一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法
阅读说明：本技术 一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法 (Method for preparing fructo-oligosaccharide through biotransformation after cane molasses pretreatment ) 是由 李坚斌 李元 李凯 雷光鸿 刘继栋 于 2021-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法,以甘蔗糖蜜为原料,依次经预处理、生物转化、纯化、灭酶、喷雾干燥后制取,其中生物转化以黑曲霉作为生产菌株,甘蔗糖蜜替代原始发酵培养基。通过本方法实现了甘蔗糖蜜的高附加值利用,降低了低聚果糖的制备成本的同时,提高了原有低聚果糖纯度,生物转化后滤出来的黑曲霉菌菌丝体可以重复利用。该操作工艺简便易行,制备周期短,所得产物活性优良,低聚果糖纯度高。(The invention discloses a method for preparing fructo-oligosaccharide by bioconversion after cane molasses pretreatment, which is prepared by taking cane molasses as a raw material and sequentially carrying out pretreatment, biotransformation, purification, enzyme deactivation and spray drying, wherein aspergillus niger is used as a production strain for bioconversion, and the cane molasses replaces an original fermentation culture medium. The method realizes high value-added utilization of cane molasses, reduces the preparation cost of fructo-oligosaccharide, improves the purity of the original fructo-oligosaccharide, and can repeatedly utilize the aspergillus niger mycelia filtered after biotransformation. The operation process is simple and easy to implement, the preparation period is short, the obtained product has excellent activity, and the purity of the fructo-oligosaccharide is high.)
技术领域
本发明涉及糖蜜制备低聚果糖领域，具体是一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法。
背景技术
甘蔗糖蜜作为甘蔗制糖过程中的副产物，是一种深褐色、呈粘稠状、半流动的液体。通常甘蔗糖蜜含糖量达40～60％(w/w)，而含水量低于20％(w/w)，还含有一定量的氨基酸、维生素、无机盐(SO4 2～、Ca2+、Na+等)，以及一些成色物质如焦糖物质、黑色素和胶体等。与葡萄糖及其他碳源相比，含有大量糖分的甘蔗糖蜜是一种廉价原料，具有良好的开发前景，可通过生物转化生产高附加值的生物产品。然而目前，甘蔗糖蜜只是简单地用于饲料生产或生产工业乙醇，这些低价值应用易造成环境污染和资源浪费。由此，寻求甘蔗糖蜜的高效高附加值利用在整个甘蔗糖蜜应用领域成为亟待解决的关键问题。
低聚果糖是重要的功能性益生元，具有促进消化道有益菌的生长、吸附肠道病原菌和提高饲料利用率等作用，被广泛应用于食品、医药及动物饲料等领域。然而，目前市场上低聚果糖的主要生产方法是以蔗糖为原料，通过果糖基转移酶进行转化，再进行分离浓缩结晶等过程。由于在转化过程中果糖基转移酶受葡萄糖抑制，导致低聚果糖的转化率仅在80％左右，加之蔗糖的价格影响，生产成本居高不下。因此，将甘蔗糖蜜作为原料制备低聚果糖，并进一步提高其纯度及转化率具有重大现实意义。
生物转化法又称全细胞催化法是基于酶生产应用的一种受控酶促发酵过程，其使用全细胞用作生物催化剂，不需要从微生物细胞中进行繁琐的酶纯化：且酶被保护在天然细胞中进行生物催化，可以获得更高的生产效率，而蔗糖又可以很容易地通过外细胞与酶反应，产物快速释放；同时细胞可以很容易地重复使用，无需昂贵的固定过程，具有良好的应用前景。
发明内容
