一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药、其制备方法及其胶束制剂
阅读说明：本技术 一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药、其制备方法及其胶束制剂 (Propiconazole bond-based amphiphilic acid-sensitive docetaxel polymer prodrug, preparation method and micelle preparation thereof ) 是由 郭术涛 刘涛 邹会 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药及其制剂。本发明提供的前药分子可通过模块化反应制备,方法简便高效,具有通用性,可拓展性强。前药分子可以通过在水溶液中自组装的方式制备多西紫杉醇前药胶束制剂,所得到的前药胶束制剂具有制备简单、胶束稳定性好以及酸响应快速激活等特点,其在正常生理pH条件下较为稳定,而在酸性pH条件下缩丙酮键能够快速响应性断裂,从而实现多西紫杉醇的响应性无痕释放,在改善多西紫杉醇亲水性以及降低毒副作用的同时,提高抗肿瘤效果。(The invention provides an amphipathic acid-sensitive docetaxel polymer prodrug based on a ketal bond and a preparation thereof. The prodrug molecule provided by the invention can be prepared through modular reaction, and the method is simple, convenient and efficient, and has universality and strong expansibility. The prodrug molecules can be used for preparing a docetaxel prodrug micelle preparation in a self-assembly mode in an aqueous solution, the obtained prodrug micelle preparation has the characteristics of simplicity in preparation, good micelle stability, quick acid response activation and the like, is stable under the normal physiological pH condition, and can be quickly and responsively broken by a acetonide bond under the acidic pH condition, so that the responsive traceless release of docetaxel is realized, and the antitumor effect is improved while the hydrophilicity of docetaxel is improved and the toxic and side effects are reduced.)
技术领域
本发明涉及药物化学
技术领域
，尤其是涉及一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药、其制备方法及其胶束制剂。背景技术
癌症是人类面临的重大健康威胁，并呈现出患病人群年轻化、患病者逐年递增的趋势。癌症的治疗一直是科学研究的难题和重要方向，形式多样的治疗手段被开发利用，其中化疗手段是一种常规重要的癌症治疗方式，已有多种多样的化疗药物被发现和应用。紫杉烷类抗肿瘤药物，尤其是第二代紫杉烷类抗肿瘤药物多西紫杉醇具有良好的广谱抗肿瘤活性，已批准用于乳腺癌、晚期转移性非小细胞肺癌、晚期卵巢癌、鼻咽癌及晚期胃癌等癌症的治疗。然而，由于其具有毒性大，水溶性差，生物利用度低等特点，极大限制了其临床应用。
为了应对化疗药物临床应用难题，各种各样的前药技术被开发利用。前药技术是一种通过化学手段对药物进行改性的方式，将药物通过化学键与改性基团相连，可以对药物的亲疏水性等理化性质进行改进从而改善药物利用度，提高疗效。前药发挥作用面临的关键问题是如何在患病部位靶向富集和激活实现药物响应性激活释放从而在发挥抗肿瘤效果同时降低系统毒性。为了解决前药响应释放的难题，多种响应激活技术被开发利用。
