAM1和Fab以1:1的摩尔比混合。确定CEACAM1:Fab复合物的初始结晶命中，并随后进行优化。在室温下在含有18-20％PEG 6000、50mM磷酸二氢钾、20mM Tris pH 7.0和1％β-辛基葡萄糖苷的条件下生长衍射质量晶体。洗涤的晶体的SDS-PAGE分析和银染用于证实复合物的结晶。在阿尔贡国家实验室的先进光子源(AdvancedPhoton Source of Argonne National Laboratory)从光束线NE-CAT 24-ID-E收集许多晶体的X射线数据。合并来自两个非孪晶同晶晶体的最佳数据以产生的高度冗余数据集，用于结构确定和精制。通过分子替换解析复合物的结构，并精制至最终R和R_自由值分别为24.9％和32.8％。

CEACAM1:CP08H03/Vκ8S29A Fab复合物的结构确定为分辨率。CP08H03/Vκ8S29A Fab以1:1化学计量比结合CEACAM1(参见图15)。图16中CEACAM1的分子表面表示示出了CEACAM1上Fab片段的表位的部分。Fab分子与CEACAM1之间的主要和次要相互作用列于表24和表25中。

表24.CEACAM1 CP08H03/Vκ8S29A Fab之间的主要相互作用#残基编号基于Kabat编号方案。*残基编号基于重可变链的一级氨基酸序列。

表25.CEACAM1 CP08H03/Vκ8S29A Fab之间的次要相互作用#残基编号基于Kabat编号方案。*残基编号基于重可变链的一级氨基酸序列。

参考CEACAM1二聚体的现有结构(图17)，显然Fab与参与自缔合的CEACAM1的界面结合。据推测，这种竞争性相互作用导致溶液中二聚体的解离。靶向CEACAM1的残基包括在CEACAM1:CEACAM1二聚体界面处形成YQQN口袋的四个残基(Y34、Q44、Q89、N97)。值得注意的是，结合抗体的CEACAM1上的几个残基也被预测参与与TIM-3的结合，包括CEACAM1残基Y34、G41、N42、Q44、Q89、S93、D94、V96和/或N97(Huang等人,Nature.2015Jan 15；517(7534):386-90)。

在Fab轻链中，CDR1，CDR2和CDR3中的残基(图18)主要与CEACAM1中的主要β折叠的β链之间的两个环中的残基相互作用，并且还与所述折叠中的β链的残基相互作用。在Fab重链中，CDR2和CDR3的残基主要与分布在中心β折叠的四个不同β链上的残基相互作用。