为解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法，通过对甘蔗糖蜜进行预处理，除去其中胶体及金属离子之后，更有利于黑曲霉菌株生长，且酶活性得到提高，甘蔗糖蜜转化率上升，低聚果糖含量提高。采用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶除去副产物葡萄糖，进一步提高了低聚果糖的纯度及转化率。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种制备低聚果糖的方法以甘蔗糖蜜为原料，依次经预处理、生物转化后制取；所述生物转化以黑曲霉作为生产菌株；所述预处理按以下操作进行：将甘蔗糖蜜加水稀释，用磷酸调pH至3.0～4.0后搅拌均匀离心取上清液，加入石灰乳至pH 7.0～8.0同时加热升温至45～50℃并搅拌均匀，得调节液，调节液再加入聚丙烯酰胺搅拌均匀，离心取上清液用盐酸调pH至5.5～6.0后静置，取上清液即为预处理液。
所述生物转化按以下操作进行：将黑曲霉菌株接种到糖蜜发酵培养基中培养，得到黑曲霉全细胞溶液；黑曲霉全细胞溶液用滤布进行过滤、洗涤、再抽滤后获得黑曲霉菌菌丝体，将黑曲霉菌菌丝体放入盛有预处理液的反应罐中并搅拌12～24h，得反应液。
所述的制备低聚果糖的方法，还包括以下步骤：
(3)纯化：将反应液降温至40～45℃后加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，然后加入碳酸钙调节溶液钙离子浓度到5％-6％，并通风搅拌9～12h，之后过滤得到黑曲霉菌丝体和纯化液；
(4)灭酶：将纯化液升温90～98℃灭酶10～15min，得灭酶液；
(5)喷雾干燥：将灭酶液冷却至70～80℃后脱色过滤，最后经喷雾干燥后制得低聚果糖复合粉。
所述的甘蔗糖蜜加水稀释为甘蔗糖蜜加水稀释到锤度40～45°Bx；所述的石灰乳是质量浓度为6～10％；所述的聚丙烯酰胺是质量浓度为千分之一，加入量6mg～10mg/kg调节液。
所述的糖蜜发酵培养基是按以下的组分配制：预处理液：25g/L，酵母提取物：15g/L，MgSO4·7H2O：0.5g/L，KCL：0.5g/L，NaNO3：2g/L，K2HPO4：5g/L；所述的接种，接种量为1×108个/L～1×1010个/L，培养条件为28～32℃，pH 5.0～6.0，转速150～200r/min，时间36～60h；所述生物转化是在黑曲霉菌菌丝体添加量为80～100g/L，在pH 5.0～6.0，温度50～60℃，搅拌12～24h的条件下进行。
所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶添加量为葡萄糖氧化酶：1500～2000U/kg过滤液和过氧化氢酶：16000～20000U/kg过滤液；所述的碳酸钙的添加量为100～120g/kg过滤液。
所述的灭酶是在将溶液升温至90～100℃并保持10～15min；所述的喷雾干燥条件为：进风温度140～150℃，进料浓度20％～30％。
本发明的有益效果如下：
根据国标GB/T23528～2009低聚果糖中的方法，利用高压色谱法检测FOS糖浆(纯化液)中低聚果糖的含量，低聚果糖含量达到209.01g/L以上，转化效率高，其中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的出峰时间分别为12.340min、15.537min和19.197min。所得糖浆中低聚果糖(FOS)的含量最高为221.36g/L，相对百分比为42.91％。
由于采用的是甘蔗糖蜜进行转化，甘蔗糖蜜作为甘蔗制糖过程中的副产物，与使用蔗糖为原料制备低聚果糖的方法相比较，能有效降低制备成本，实现了甘蔗糖蜜的高附加值利用。
同时发现用甘蔗糖蜜作为培养基培养黑曲霉菌株，发酵优化后，可提高菌丝体内酶活性，降低了生产成本，且黑曲霉菌菌丝体可以重复使用，利用率高。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
图2是FOS标品液相色谱图。
图3是FOS产物与标品对比液相色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。以下各实施例均需要先做黑曲霉菌株培养，黑曲霉菌种为ATCC 20611，购买自美国模式培养物集存库美国佛罗里达。黑曲霉菌菌株的培养过程如下：
黑曲霉菌株培养：将保存在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上的黑曲霉菌种接种到酵母麦芽糖培养基(YM)培养基中在28～32℃，培养24～48h。
实施例1
本实施例是一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法的一个实施例，具体步骤如下：
(1)甘蔗糖蜜预处理：取1L的甘蔗糖蜜，加水稀释到45°Bx后，用磷酸调pH至3.0，搅拌均匀离心取上清液，加入石灰乳至pH 8.0同时加热升温至50℃，再加入10mg/kg聚丙烯酰胺(浓度千分之一)，搅拌均匀，离心取上清液用盐酸调pH至6.0后静置备用；
(2)生物转化：将黑曲霉菌株接种到糖蜜发酵培养基中培养，接种量为1×108个/L，在28℃，pH 5.0～6.0，转速150r/min的条件下培养60h后得到黑曲霉全细胞溶液。其中，糖蜜发酵培养基按预处理液25g/L,酵母提取物15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，NaNO32 g/L，K2HPO4 5g/L配制；将培育得到的黑曲霉全细胞溶液用滤布进行过滤、洗涤、再抽滤后获得黑曲霉菌菌丝体，将黑曲霉菌菌丝体按80g/L的添加量加入到盛有预处理液的反应罐中，在50℃和pH值为5.0的条件下搅拌12h得反应液；