缩丙酮键是一种酸敏感型化学键，近年来已报道用于前药构筑。基于缩丙酮键构建的前药已证实具有高度酸敏感性，能够在肿瘤等患病部位实现高效的药物富集而不损伤正常组织。聚合物前药可将药物通过连接键连接到聚合物上，通过体外自组装的形式可得到前药纳米制剂，在方便使用的同时，依靠EPR效应可实现肿瘤靶向富集。为了解决多西紫杉醇临床应用中面临的难题，多西紫杉醇前药，尤其是基于聚合物的酸响应性前药的开发受到越来越多的重视。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药、其制备方法及其胶束制剂，该多西紫杉醇聚合物前药可以通过在水溶液中自组装的方式制备多西紫杉醇前药胶束制剂，所得到的的前药胶束制剂具有良好的稳定性、敏感的酸响应性、高安全性和抗肿瘤活性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药，结构如式(Ⅰ)所示：
其中，n＝10-100，m＝20-60。
进一步，所述多西紫杉醇聚合物前药为两亲性双嵌段聚合物，以聚乙二醇为亲水端，分子量优选为1000-3000道尔顿；外消旋聚乳酸为疏水端，分子量优选为1000-5000道尔顿。
本发明还提供了一种如上述任一项所述的多西紫杉醇聚合物前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)多西紫杉醇与式(Ⅱ)在酸催化下，在隔绝空气条件下进行反应得到式(Ⅲ)所示缩丙酮键连接的含有功能化炔基的多西紫杉醇缩丙酮前药分子；
反应式如下：
2)式(Ⅳ)所示的双嵌段聚合物与叠氮己酸在缩合剂和有机碱催化剂的作用下进行酯化反应，得到式(Ⅴ)所示的含有叠氮基的双嵌段聚合物；
反应式如下：
其中，n＝10-100，m＝20-60；
3)式(Ⅴ)所示的含有叠氮基的双嵌段聚合物与式(Ⅲ)所示的含有功能化炔基的多西紫杉醇缩丙酮前药分子在铜催化剂和配体催化下，隔绝空气条件下发生点击反应，得到式(I)所示的基于缩丙酮键的多西紫杉醇聚合物前药；多西紫杉醇经缩丙酮修饰后，经过点击反应连接于外消旋聚乳酸疏水端；
反应式如下：
其中，n＝10-100，m＝20-60。
进一步，所述步骤1)具体步骤为：
在反应瓶中加入多西紫杉醇和(Ⅱ)所示分子和反应溶剂，在隔绝空气条件下，加入酸催化剂，发生酸催化下的多西紫杉醇与(Ⅱ)所示分子的亲核加成反应，反应结束后，用三乙胺终止反应，得到式(Ⅲ)所示的多西紫杉醇缩丙酮前药分子。
进一步，述反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯、苯或丙酮中的任一种；
所述酸催化剂为对甲苯磺酸、乙酸、1,2-二氯乙烷或三氟甲磺酸中的任一种；
所述步骤1)用三乙胺终止反应后还包括纯化步骤，具体方法为：反应结束后，用旋蒸减压除去溶剂，之后用硅胶柱层析分离手段对产物进行提纯，硅胶柱层析分离展开剂为石油醚或乙酸乙酯；之后经浓缩、干燥之后即可得到式(III)所示多西紫杉醇缩丙酮前药分子。
进一步，所述步骤2)中，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基碳二亚胺；
有机碱催化剂为4-二甲氨基吡啶或三乙胺中的任一种；
溶剂选择四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺；
所述步骤2)反应结束后，还包括纯化步骤，具体方法为：向其中加入去离子水终止反应，之后用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩之后用乙醚沉淀纯化，沉淀物经真空干燥之后得到式(V)所示的含有叠氮基的双嵌段聚合物。
进一步，所述步骤3)中，铜催化剂为硫酸铜、碘化亚铜或溴化亚铜中的任一种；
配体为五甲基二乙烯三胺或三乙胺；
反应溶剂选择N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃；
所述步骤3)反应结束后，还包括纯化步骤，具体方法为：向其中加入水终止反应，之后用二氯甲烷萃取，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤浓缩之后用乙醚沉淀纯化，所得沉淀物经真空除水之后即可得到式(I)所示的多西紫杉醇聚合物前药。
进一步，所述步骤2)和步骤3)中优选n＝20-60，m＝30-50。
本发明还提供了一种多西紫杉醇聚合物前药的胶束制剂，该胶束由上述所述的基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药在水溶液中通过纳米沉淀法制备得到，具体方法如下：