相互作用的表面具有0.5的形状互补性，并且复合物形成埋没1607A1的总溶剂可及表面。在抗原与Fab重链CDR1之间没有观察到相互作用。

人CEACAM家族成员的比对表明CEACAM3、5、6、7和8都在位置49含有缬氨酸残基，而人CEACAM1在此位置含有丙氨酸。此外，人CEACAM5在位置89含有组氨酸。hCEACAM-1中这些残基的多态性包括Ala49Val(rs8110904)和Gln89His(rs8111468)。为了进一步检查CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A的选择性性质，如上所述表达并纯化人CEACAM1 A49V/Q89H突变体。注意到，存在人CEACAM1的天然人等位基因变体，其将Q89转化为H89，如Huang等人,Nature.2015Jan 15；517(7534):386-90所述。测定CEACAM1A49V/Q89H突变体的结构至分辨率并与CEACAM1野生型CP08H03/Vκ8S29A Fab复合物比较。如上所述，CP08H03/Vκ8S29A的CDR3H残基F104与野生型CEACAM1中的残基F29接触(参见图19，左图)。注意到，一个CEACAM1单体的F29在CEACAM1:CEACAM1同源二聚体界面处结合第二单体的F29。CP08H03/Vκ8S29A的CDR3H残基F104的结合阻断F29-F29相互作用。CEACAM1残基A49位于F104/F29相互作用位点附近。由于与人CEACAM1中的丙氨酸相比，非CEACAM1家族成员中缬氨酸的疏水性增加，因此人CEACAM1残基A49突变为缬氨酸导致疏水性CEACAM1残基F29移动更靠近CEACAM1 V49残基。在人CEACAM5(PDB编码2QSQ)和人CEACAM3(PDB编码6AW1)晶体结构中也观察到F29的这种旋转异构位移，并预测其与CDR3H残基F104发生冲突(参见图19，右图)。这通过CEACAM1 F29环显示的取向变化来说明所述环移动更靠近先前被CDR3H残基F104占据的空间(参见图19，右图)。这些数据表明，由A49V突变引起的这种空间位阻干扰CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A与在位置49处含有缬氨酸的其他CEACAM1家族成员的结合，并且因此对抗体选择性的其主要作用。据预测，F29环的这种旋转异构位移也会影响CDR2H残基Y57与F29之间的相互作用。此外，CEACAM1 Ala49Val多态性(rs8110904)与由班氏吴策线虫(侵入淋巴系统的丝虫)引起的淋巴水肿有关(Debrah L,B.等人Hum Genomics.2017Nov 9；11(1):26)。疾病的发展与Ala49Val多态性有关，所述多态性标志着丙氨酸49残基被发现参与与CP08H03/Vκ8S29A抗体的结合。因此，预期CP08H03/Vκ8S29A也可干扰班氏吴策线虫和表型蠕虫与淋巴管相互作用的其他相关病原体或癌症过程，诸如肿瘤侵袭。

实施例5：CEACAM1抗体阻断CEACAM1:CEACAM1相互作用

测试了CEACAM1抗体阻断CEACAM1同源二聚化的能力。一式三份进行CEACAM1-CEACAM1竞争ELISA研究以测定CP08H03/Vκ8S29A抗体(浓度范围0-1000nM)抑制人CEACAM1IgV结构域无标记蛋白(1pg/ml)和人CEACAM1-GST蛋白(37.5pg/ml)结合的能力。此外，IgG4抗体用作对照(0-1000nM)。使用来自Abcam(1:2000)的山羊多克隆抗GST-HSP抗体，并通过加入TMB溶液(Life technologies)进行测定。在酶标仪上在450nm处读取OD值。在Graphpad中绘制数据并确定最佳拟合IC-50值。

CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A示出阻断CEACAM1:CEACAM1同嗜性相互作用(参见图20A)。

实施例6：CEACAM1抗体阻断CEACAM1：TIM-3相互作用

检测CEACAM1抗体降低CEACAM1与TIM-3结合的能力。一式三份进行CEACAM1/TIM-3竞争ELISA研究以测定CP08H03/Vκ8S29A抗体(浓度范围0-300nM)抑制人TIM-3IgV结构域无标记蛋白(3pg/ml)和人CEACAM1-GST蛋白(37.5pg/ml)结合的能力。此外，人IgG4抗体用作对照(0-1000nM)。使用来自Abcam(1:2000)的山羊多克隆抗GST-HSP抗体，并通过加入TMB溶液(Life technologies)进行测定。在酶标仪上在450nm处读取OD值。在Graphpad中绘制数据并确定最佳拟合IC-50值。如图20B所示，CEACAM抗体CP08H03/Vκ8S29A阻断CEACAM1:TIM-3异嗜性相互作用。

实施例7：CEACAM1抗体诱导T细胞增殖

在人源化NOD scidγ小鼠(NSG小鼠)中研究CEACAM抗体CP08H03/Vκ8S29A和CP08H03/CP08F05诱导T细胞增殖的能力。实验设置参见图21。通过腹膜内(i.p.)注射将新鲜分离的人PBMC(5x10^6)转移到NOD.Cg-PrMc^scld I/2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中。PBMC注射后21天，通过尾部出血检查NSG动物的人免疫细胞植入。PBMC注射后24和31天，通过腹膜内注射向人源化NSG小鼠施用第一剂和第二剂的指定浓度的CEACAM1抗体或同种型对照抗体。在研究终止后(PBMC注射后34天)，处死小鼠并手术解剖脾用于进一步分析。来自移植小鼠的单细胞悬浮液用细胞增殖染料染色，并在可溶形式的抗人CD3刺激(2μg/ml，OKT3克隆)和rIL-2(40U/ml)存在下在完全RPMI培养基中体外再培养2天。将细胞维持在10^7个细胞/ml的浓度。体外刺激后，细胞用针对人CD45泛白细胞标记物的抗体染色并通过流式细胞术进行评估。

