一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用
阅读说明：本技术 一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用 (Construction of broad-host plasmid for inducible expression of green fluorescent protein and application of broad-host plasmid in fluorescent tracing ) 是由 田明星 于圣青 李子晨 王少辉 尹伊 胡海 丁铲 李涛 祁晶晶 于 2021-06-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用。本发明所述的pBT-iEGFP质粒,是基于广宿主质粒pBBR1MCS骨架构建而成,包含有四环素阻遏蛋白TetR、四环素启动子Pzt-1和增强型绿色荧光蛋白EGFP序列。具有广宿主的特性,至少可以在大肠杆菌属细菌、沙门菌属细菌以及布鲁菌属细菌中复制,但不限于上述几种细菌。包含有该质粒的细菌在特定浓度无水四环素诱导条件下,可以诱导宿主细菌发出绿色荧光。具有多种细菌通用性、可控表达性、特定示踪活菌、强荧光等优点。该质粒可以用于多种细菌的荧光标记,细菌形态学观察以及荧光动态示踪等技术。(The invention discloses construction of broad-host plasmid for inducible expression of green fluorescent protein and application of the broad-host plasmid in fluorescent tracing. The pBT-iEGFP plasmid is constructed based on a wide-host plasmid pBBR1MCS framework and comprises a tetracycline repressor protein TetR, a tetracycline promoter Pzt-1 and an enhanced green fluorescent protein EGFP sequence. Has broad host range and can replicate in at least Escherichia coli, Salmonella and Brucella, but not limited to them. The bacteria containing the plasmid can induce host bacteria to emit green fluorescence under the induction condition of anhydrous tetracycline with specific concentration. Has the advantages of universality, controllable expression, specific tracing viable bacteria, strong fluorescence and the like of various bacteria. The plasmid can be used for fluorescence labeling of various bacteria, bacteria morphology observation, fluorescence dynamic tracing and other technologies.)
技术领域
本发明为基因工程领域，具体地说，本发明涉及到一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的广宿主质粒pBT-iEGFP的构建方法，该质粒可以在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中稳定遗传，在加入无水四环素条件下，可高效表达增强型绿色荧光蛋白。本质粒基于广宿主质粒而构建，可用于多种细菌，不仅仅用于大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌的荧光示踪。
背景技术
荧光蛋白常用来标记并示踪特定蛋白、病毒或细菌的发光蛋白，与荧光抗体标记相比，其成本低、操作方便、荧光强度高且背景值低等特点。目前市场上用于荧光标记的蛋白较多，如绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白mCherry和DsRed、蓝色荧光蛋白BFP、黄色荧光蛋白YFP等。本发明中使用的是增强型绿色荧光蛋白EGFP，其荧光强度更强，更加利于观察。
大肠杆菌工程菌，如DH5α，是一种常用的用来表达外源蛋白或进行基因工程操作的工具菌种，方便利用化学转化的方法进行基因操作，也方便评估目的基因的表达情况等。禽致病性大肠杆菌是感染家禽的一种重要的细菌性病原，由多种血清学致病性大肠杆菌感染所引起，临床症状包括气囊炎、肝周炎和心包炎等。鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患的病原菌，主要导致食物中毒，在婴幼儿中，病死率较高。布鲁菌同样是一种重要的人畜共患细菌性病原，感染孕畜导致流产，感染人引起波浪热，对公共卫生和畜牧业发展造成巨大影响。