1)将所述多西紫杉醇聚合物前药溶解于水溶性有机溶剂中；
2)搅拌下，将步骤1)得到的有机溶液缓慢滴加到水溶液中，室温下敞口继续搅拌，待有机溶剂挥发干净之后经过无菌滤膜除菌即可得到前药的胶束制剂。
进一步，所述有机溶剂为丙酮、四氢呋喃、甲醇或乙醇中的任一种；
所述水溶液为PBS或超纯水；
所述有机溶剂挥发时间为1-24h；
所述前药：有机溶剂：水溶液比例为10-100mg：1-10mL：10-100mL；
所述胶束制剂粒径为5-40nm。
其中，胶束外侧为由聚乙二醇单甲醚组成的亲水外壳，内侧为聚乳酸通过缩丙酮键连接的多西紫杉醇疏水内核。
相对于现有技术，本发明所述的基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药具有以下优势：
(1)本发明所述的多西紫杉醇聚合物前药制备方法成熟且高效，通过模块化反应构筑了多西紫杉醇缩丙酮聚合物前药。具体来说，通过高效的缩丙酮键构筑方法，制备了具有反应性炔基的多烯紫杉醇前药分子；通过简单的酯化反应，对聚合物进行叠氮基修饰，最后通过点击反应将前药模块和聚合物模块相连接即可制备多西紫杉醇缩丙酮聚合物前药。本发明的设计合理巧妙，创新性和实用性强，可以通过本方法衍生制备多种多样的基于缩丙酮键的多西紫杉醇聚合物前药。
(2)本发明所述的前药胶束制剂制备简单，前药分子通过纳米沉淀法即可得到前药胶束制剂。胶束外侧为聚乙二醇单甲醚组成的亲水壳层，聚乙二醇亲水层可以延长胶束制剂在体内的循环时间，利于胶束制剂通过EPR效应向肿瘤靶向富集。前药胶束内侧为通过缩丙酮键连接的多西紫杉醇。缩丙酮键在正常生理pH条件下较为稳定，而在肿瘤酸性环境下可响应性断裂，实现多西紫杉醇的靶向无痕释放，从而达到在改善多西紫杉醇亲水性、降低毒副作用的同时，提高抗肿瘤效果。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1制备的多西紫杉醇聚合物前药(I)的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例2制备的多西紫杉醇聚合物前药(I)的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例3制备的多西紫杉醇聚合物前药(I)的核磁共振氢谱图；
图4为实施例4制备的前药胶束动态光散射测定的粒径分布图；
图5为实施例4制备的前药胶束体外稳定性考察图；
图6为多西紫杉醇前药胶束体外的pH响应释放性能测试图；
图7为多西紫杉醇前药胶束体外肿瘤细胞杀伤性能测试图；
图8为多西紫杉醇前药胶束体内抑瘤疗效图；
图9为多西紫杉醇前药胶束体内抑瘤安全性评价图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)前药式(Ⅲ)的制备：
氮气保护下，向15mL反应瓶中加入1.44g式(Ⅱ)所示化合物，0.82g多西紫杉醇，5mL超干DCM。搅拌下加入3mg 1,2-二氯乙酸催化剂，室温下反应。反应完成后向体系加入0.3mL三乙胺终止反应，浓缩，以PE(石油醚)/EA(乙酸乙酯)为洗脱液，经硅胶柱层析分离得到目标式(Ⅲ)所示前药分子。
2)含有叠氮基的双嵌段聚合物式(V)的制备：
氮气保护下，向250mL反应瓶中加入1g 6-叠氮己酸，6.3g mPEG2000-PDLLA1750，50mL超干N,N-二甲基甲酰胺，1.3g 4-二甲氨基吡啶，1.8g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下反应24h。反应完成后，向体系加入150mL去离子水终止反应，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相依次经水、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤脱溶后经乙醚沉淀，真空干燥之后得到式(V)所示化合物。
3)前药式(I)的制备：
氮气保护下，向100mL反应瓶加入900mg实施例1制备的式(III)所示化合物，2.3g实施例2制备的式(V)所示聚合物，30mL超干N,N-二甲基甲酰胺，68mg五甲基二乙烯三胺。冷冻-解冻法除溶剂中的氧气，重复三次，向体系加入86mg溴化亚铜作为催化剂，室温下反应过夜。反应完成后，向体系加入100mL去离子水淬灭反应，用二氯甲烷萃取水相，有机相经水、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，经乙醚沉淀后，沉淀物真空除水即可得到式(I)所示前药。