在任一测试组中均没有观察到抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(参见图22)。分别施用CEACAM抗体CP08H03/VK8 S29A或CP08H03/CP08F05导致体内抗体诱导的T细胞扩增的增加(参见图23)。

实施例8：CEACAM1抗体减少黑素瘤模型中的肿瘤生长

为了评估CEACAM1抗体减少肿瘤生长的能力，将1x 10⁶个MALME-3M(人黑素瘤)与5x10⁶个人PBMC一起皮下注射到7-8周龄雄性NSG(NOD.Cg-PrMc^scld I/2rg^tm1Wjl/SzJ)小鼠中。MALME-3M(BRAFV^600E)细胞系是在1975年从患有转移性黑素瘤的43岁白人男性的转移部位(肺)建立。在第7-9天，证实所有小鼠都表现出重构的T细胞群体(实验设置参见图24A)。在第10、13、17、20和24天用CEACAM抗体CP08H03/VK8 S29A或hIgG4对照抗体腹膜内治疗动物。

人黑素瘤细胞系MALME-3M由Nicole Beauchemin博士(McGill University,Montreal,Canada)惠赠。MALME-3M在1975年从患有具有BRAFV600E的转移性黑素瘤的43岁白人男性的转移部位(肺)建立。将2x10^7个MALME-3M皮下(s.c.)注射到NOD.Cg-PrMc^scldI/2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠中。在30分钟的适应期后，然后通过腹膜内(i.p.)注射将新鲜分离的人PBMC(1x10^8个)转移到携带肿瘤的NSG小鼠中。PBMC注射后7至9天，通过尾部出血检查NSG动物的人免疫细胞植入。在人细胞注射后10、13、17、20和24天，携带肿瘤的人源化NSG小鼠通过腹膜内注射接受总共五剂指定浓度的CEACAM1抗体或同种型对照抗体。研究终止后(人细胞注射后34天)，处死小鼠并进行手术解剖。

CEACAM1抗体CP08H03/VK8 S29A在各种浓度下有效减少肿瘤生长和增殖(参见图24B、24C和25)，同时不耗竭T细胞群体(参见图22)。此外，通过施用CEACAM1抗体恢复了人CD4⁺和CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞的增殖能力，参见图25。还观察到在体内用CP08H03/Vκ8S29A治疗时CD8 T记忆细胞主要向中枢记忆T细胞的偏向(图26)。注意到，相对于在对照治疗的动物中观察到的，CEACAM1抗体CP08H03/VK8 S29A增加T_cm与T_em的相对比例，与抗癌应答的增强一致。

实施例9：CEACAM1抗体可用于治疗对检查点抑制剂有抗性的癌症

CEACAM1在来源于原初黑素瘤患者或抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法抗性黑素瘤患者的大部分TIL上表达；且CEACAM1表达水平大于PD-1或TIM-3的表达水平(参见图27)。约80％的样品在大于20％的分离自TIL的CD4⁺ T细胞群体上表现出CEACAM1表达。为了比较对抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法具有获得性抗性的患者与先前未暴露于抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法的患者的CEACAM1表达，肿瘤相关细胞(TAC)获自原初黑素瘤患者(先前未暴露于抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法)或对抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法具有获得性抗性的那些患者(获得性抗性)。通过在DMEM培养基中培养肿瘤组织并从上清液中除去漂浮的细胞来获得TAC。对细胞进行CD3、CD4和CD8染色，评估CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺上的CEACAM1表达。这些研究显示，相对于在原初患者中观察到的，在获得性抗性中被剥夺肿瘤微环境的肿瘤相关细胞上调CEACAM1表达(参见图28)，表明对抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法具有抗性的患者可能受益于抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段，诸如本公开中所考虑的那些。