细菌的荧光标记是一种重要的常见的实验标记技术，用于研究细菌生理生化特性、宿主体内示踪、细菌感染细胞示踪、致病机制研究等。不同种属的细菌，如大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌等，通常构建有自己专用的荧光标记质粒，尽管在单独使用时，具有显著的荧光活性，但由于质粒的复制特性，启动子的种类不同，不同细菌需要不同类型的质粒，而且同一质粒在不同种属细菌间不能通用，如在大肠杆菌中能表达荧光的质粒，在布鲁菌中却不能使用，甚至会被降解，而在布鲁菌中能表达荧光的质粒，在大肠杆菌和沙门菌中并不能兼容。此外，市场上用于大肠杆菌、沙门菌和布鲁菌的荧光质粒大多为持续性表达荧光质粒，在感染过程中，无论死菌或活菌都能发出荧光，不能有效区分感染的细菌是活菌还是死菌。因此，构建一个多种细菌通用型的质粒，并可控表达荧光蛋白，可用于示踪感染中的活菌，具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术中的技术缺陷，本发明作出如下技术贡献，
本发明首先提供一种pBT-iEGFP质粒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列
进一步的，本发明提供一种荧光示踪质粒的制备方法，所述方法以广宿主质粒pBBR1MCS (Kovach ME, Phillips RW, Elzer PH, Roop RM, 2nd, Peterson KM.pBBR1MCS: a broad-host-range cloning vector. BioTechniques, 1994; 16: 800-802.) 为骨架，将阻遏蛋白TetR和四环素启动子Pzt-1和增强型绿色荧光蛋白EGFP串联，构建成一个新的用于可诱导表达绿色荧光蛋白的广宿主质粒pBT-iEGFP。
进一步的，具体构建方法如下：1）以pZT-EGFP为模板，iEGFP-F 和iEGFP-R为引物，PCR扩增绿色荧光蛋白诱导表达片段TetR-Pzt-1-iEGFP；2）限制性内切酶KpnI和XbaI双酶切pBBR1MCS质粒，经琼脂糖凝胶电泳后，天根DNA胶回收试剂盒回收线性pBBR1MCS片段；3）无缝克隆试剂盒连接TetR-Pzt-1-iEGFP片段和pBBR1MCS线性化质粒，产物转化至大肠杆菌DH5α中，PCR鉴定阳性克隆，测定正确的质粒命名为pBT-iEGFP质粒。
进一步的，本发明提供上述构建方法中所使用的引物，其具体序列如下：
iEGFP-F: AGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTA（SEQ ID NO.2）
iEGFP-R: CGCGGTGGCGGCCGCTCGATCGATTATTTATTTCCTG（SEQ ID NO.3）
进一步的，本发明提供一种荧光示踪质粒的应用，所述应用为pBT-iEGFP质粒可以通过化学转化或电转化的方式转化至大肠杆菌工程菌或禽致病性大肠杆菌中，通过无水四环素诱导，涂片后，荧光显微镜观察细菌荧光，体外荧光示踪大肠杆菌。
进一步的，所述应用具体为：1）大肠杆菌工程菌DH5α化学转化方法：取100 µL大肠杆菌感受态细胞，冰水混合物上慢慢融化，加入20 ng pBT-iEGFP质粒，混合均匀后，冰浴30min，42 ℃热激90 s，冰浴2 min，加入1 mL LB溶液，37 ℃震荡培养45 min，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、10 ng/mL、25ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5-10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。2）禽致病性大肠杆菌AH50电转化方法：LB培养禽致病性大肠杆菌AH50至对数生长前期（OD600= 0.4~0.6），冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，1.8 kV200 Ω条件下，将质粒电转化至禽致病性大肠杆菌AH50中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12h，取100 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5-10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。
进一步的，本发明提供一种pBT-iEGFP质粒在鼠伤寒沙门菌荧光示踪中的应用，所述应用为：可以通过电转化的方式转化至鼠伤寒沙门菌中，通过无水四环素诱导，涂片后，荧光显微镜观察细菌荧光，体外荧光示踪沙门菌。
进一步的，所述应用具体操作如下：将鼠伤寒沙门菌标准株SL1344 LB培养至对数生长前期(OD600= 0.4~0.6)，冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，1.8 kV 200 Ω条件下，将质粒电转化至SL1344中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5-10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。
进一步的，本发明提供一种pBT-iEGFP质粒在马耳他布鲁菌示踪中的应用，所述应用为通过无水四环素诱导，灭活涂片后，荧光显微镜观察细菌荧光，体外荧光示踪布鲁菌。