前药(I)结构采用核磁共振技术进行鉴定表征，其氢谱图如图1所示。
从图1核磁氢谱中，能够观测到多西紫杉醇分子中苯环特征峰(6.0-8.0ppm)以及聚合物特征峰(3.0-3.5ppm以及5.0-5.5ppm)，说明顺利得到了目标产物。
实施例2
一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)前药式(Ⅲ)的制备：
氮气保护下，向15mL反应瓶中加入1.44g式(Ⅱ)所示化合物，0.82g多西紫杉醇，5mL超干DCM。搅拌下加入3mg 1,2-二氯乙酸，室温下反应。反应完成后向体系加入0.3mL三乙胺终止反应，浓缩，以PE(石油醚)/EA(乙酸乙酯)为洗脱液，经硅胶柱层析分离得到目标式(Ⅲ)所示前药分子。
2)含有叠氮基的双嵌段聚合物式(V)的制备：
氮气保护下，向250mL反应瓶中加入1g 6-叠氮己酸，8.7g mPEG2000-PDLLA3000，50mL超干N,N-二甲基甲酰胺，1.3g 4-二甲氨基吡啶，2.8g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下反应24h。反应完成后，向体系加入150mL去离子水终止反应，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相依次经水、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤脱溶后经乙醚沉淀，真空干燥之后得到式(V)所示化合物。
3)前药式(I)的制备：
氮气保护下，向100mL反应瓶加入900mg实施例制备的式(III)所示化合物，2.9g实施例3制备的式(V)所示聚合物，30mL超干N,N-二甲基甲酰胺，68mg五甲基二乙烯三胺。冷冻-解冻法除溶剂中的氧气，重复三次，向体系加入86mg溴化亚铜作为催化剂，室温下反应过夜。反应完成后，向体系加入100mL去离子水淬灭反应，用二氯甲烷萃取水相，有机相经水、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，经乙醚沉淀后，沉淀物真空除水即可得到式(I)所示前药。
前药(I)结构采用核磁共振技术进行鉴定表征，谱图如图2所示。
从图2核磁氢谱中，能够观测到多烯紫杉醇分子中苯环特征峰(6.0-8.0ppm)以及聚合物特征峰(3.0-3.5ppm以及5.0-5.5ppm)，说明顺利得到了目标产物。
实施例3
一种基于缩丙酮键的两亲性酸敏感多西紫杉醇聚合物前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)前药式(Ⅲ)的制备：
氮气保护下，向15mL反应瓶中加入1.44g式(Ⅱ)所示化合物，0.82g多西紫杉醇，5mL超干DCM。搅拌下加入3mg 1,2-二氯乙酸，室温下反应。反应完成后向体系加入0.3mL三乙胺终止反应，浓缩，以PE(石油醚)/EA(乙酸乙酯)为洗脱液，经硅胶柱层析分离得到目标式(Ⅲ)所示前药分子。
2)含有叠氮基的双嵌段聚合物式(V)的制备：
氮气保护下，向250mL反应瓶中加入1g 6-叠氮己酸，10.1g mPEG2000-PDLLA4000，50mL超干N,N-二甲基甲酰胺，1.3g 4-二甲氨基吡啶，2.8g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下反应24h。反应完成后，向体系加入150mL去离子水终止反应，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相依次经水、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤脱溶后经乙醚沉淀，真空干燥之后得到式(V)所示化合物。
3)前药式(I)的制备：
氮气保护下，向100mL反应瓶加入900mg实施例1制备的式(III)所示化合物，3.6g实施例2制备的式(V)所示聚合物，30mL超干N,N-二甲基甲酰胺，68mg五甲基二乙烯三胺。冷冻-解冻法除溶剂中的氧气，重复三次，向体系加入86mg溴化亚铜作为催化剂，室温下反应过夜。反应完成后，向体系加入100mL去离子水淬灭反应，用二氯甲烷萃取水相，有机相经水、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩，经乙醚沉淀后，沉淀物真空除水即可得到式(I)所示前药。
前药(I)结构采用核磁共振技术进行鉴定表征，如图3所示。