如所预期的，与先前未暴露于抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法的患者相比，在对抗PD-1和/或抗CTLA-4疗法有抗性的患者中，CD8⁺ T细胞中的中枢记忆(T_cm)细胞相对于效应记忆(T_em)存在相对降低，这与抗性患者中抗癌应答的降低一致(参见图29)。将来自原初黑素瘤患者(未治疗患者)或对免疫检查点抑制剂具有抗性的黑素瘤患者(治疗失败患者)的肿瘤相关细胞进行CD44、CCR7和CD62L染色，并且将中枢记忆T_cm(CD44^高、CD62L^高、CCR7^高)和效应记忆T_em(CD44^高、CD62L^低、CCR7^低)的相对量表示为存在于大块肿瘤中的总CD8 T细胞的百分比。

为了评估CEACAM1抗体逆转对用检查点抑制剂(诸如PD-1/PD-L1和CTLA-4抑制剂)治疗有抗性的患者中的T细胞耗竭的能力，从患有对派姆单抗(PD-1抑制剂)、伊匹单抗(CTLA-4抑制剂)+纳武单抗(PD-1抑制剂)和达拉非尼(B-Raf抑制剂)+曲美替尼(MEK抑制剂)的继发性抗性和IV期疾病的黑素瘤患者中分离PBMC和肿瘤相关细胞。对肿瘤相关细胞和PBMC进行CEACAM1、PD1或TIM-3染色，并且示出CD8⁺和CD4⁺ T细胞的比例(参见图30，左图)。对肿瘤活检经受酶消化或商业机械/酶解离系统(GentleMACS解离器，MiltenyiBiotec)。酶消化基于先前建立的用于产生黑素瘤TIL的方法(Dudley等人，2003，2008)。简言之，将肿瘤活检切成约2-3mm长的小片段，并放入由100U ml^-1DNA酶、10mg ml^-1胶原酶VIII(Sigma-Aldrich)组成的酶消化混合物中，并在37℃下连续旋转孵育45分钟。根据制造商的方案进行GentleMACS解离。简言之，将肿瘤切成长度约2-3mm的小片段，并根据制造商的建议置于具有RPMI1640(Lonza,Slough,UK)和溶液1、2和3(均来自Miltenyi Biotec)的C管(Miltenyi Biotech)中；然后将含有肿瘤的消化混合物在GentleMACS解离器中进行三个36秒的机械解聚步骤(程序h_tumor_01.01、02.01和03.01)，分别在第一和第二解聚步骤后穿插进行两次30分钟的37℃孵育。解聚后，将来自酶消化和GentleMACS解离的TIL通过100μm过滤器用于进一步分析。解离的肿瘤细胞和自体PBMC根据标准程序用以下抗体染色：对人CD3、CD4、CD8、TIM-3、PD1、CEACAM1、CD45和活性染料具有特异性的荧光染料缀合的单克隆抗体。用Cytoflex流式细胞仪(Invitrogen)获得数据并用FlowJo软件(TreeStar，Windows的V7.6.5)分析。在96孔板中，在CP08H03/VK8 S29A或hIgG4对照存在下，将PBMC或肿瘤相关细胞与可溶性抗CD3(2pg/ml)和rIL-2(40单位/ml)一起在补充有10％胎牛血清(FCS)、1％谷氨酰胺、100IU ml^-1青霉素、100μg ml^-1链霉素(Life Technologies)、25mM HEPES(Sigma-Aldrich)的完全培养基(RPMI 1640(Lonza))中培养。96小时后，按照制造商的方法收集细胞培养上清液用于进一步的TNF-和IFN-ELISA(BD)分析。CP08H03/VK8 S29A逆转PD-1/CTLA-4抗性肿瘤中的T细胞耗竭，如通过肿瘤相关细胞和PBMC二者中TNF-α和IFN-γ产生的增加所证明的(参见图30，右图)。