(3)纯化：将反应液降温至40℃后加入1500U/kg葡萄糖氧化酶和16000U/kg过氧化氢酶，然后用100g/kg碳酸钙调节溶液钙离子溶度到5.0％，通风搅拌9h，进行副产物的去除及低聚果糖的纯化，之后过滤得到黑曲霉菌丝体和纯化液，黑曲霉菌菌丝体可以继续用于生物转化；
(4)灭酶：将纯化液升温到90℃进行灭酶，恒温10min，得灭酶液；
(5)喷雾干燥：将灭酶液降温至80℃后经活性炭脱色过滤，最后经喷雾干燥后制得低聚果糖复合粉。喷雾干燥条件为：进风温度140℃，进料浓度30％。
根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，本实例所得糖浆(纯化液)中低聚果糖(FOS)的总含量达到209.01g/L，相对百分比为40.51％，复合粉含水率为6.46％。
实施例2
本实施例是一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法的另一个实施例，具体步骤如下：
(1)甘蔗糖蜜预处理：取1L的甘蔗糖蜜，加水稀释到42°Bx后，用磷酸调pH至3.5，搅拌均匀离心取上清液，加入石灰乳至pH 7.0同时加热升温至48℃，再加入8mg/kg聚丙烯酰胺(浓度千分之一)，搅拌均匀，离心取上清液用盐酸调pH至5.8后静置备用；
(2)生物转化：将黑曲霉菌株接种到糖蜜发酵培养基中培养，接种量为1×109个/L，在30℃，pH 5.5，转速180r/min的条件下培养48h后得到黑曲霉全细胞溶液。其中，糖蜜发酵培养基按预处理液25g/L,酵母提取物15g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，KCL 0.5g/L，NaNO32 g/L，K2HPO4 5g/L配制；将培育得到的黑曲霉全细胞溶液用滤布进行过滤、洗涤、再抽滤后获得黑曲霉菌菌丝体，将黑曲霉菌菌丝体按90g/L的添加量加入到盛有预处理液的反应罐中，在55℃和pH值为6.0的条件下搅拌18h得反应液；
(3)纯化：将反应液降温至45℃后加入1800U/kg葡萄糖氧化酶和18000U/kg过氧化氢酶，然后用110g/kg碳酸钙调节溶液钙离子溶度到6.0％，通风搅拌10h，进行副产物的去除及低聚果糖的纯化，之后过滤得到黑曲霉菌丝体和纯化液，黑曲霉菌菌丝体可以继续用于生物转化；
(4)灭酶：将纯化液升温到95℃进行灭酶，恒温12min，得灭酶液；
(5)喷雾干燥：将灭酶液降温至75℃后经活性炭脱色过滤，最后经喷雾干燥后制得低聚果糖复合粉。喷雾干燥条件为：进风温度145℃，进料浓度25％。
根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆(纯化液)中低聚果糖(FOS)的总含量达到216.02g/L，相对百分比为41.87％，复合粉含水率为5.37％。
实施例3
本实施例是一种甘蔗糖蜜预处理后生物转化制备低聚果糖的方法的另一个实施例，具体步骤如下：
(1)甘蔗糖蜜预处理：取1L的甘蔗糖蜜，加水稀释到40°Bx后，用磷酸调pH至4.0，搅拌均匀离心取上清液，加入石灰乳至pH 8.0同时加热升温至45℃，再加入6mg/kg聚丙烯酰胺(浓度千分之一)，搅拌均匀，离心取上清液用盐酸调pH至5.5后静置备用；
(2)生物转化：将黑曲霉菌株接种到糖蜜发酵培养基中培养，接种量为1×1010个/L，在32℃，pH 6.0，转速200r/min的条件下培养36h后得到黑曲霉全细胞溶液。其中，糖蜜发酵培养基按预处理液25g/L,酵母提取物15g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，NaNO32g/L，K2HPO4 5g/L配制；将培育得到的黑曲霉全细胞溶液用滤布进行过滤、洗涤、再抽滤后获得黑曲霉菌菌丝体，将黑曲霉菌菌丝体按100g/L的添加量加入到盛有预处理液的反应罐中，在55℃和pH值为6.0的条件下搅拌24h，得反应液；
(3)纯化：将反应液降温至45℃后加入2000U/kg葡萄糖氧化酶和20000U/kg过氧化氢酶，然后用120g/kg碳酸钙调节溶液钙离子溶度到5.5％，通风搅拌12h，进行副产物的去除及低聚果糖的纯化，之后过滤得黑曲霉菌菌丝体和纯化液；黑曲霉菌菌丝体可以继续用于生物转化；
(4)灭酶：将纯化液升温到98℃进行灭酶，恒温15min，得灭酶液；
(5)喷雾干燥：将灭酶液降温至70℃后经活性炭脱色过滤，最后经喷雾干燥后制得低聚果糖复合粉。喷雾干燥条件为：进风温度150℃，进料浓度20％。
根据国标GB/T23528-2009低聚果糖中的高效液相方法检测，所得糖浆(纯化液)中低聚果糖(FOS)的总含量达到221.36g/L，相对百分比为42.91％，复合粉含水率为4.96％。
采用本方法制备出的低聚果糖复合粉，作为饲料添加剂可以广泛的应用到饲料中。
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