进一步的，所述应用具体操作如下：马耳他布鲁菌疫苗株M5接种TSB中，培养至对数生长前期(OD600= 0.6~0.8)，冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1mm电转化杯中，2.4 kV 400 Ω条件下，将质粒电转化至M5中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆菌株接种氯霉素TSB溶液中，分别加入0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导24 h，加0.3 %福尔马林溶液灭活24 h，取100 µL灭活菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5-10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。
进一步的，本发明提供一种pBT-iEGFP质粒可用于示踪感染细胞过程中马耳他布鲁菌活菌，布鲁菌感染细胞后，通过无水四环素诱导活菌产生绿色荧光，通过红色荧光抗体示踪，可以用于区分感染细胞的活菌和死菌。
进一步的，所述应用具体操作如下：TSB培养上述构建的含有pBT-iEGFP质粒的马耳他布鲁菌M5(pBT-iEGFP) 至对数生长期，测定OD600值，调整细菌浓度；此外，在预载有爬片的24孔细胞培养板中培养RAW264.7细胞至单层，按照细菌：细胞为1：200的比例接种布鲁菌，37℃感染1 h，待感染后20 h，在细胞中加入100 ng/mL无水四环素诱导6 h，激活活菌表达EGFP，随后，4 %甲醛溶液固定爬片，PBS洗涤2遍，0.05 %的Tween20-PBS (PBST)溶液洗涤爬片3遍，0.5 % TritonX-100-PBS室温透化细胞15 min，PBST 洗涤爬片3遍，5 % BSA封闭爬片1 h，PBST 洗涤爬片3遍，0.5 % BSA-PBS溶液1: 500倍稀释加入鼠抗布鲁菌抗体，37℃孵育1 h，PBST洗涤爬片3遍， 0.5 %的BSA-PBS溶液1: 1000倍稀释加入Alexa Flour 555标记羊抗鼠IgG二抗，PBST洗涤爬片3遍，无菌去离子水洗涤爬片1遍，晾干爬片，加上1滴封片剂，倒扣在载玻片上，荧光显微镜观察胞内布鲁菌荧光。胞内活的布鲁菌显示绿色荧光，同时被抗体标记发出红色荧光；胞内死的布鲁菌不能显示绿色荧光，只能被抗体标记为红色荧光。
进一步的，由于pBT-iEGPF质粒基于广宿主质粒而构建，能够同时在多种不同的细菌中复制，原则上可以适用于支持pBBR1MCS质粒复制的细菌，并且在无水四环素的诱导下，能使活的细菌发出绿色荧光，死的细菌不能发出荧光，可用于各种科研活动中活菌的示踪，如观察活菌生物被膜形成能力，排除死菌的干扰；用于示踪感染状态下活菌的胞内转运和移行情况，排除死菌造成的观察假象；同时，可用于各种细菌的细胞感染分析，判定细菌胞内复制能力，评估细菌的致病特性等科研活动。
有益效果
本发明基于广宿主质粒pBBR1MCS骨架和通用型启动子Pzt1构建成一种可诱导性表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒，可实现在不同种属细菌中都能复制和表达绿色荧光蛋白，既可以适用于大肠杆菌和沙门菌，也可以适用于布鲁菌等常见细菌，同时在无水四环素的诱导下，可控表达绿色荧光蛋白，能成功示踪感染过程中的活菌。因此，本发明构建的质粒具有以下优点：1）通用便利性，多种细菌都可以适用；2）可控表达性，荧光蛋白在加入无水四环素诱导情况下表达；3）示踪活菌，细菌感染细胞后，使用无水四环素激活活菌表达绿色荧光蛋白，排除死菌干扰。4）强荧光活性，本质粒使用增强型绿色荧光蛋白基因，能发出比GFP更强的绿色荧光，更利于观察。总之，本发明构建的质粒为细菌的荧光示踪研究提供便利。
附图说明
图1. pBT-iEGFP质粒图谱
图2. pBT-iEGFP质粒在大肠杆菌工程菌DH5α中诱导表达
图3. 禽致病性大肠杆菌AH50(pBT-iEGFP)在不同无水四环素浓度下的生长曲线
图4. pBT-iEGFP质粒在禽致病性大肠杆菌AH50中遗传稳定性分析，其中1-5分别为细菌无抗性培养的第一代次、第二代次、第三代次、第四代次和第五代次。
图5. pBT-iEGFP质粒在禽致病性大肠杆菌AH50中诱导表达。
图6. 鼠伤寒沙门菌SL1344(pBT-iEGFP)在不同无水四环素浓度下的生长曲线
图7. pBT-iEGFP质粒在鼠伤寒沙门菌SL1344中遗传稳定性分析，其中1-5分别为细菌无抗性培养的第一代次、第二代次、第三代次、第四代次和第五代次。
图8. pBT-iEGFP质粒在鼠伤寒沙门菌SL1344中诱导表达。
图9. 马耳他布鲁菌M5(pBT-iEGFP)在不同无水四环素浓度下的生长曲线。
图10. pBT-iEGFP质粒在马耳他布鲁菌M5中遗传稳定性分析，其中1-5分别为细菌无抗性培养的第一代次、第二代次、第三代次、第四代次和第五代次。
图11. pBT-iEGFP质粒在马耳他布鲁菌M5中诱导表达。
图12. pBT-iEGFP质粒示踪胞内复制的活的布鲁菌。其中，既能发出绿色荧光又能被抗体标记发出红色荧光的菌为活菌；只能被抗体标记发出红色荧光，不能发出绿色荧光的菌为死菌，如箭头所示。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。
本发明中构建的pBT-iEGFP质粒的序列详见序列表。
实施例1 pBT-iEGFP质粒的构建
以实验室前期构建的诱导性质粒pZT-EGFP质粒 (Tian M, Qu J, Bao Y, Gao J,Liu J, Wang S, Sun Y, Ding C, Yu S. Construction of pTM series plasmids forgene expression in Brucella species. J Microbiol Methods, 2016; 123: 18-23.)为模板，iEGFP-F和iEGFP-R为引物，引物如下：