实施例10：与先前已知的CEACAM1抗体相比，本发明考虑的CEACAM1抗体表现出改善的功效

将抗体CP08H03/VK8 S29A的特性与抗CEACAM1抗体CM-24(WO2015/166484)进行比较。与本文公开的CEACAM1抗体CP08H03/VK8 S29A不同，CM-24(i)基于建模远离二聚体界面结合CEACAM1，(ii)表现出与CEACAM3和CEACAM5的交叉反应性，(iii)在TIL中显示出有限的逆转T细胞耐受性的能力，和(iv)在转移性黑素瘤的小鼠模型中作为激动性抗体而不是拮抗性抗体起作用。

CP08H03/Vκ8S29A对CEACAM1具有选择性并且不显示与CE ACAM3、CEACAM5、CEACAM6或CEACAM8的显著结合。另一方面，CM-24在较高抗体浓度下显示出与CEACAM3和CEACAM5的显著交叉反应性(图31A和31B)。用于流式细胞术实验的宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC No CCL-2)以及转染细胞系HeLaCEACAM1、HeLaCEACAM3、HeLaCEACAM5、HeLaCEACAM6和HeLaCEAC AM8在37℃、5.0％CO2下在补充有10％胎牛血清青霉素(100U/ml)和双氢链霉素(100pg/ml)的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。将细胞系用所示抗体染色，然后用对所示抗体同种型具有特异性的荧光染料缀合的单克隆抗体(诸如人IgG4或小鼠IgG1)以及活染料(DAPI)染色。用Cytoflex流式细胞仪(Invitrogen)获得数据并用FlowJo软件(TreeStar，Windows的V7.6.5)分析。

此外，CM-24在肿瘤相关细胞中表现出有限的逆转T细胞耐受性的能力。与原初默克尔细胞癌肿瘤细胞中的CM-24相比，肿瘤相关细胞与抗体CP08H03/Vκ8S29A的孵育在一定抗体浓度范围内导致更广泛的T细胞耐受性逆转(图32A、32B和32C)。根据制造商的方案，使默克尔细胞癌活检经受商业机械/酶解离系统(GentleMACS解离器，Miltenyi Biotec)。简言之，将肿瘤切成长度约2-3mm的小片段，并根据制造商的建议置于具有RPMI 1640(Lonza,Slough,UK)和溶液1、2和3(均来自Miltenyi Biotec)的C管(Miltenyi Biotech)中；然后将含有肿瘤的消化混合物在GentleMACS解离器中进行三个36秒的机械解聚步骤(程序h_tumor_01.01、02.01和03.01)，分别在第一和第二解聚步骤后穿插进行两次30分钟的37℃孵育。解聚后，将来自酶消化和GentleMACS解离的TIL通过100pm过滤器用于进一步分析。肿瘤环境中T细胞功能的体外测定：在各种浓度的抗体或相关同种型对照存在下，将解离的肿瘤细胞和自体PBMC在96孔板中在补充有10％胎牛血清(FCS)、1％谷氨酰胺、100IU ml^-1青霉素、100μg ml^-1链霉素(Life Technologies)、25mM HEPES(Sigma-Aldrich)的完全培养基(RPMI 1640(Lonza))中与40IU ml^-1重组IL-2(NIH)和可溶性CD3(2g/ml)一起培养。96小时后，收集细胞培养上清液，按照制造程序用于进一步的TNF-和IFN-ELISA(BD)分析。

