一种地龙生物活性小肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种地龙生物活性小肽及其制备方法和应用 (Earthworm bioactive small peptide and preparation method and application thereof ) 是由 侯焘 李泊远 何慧 马雪琪 李凯凯 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种来源于地龙且具有抗氧化生物活性的小肽,所述小肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。申请人首先从中药地龙中提取分离生物活性肽,接着通过液质联用、质谱解析、序列比对、分子对接和活性验证等大量试验从中筛选出具有较强抗氧化活性的小肽。该小肽为首次从中药地龙中分离鉴定,为充分利用地龙药材提供了新途径,同时也为抗氧化剂的开发提供了新资源。(The invention discloses a small peptide which is derived from earthworm and has antioxidant bioactivity, and the amino acid sequence of the small peptide is shown as SEQ ID No.1 or SEQ ID No. 2. The applicant firstly extracts and separates biological active peptide from traditional Chinese medicine earthworm, and then screens out small peptide with stronger antioxidant activity from the biological active peptide through a large amount of tests such as liquid chromatography-mass spectrometry, sequence comparison, molecular docking, activity verification and the like. The small peptide is separated and identified from the traditional Chinese medicine earthworm for the first time, provides a new way for fully utilizing earthworm medicinal materials, and also provides a new resource for developing an antioxidant.)
技术领域
本发明涉及一种小肽，尤其是一种来源于地龙且具有抗氧化生物活性的小肽，本发明还涉及该小肽的制备方法和应用。
背景技术
人体细胞在代谢过程中会产生大量的活性氧(ROS)，机体的抗氧化防御系统可以有效地清除这些ROS，即正常情况下，ROS的产生和消除处于一种微妙的平衡状态。当ROS产生过量或机体抗氧化防御系统失效时，这种平衡就会被打破，机体将处于氧化应激状态。已有研究证实，氧化应激的损害可引发癌症、糖尿病、炎症、心血管疾病、哮喘以及阿尔茨海默病等多种慢性疾病。
抗氧化肽是近年来被广泛研究的一类生物活性肽，作为一种抗氧化剂，其结构相对简单、易吸收、稳定性好、低抗原，不仅具有较强的抗氧化活性，还具有降血压和抗癌等保健功效，在食品和医疗保健品领域越来越受到人们的关注。
地龙是我国名贵的中药材，已有研究表明地龙肽具有抗凝血、降血压、抗菌、抗炎、抗脑卒中、神经保护等多方面的药理作用。然而，尚未有地龙蛋白水解物小肽的抗氧化报导。因此，以地龙蛋白为原料开发抗氧化肽，可为深度利用地龙蛋白资源提供新途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种小肽及其制备方法和应用，该小肽来源于中药地龙，具有很好的抗氧化作用。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
申请人首先从中药地龙中提取分离生物活性肽，接着通过液质联用、质谱解析、序列比对、分子对接和活性验证等大量试验从中筛选出具有较强抗氧化活性的小肽，其氨基酸序列为PGAGAVY(SEQ ID No.1)或KDLY(SEQ ID No.2)。该小肽为首次从中药地龙中分离鉴定，为充分利用地龙药材提供了新途径，同时也为抗氧化剂的开发提供了新资源。
上述小肽具有分子量小，容易制备的优点，它既可以从中药地龙中提取分离，同时也能使用本领域所熟知的人工合成方法制备，由于分子量小，当使用合成方法制备时，还具有工艺简单、成本低廉等优点。
进一步地，本发明提供一种制备所述小肽的方法，该方法包括从中药地龙提取生物活性肽，然后从生物活性肽中分离目标肽段两个步骤，其中，所述生物活性肽的提取包括以下步骤：
(1)以中药地龙为原料，采用碱提酸沉法提取粗蛋白；
(2)向粗蛋白中加入蛋白酶进行酶解，膜分离后得到分子量小于5kDa的多肽。
所述目标肽段的分离可通过本领域所熟知的色谱法等，例如使用半制备或制备液相色谱进行分离，在已明确目标肽段分子结构的基础上，本领域技术人员在使用这些方法时无需克服技术障碍。
优选地，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
优选地，所述酶解的方法是将粗蛋白用水溶解成浓度为1-10％的溶液，然后按粗蛋白重量的1-5％向溶液中加入蛋白酶，在pH为7.5-10、温度为40-60℃条件下酶解1-5小时，加热灭活后离心，取上清液。
优选地，所述酶解的方法是将粗蛋白用水溶解成浓度为3-4％的溶液，然后按粗蛋白重量的2-3％向溶液中加入蛋白酶，在pH为8-9、温度为50-55℃条件下酶解2-3小时，加热灭活后离心，取上清液。
优选地，所述碱提酸沉法是将中药地龙磨粉后加入pH为8-11的氢氧化钠溶液，在50-70℃条件下浸提1-5h，离心后用HCl溶液调节上清液pH至3-6，静置沉淀后再次离心，将沉淀冻干。