从图3核磁氢谱中，能够观测到多烯紫杉醇分子中苯环特征峰(6.0-8.0ppm)以及聚合物特征峰(3.0-3.5ppm以及5.0-5.5ppm)，说明顺利得到了目标产物。
实施例4以实施例1为例进行多西紫杉醇前药胶束制剂的制备：
称取实施例1制备的多西紫杉醇前药20mg，溶于100μL丙酮，缓慢滴加至1mL浓度为10mM的PBS缓冲液中，滴加过程中持续敞口搅拌，转速为500rpm，以此转速在室温下持续搅拌2h，待丙酮完全挥干之后，将上述PBS溶液过0.22μm无菌水膜除菌，即可得到前药胶束制剂。
所得到的前药胶束粒径分布通过DLS动态光散射技术测定，其粒径分布如图4所示。
从图4中可以看出，制剂粒径在20nm左右，小粒径的纳米颗粒更利于肿瘤渗透发挥抗肿瘤效果。
同时，为了说明制剂体外稳定性，持续20天对制剂粒径进行追踪测定，结果如图5所示。
从图可以看出，20天内制剂粒径几乎没有变化，说明此制剂具有很好的体外稳定性，利于使用储存。
此外，所得胶束制剂除直接使用之外，还可通过冷冻干燥技术得到前药粉末，使用时可按照所需浓度复溶。
实验1酸敏感型多西紫杉醇前药胶束的酸响应释放性能测试：
将实施例4制备的多西紫杉醇前药制剂加入pH分别为5.0、7.4且浓度为30mM磷酸缓冲溶液中，最终多西紫杉醇浓度为40μM。将水解体系置于摇床中孵育(37℃,100rpm)。在预定的时间点取样200μL，向其中加入200μL pH 8.0的200mM磷酸缓冲溶液和400μL乙腈终止水解，涡旋后通过高效液相色谱法(HPLC)测定多西紫杉醇含量。
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18,4.6mm×100mm,2.7μm；流动相：乙腈：超纯水(55:45，V/V)；流速：1.0mL/min；紫外检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：20μL。
水解率计算公式如下：
水解率(％)＝样品管中多西紫杉醇的浓度/前药纳米胶束制剂完全酸解后的多西紫杉醇的浓度×100％。
多西紫杉醇胶束的酸响应性如图6所示。
从图中可以看出，在正常生理环境下(pH 7.4)，24h之内前药水解率低于8％，说明在正常生理环境条件下前药能够较长时间保持稳定，而在溶酶体环境下(pH 5.0)前药能够快速响应性水解，12h左右已有高于95％的前药水解。
实验2多西紫杉醇前药胶束制剂对肿瘤细胞的杀伤能力
小鼠乳腺癌4T1细胞培养条件：RPMI-1640培养基，10％FBS，1％P/S。收集4T1-luc细胞，将100μL 4T1-luc细胞悬液以3×103/孔的密度种于96孔板，置于培养箱孵育24h，以换液的方式加入多西紫杉醇和实施例4所制备的多西紫杉醇前药胶束制剂，浓度分别为1nM到1μM的培养基，孵育72h。以换液的方式将含CCK-8的100μL培养基加入孔板，孵育1.5h，测试450nm吸光度。计算存活细胞百分数，绘图计算IC50(半抑制浓度)。
多西紫杉醇和前药胶束制剂针对小鼠乳腺癌4T1细胞的细胞毒性结果如图7所示，经计算，多西紫杉醇和实施例4所制备的多烯紫杉醇前药胶束制剂对4T1细胞的IC50值分别为13.0nm和17.9nm。
从以上数据可以看出，前药制剂和多烯紫杉醇相比，具有相当的肿瘤细胞杀伤效率，说明此前药制剂具有很好的肿瘤细胞杀伤能力。
实验3多西紫杉醇前药胶束制剂体内疗效和安全性评价
从维通利华购入6周龄、15-17g雌性Balb/c小鼠，将4T1细胞以每鼠5×105个细胞种于小鼠右侧胸前皮下，建立皮下肿瘤模型。待肿瘤体积约50mm3时，小鼠随机分为3组(n＝8)，分别于第0、3、6天经尾静脉注射PBS、实施例4所制备的多西紫杉醇胶束制剂以及多西他赛注射液(市售多西紫杉醇剂型)，给药剂量为10mg/kg(多西紫杉醇等效剂量)。肿瘤体积计算公式：Vtumor＝(a×b2)/2。a为肿瘤最长处，b为肿瘤最宽处。
荷瘤小鼠抑瘤结果和小鼠生存率如图8所示。
从上图可以看出，在治疗后的第12天，市售对照药组肿瘤体积约为多西紫杉醇胶束组肿瘤体积的1.5倍。到第12天多西紫杉醇胶束组存活率为100％，而市售对照药组存活率为75％，PBS组为62.5％。通过以上实验可以说明本发明制备的多西紫杉醇前药胶束具有良好的安全性和抗肿瘤活性。
通过以上实施例可以说明，本发明制备的基于缩丙酮键的多西紫杉醇前药和其胶束制剂具有结构明确、制备方法和过程简单高效、优良的酸响应性以及高安全性和高抗肿瘤活性的特点，具有很高的创新性和应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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