在转移性黑素瘤模型中(实验设置参见图33A)，与用人IgG4(hIgG4)体内治疗的对照小鼠相比，用CP08H03/Vκ8S29A体内治疗的小鼠显示肿瘤细胞显著减少，并且TIL CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞显著增加(图33B、34A、34B和34C)。另一方面，与用hIgG4对照治疗的对照小鼠相比，用CM-24体内治疗的小鼠表现出肿瘤细胞的大量增加，并且几乎完全不存在TIL CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞(图33B、34A、34B和34C)。此外，相对于hIgG4对照或CM24治疗的动物，肿瘤细胞在CP08H03/Vκ8S29A治疗的动物中表现出降低的增殖(图33C)。此外，相对于hIgG4治疗的动物或CM24治疗的小鼠，CP08H03/Vκ8S29A治疗的动物的脾脏中的CD4⁺ T细胞表现出增加的增殖(图33D)。与CP08H03/Vκ8S29A治疗的动物相反，CM24治疗的动物表现出降低的脾CD4⁺ T细胞的增殖(图33D)。人黑素瘤细胞系MALME-3M由Nicole Beauchemin博士(McGillUniversity)提供。MALME-3M在1975年从患有具有BRAF^V600E的转移性黑素瘤的43岁白人男性的转移部位(肺)建立。将2x10^7个MALME-3M皮下(s.c.)注射到NSG小鼠中。30分钟后使小鼠吸收肿瘤细胞，然后通过腹膜内(i.p.)注射将新鲜分离的人PBMC(1x10^8个)转移到携带肿瘤的NSG小鼠中。PBMC注射后7-9天，通过尾部出血检查NSG动物的人免疫细胞植入。在第14天，检测到可触及的肿瘤结节。从人细胞注射后第17天开始，携带肿瘤的人源化NSG小鼠通过腹膜内注射每周两次接受总共四剂的CP08H03/Vκ8S29A抗体(2mg/kg)、CM-24(2mg/kg)或同种型对照抗体(2mg/kg)。研究终止后(人细胞注射后30天)，处死小鼠并手术解剖。转移性肿瘤与脾和肺和肝一起保存用于进一步分析。CD4、CD8和肿瘤细胞的总细胞计数和增殖以及频率的特征在于FSC和SSC高，并且人泛白细胞标记物CD45表达呈阴性。

图34A、34B和34C通过图33A所示的方案提供了图33B所示结果的统计比较。用CM-24治疗的动物显示较大的肿瘤，且没有肿瘤相关T细胞的证据。另一方面，在用CP08H03/Vκ8S29A治疗的小鼠中观察到浸润性T细胞的量增加并且肿瘤细胞减少(图33B)。如所示，肿瘤细胞增殖的评估显示CP08H03/Vκ8S29A抑制肿瘤增殖，但CM-24不抑制肿瘤增殖(图33C)。此外，在CP08H03/Vκ8S29A治疗的小鼠中观察到脾CD4⁺ T细胞的增殖增加，而在CM-24治疗的小鼠中观察到脾CD4⁺ T细胞的增殖减少(图33D)。

实施例11：CEACAM1抗体阻断CEACAM1与HopQ之间的相互作用。

HopQ在幽门螺杆菌的表面表达，幽门螺杆菌是一种特异性定殖于人胃上皮的细菌，并且是溃疡病和胃癌发展的主要致病物。已表明HopQ-CEACAM1相互作用例如通过使细菌毒力因子能够易位到宿主细胞中并增强促炎介质的释放促进胃定殖和Hp诱导的病理。

已发表的晶体结构数据(PDB ID 6AW2、6GBH、6GBG，参见Bonsor,D,等人EMBOJ.2018Jul 2；37(13)和Moonens K等人EMBO J.2018Jul 2；37(13))表明CEACAM1的GFCC环参与与HopQ的结合，并且CEACAM1残基F29、Y34、N42、Q89和N97与HopQ残基进行各种氢键结合和疏水相互作用(参见图35A)。基于CECAM1:HopQ共晶和CEACAM1:CP08H03/Vκ8S29A Fab共晶的建模表明CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A覆盖HopQ的CEACAM1结合位点(参见图35B)并且因此能够破坏CEACAM1:HopQ相互作用。