再进一步，本发明提供一种所述小肽的应用，该小肽通过清除ABTS自由基和螯合亚铁离子发挥体内或体外的抗氧化作用，能用于制备抗氧化膳食补充剂或抗氧化护肤品。
更加详尽的技术方案参见具体实施例。
附图说明
图1是蛋白酶种类的筛选试验结果。
图2是粗蛋白浓度的筛选试验结果。
图3是酶添加量的筛选试验结果。
图4是酶解时间的筛选试验结果。
图5是地龙抗氧化肽总离子流图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何未背离本发明精神实质与原理下所作出的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
以下各实施例中，体外抗氧化活性测定的方法如下：
(1)ABTS自由基清除率的测定
取3mg ABTS溶于0.735mL蒸馏水中，得到7.4mmol/L的ABTS储备液，取1mg K2S2O8溶于1.43mL蒸馏水中，得到2.6mmol/L的K2S2O8储备液，取以上两种溶液各0.2mL混合，室温下避光反应12h，用95％乙醇溶液稀释40-50倍，得到ABTS+工作液。样品溶于超纯水中得到2mg/mL的样品溶液。依次在96孔板内加入40μL样品溶液和160μLABTS+工作液，震荡10s，静置6min，以95％乙醇溶液代替样液作为空白对照，在734nm下测其吸光值，每个样品做3个平行。
ABTS自由基清除率＝(A0-A)/A0*100％
(2)亚铁离子螯合率的测定
取0.0056g七水合硫酸亚铁用蒸馏水定容至10mL，得到2mmol/L硫酸亚铁溶液，取0.0246g菲洛嗪钠盐用蒸馏水定容至10mL，得到5mmol/L菲洛嗪溶液。样品溶于超纯水中得到2mg/mL的样品溶液。向96孔板中依次加入50μL样液、180μL蒸馏水和4μL硫酸亚铁溶液，充分混匀后室温静置5min，加入8μL菲洛嗪溶液，混匀后室温静置10min。以蒸馏水代替样液作为空白对照，在562nm下测其吸光值，每个样品做3个平行。
亚铁离子螯合率＝(A0-A)/A0*100％
实施例1活性多肽的制备
(1)地龙粗蛋白的提取：干制地龙磨成粉末备用，取40g地龙粉末于烧杯中，加入1L去离子水，在温度为60℃，pH为10的条件下浸提2.5h，在3800r/min转速条件下离心20min，用1mol/L的HCl溶液调节上清液pH至4.5，静置一定时间后再次离心，将沉淀冷冻干燥后即为地龙粗蛋白。
(2)多肽的制备与分级：将粗蛋白用水溶解成浓度为3％的溶液，然后按粗蛋白重量的3％向溶液中加入碱性蛋白酶，在pH为8、温度为55℃条件下酶解2小时，加热灭活后离心，取上清液。最后将上清液过截留分子量为5kDa的超滤膜进行分离，冷冻干燥后即得多肽。
申请人使用单因素对比试验，分别对步骤(2)中的蛋白酶种类及其加入量、粗蛋白溶液的浓度、酶解时间进行了优化，结果见图1-图4。
结果表明：
由图1可知，在水解度方面，碱性蛋白酶的水解度最高(10.5％)，胰蛋白酶水解度最低(2.8％)；在ABTS自由基清除率方面，复合蛋白酶的酶解产物抑制率最高(87.2％)，碱性蛋白酶次之(82.5％)，二者无显著差异(p>0.05)；在亚铁离子螯合率方面，碱性蛋白酶酶解产物的螯合率最高(77.5％)，复合蛋白酶次之(65.4％)，二者有显著差异(p<0.05)。由于碱性蛋白酶的水解度和产物活性均较高，说明该产物中的活性肽富集度更高，而且产量更大，因此最终选取碱性蛋白酶。
由图2可知，两条折线的趋势基本相同，当粗蛋白浓度达3％时，酶解产物的ABTS自由基清除率和亚铁离子螯合率更高。
由图3可知，当酶添加量为2％时，ABTS自由基清除率最高(86.0％)；当酶添加量为3％时，亚铁离子螯合率最高(84.6％)。综合考虑酶解效果，选择酶添加量为3％更好。
从图4可知，酶解时间为2h时，ABTS自由基清除率和亚铁离子螯合率同时达到最高，分别为85.8％和86.1％，故酶解时间选择2h更好。
实施例2：活性肽段的筛选
(1)地龙抗氧化肽结构鉴定
采用液质联用(UPLC-ESI-MS/MS)对实施例1制得的地龙肽进行结构鉴定。UPLC条件：色谱柱：Accucore 100*2.1mm,2.6μm；流动相A：0.1％甲酸-乙腈；B：0.1％甲酸水溶液。质谱条件：离子源ESI+MS，喷雾电压3800V，毛细管温度275℃，地龙抗氧化肽总离子流图见图5。借助Xcalibur软件对液质结果进行解析，通过与UniProt蛋白数据库中地龙属蛋白序列比对，根据Abundances值排序，预测前80个肽段可能具有较好的抗氧化活性。
(2)分子对接
利用Autodock分子对接软件，以80个肽为受体，以ABTS自由基为配体进行分子对接，根据对接打分筛选出了抗氧化活性最优的3个肽段：PGAGAVY、VADGDVLL、KDLY。
(3)肽段的活性验证
对筛选出的三个肽段PGAGAVY、VADGDVLL、KDLY进行人工合成，并测定其抗氧化活性，ABTS自由基清除率和亚铁离子螯合率的样品检测浓度分别为62.5μg/mL和1mg/mL，结果见表1。
表1三种肽段及混合多肽的抗氧化活性
结果表明，PGAGAVY和KDLY具有较好的ABTS自由基清除效果，且具有一定的亚铁离子螯合能力。两种肽在相同的浓度下，对ABTS自由基的清除率和亚铁离子螯合率均高于实施例1制备的混合多肽，而筛选出的另一肽段VADGDVLL抗氧化活性较差。本发明得到的PGAGAVY和KDLY是具有良好抗氧化活性的肽段，后续可用于制备抗氧化膳食补充剂和抗氧化护肤精华。
<110> 华中农业大学
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<213> 地龙（Geosaurus）
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Pro Gly Ala Gly Ala Val Tyr
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<213> 地龙（Geosaurus）
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Lys Asp Leu Tyr
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