实施例12：CEACAM1抗体促进长期存活

使用小鼠黑素瘤模型研究CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A促进携带肿瘤的哺乳动物长期存活的能力。

将10⁶个MALME-3M(人黑素瘤)细胞以及5x 10⁶个人PBMC(来自HLA-A2匹配的供体)皮下注射到NSG小鼠中。在第10天，肿瘤达到2-2.5mm³，并将小鼠随机分组(n＝4/组)。在第10、13、17、20和24天分别腹膜内施用抗CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A或对照人IgG4抗体。监测存活104天，此时处死表现出强烈临床活动的存活动物(箭头)。

如图36所示，用抗CEACAM1抗体治疗显著提高了携带肿瘤的小鼠的存活率。此外，在尸检时，抗体治疗的动物表现出没有可见转移的局部肿瘤，这与疾病的控制一致。此数据表明本文公开的抗CEACAM1抗体及其片段可用于治疗癌症和增加存活。

实施例13：CP08H03/Vκ8S29A增加原初患者或对免疫疗法具有继发性抗性的患者的肿瘤细胞中的免疫应答

使用分离的肿瘤样本检查CEACAM1抗体CP08H03/Vκ8S29A增加来自原初黑素瘤患者或对免疫疗法表现出继发性抗性的黑素瘤患者的肿瘤中的免疫应答的能力。

在一个实例中，通过机械解离破坏来自具有继发性抗性的患者的分离的肿瘤样本，并且在2μg/ml抗CD3和40单位/ml重组IL-2的存在下，在培养基中用CP08H03/Vκ8S29A或hIgG4对照抗体(2μg/ml)处理解离的细胞4天。然后使用以下抗体通过质谱流式细胞术检查细胞以使用标准技术检测CD8⁺ T细胞中与对肿瘤的免疫应答相关的多种细胞内因子：IFNγ(克隆B27；168Er)、IL-17A(克隆N49-653；164Dy)、IL-17F(克隆SHLR17；166Er)；粒酶B(克隆GB11；171Yb)；穿孔素(克隆B-D48；175Lu)；MIP1β(克隆D21-1351；150Nd)；TNFα(克隆Mab11；152Sm)、CD3(克隆UCHT1；170Er)；CD8(克隆RPA78；146Nd)；嵌入剂(103Rh)。

如图37A和37B所示，与对照人IgG4抗体相比，用CP08H03/Vκ8S29A抗体治疗导致显著诱导CD8⁺ T细胞中细胞内指示的因子。这些结果直接表明CP08H03/Vκ8S29A抗体在CD8⁺ T细胞中诱导多种因子的产生，这些因子潜在地与生产性抗肿瘤免疫应答相关。

在另一个实例中，通过机械解离(Miltenyi)破坏与两名先前未接受治疗(受试者189)或对免疫疗法具有继发性抗性(受试者185)的黑素瘤患者相关的肿瘤样本。将8x10⁵个/ml解离的肿瘤细胞置于培养皿中。将新鲜分离的肿瘤解离细胞仅暴露于2μg/mlCP08H03/Vκ8S29A或人IgG4同种型对照抗体。96小时后，除去上清液，一式三份进行ELISA分析以检测干扰素-γ的存在。

如图38A和38B中所示，相对于用对照人IgG4抗体观察到的，用CP08H03/Vκ8S29A抗体治疗诱导显著水平的细胞因子干扰素-γ分泌到分离自患有对免疫疗法治疗具有继发性抗性的患者(图38A，受试者185)或未经免疫疗法治疗的患者(图38B，受试者189)的肿瘤解离细胞的上清液中。

总之，这些数据表明本文公开的抗CEACAM1抗体及其片段可用于治疗原初癌症患者和对免疫疗法具有继发性抗性的那些患者。

序列概述

虽然本发明的上述书面说明书使得本领域普通技术人员能够制造和使用目前认为是其最佳模式的那些，但是本领域普通技术人员将理解和领会本文具体实施方案、方法和实施例的变化、组合和等同物的存在。