iEGFP-F: AGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTA（SEQ ID NO.2）
iEGFP-R: CGCGGTGGCGGCCGCTCGATCGATTATTTATTTCCTG（SEQ ID NO.3）
使用保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase (大连宝生物公司) 进行PCR扩增可诱导表达绿色荧光蛋白的基因片段TetR-Pzt-1-iEGFP，PCR反应体系为50 µL，包含：PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 µL，上游引物和下游引物各2 µL，pZT-EGFP (5 µg/µL)2 µL，无菌水补足至50 µL；PCR反应程序为：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环。产物大小为1908 bp，1 %琼脂糖凝胶电泳后，天根DNA琼脂糖胶回收试剂盒回收DNA片段，4 ℃备用。
1.广宿主质粒pBBR1MCS经限制性内切酶Kpn I和Xba I双酶切，酶切体系如下：pBBR1MCS质粒2 µg，Kpn I和Xba I各2 µL，10× M Buffer 4 µL，加水补足至40 µL；37 ℃酶切2 h，1 %琼脂糖凝胶电泳后，天根DNA琼脂糖胶回收试剂盒回收线性化pBBR1MCS片段，4℃备用。
2.将胶回收的TetR-Pzt-1-iEGFP和pBBR1MCS线性化片段进行重组连接，使用诺唯赞ClonExpress II One Step Cloning Kit进行无缝连接，反应体系如下：线性化pBBR1MCS质粒1 µL，iEGFP片段1 µL，5× CE II Buffer 4 µL，Exnase II 2 µL，加无菌水补足20 µL；轻轻混匀后，37 ℃反应30 min，立即置于冰上冷却，取10 µL重组产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布氯霉素LB平板，挑取单克隆，PCR鉴定阳性菌落，测序正确的质粒命名为pBT-iEGFP，质粒图谱如图1，全长序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 pBT-iEGFP质粒在大肠杆菌中诱导表达绿色荧光蛋白
pBT-iEGFP质粒在大肠杆菌工程菌DH5a中进行诱导表达绿色荧光蛋白
取100 µL大肠杆菌感受态细胞 (北京天根生物)，冰水混合物上慢慢融化，加入20ng pBT-iEGFP质粒，混合均匀后，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，冰浴2 min，加入1 mL LB溶液，37 ℃震荡培养45 min，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，PCR鉴定阳性菌落，阳性菌命名为DH5α(pBT-iEGFP)；将DH5α(pBT-iEGFP)接种于氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、10ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导表达12 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。结果如图2所示，在0 ng/mL 无水四环素条件下，DH5α(pBT-iEGFP) 无绿色荧光显现；当无水四环素浓度达到10 ng/mL时，DH5α(pBT-iEGFP) 呈现明显绿色荧光；当无水四环素浓度达到25 ng/mL时，DH5α(pBT-iEGFP) 呈现较强荧光；当浓度达到50 ng/mL和100 ng/mL时，DH5α(pBT-iEGFP) 呈现强荧光。该实施例表明，pBT-iEGFP质粒能在大肠杆菌工程菌DH5a中成功诱导表达绿色荧光蛋白，且随着无水四环素浓度的提高，绿色荧光表达明显增强。
1. pBT-iEGFP质粒在禽致病性大肠杆菌AH50中遗传稳定性、重组菌对无水四环素的敏感性和诱导表达绿色荧光蛋白
2.1 重组菌株构建：将禽致病性大肠杆菌AH50接种至LB液体培养基中，培养至对数生长早期 (OD600= 0.4~0.6)，冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1mm电转化杯中，1.8 kV 200Ω条件下，将质粒电转化至禽致病性大肠杆菌AH50中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，PCR鉴定阳性克隆，鉴定阳性菌株命名为AH50(pBT-iEGFP)。
2.2 重组菌对无水四环素敏感性：AH50(pBT-iEGFP) 接种于LB液体培养基中，培养12 h，测定细菌OD600值，调整OD600值至1.0，按照1:10的比例接种于3 mL LB培养基中，在培养基中分别添加无水四环素浓度为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL，每间隔1 h，测定细菌OD600值，观察无水四环素对重组菌AH50(pBT-iEGFP) 的抑制作用。结果如图3所示，添加不同浓度的无水四环素对AH50(pBT-iEGFP) 无明显的抑制作用，表明无水四环素在5~100 ng/mL浓度下，对AH50(pBT-iEGFP) 无杀菌活性，适合做AH50(pBT-iEGFP) 表达绿色荧光蛋白的诱导剂。
2.3 质粒遗传稳定性测定：为探讨pBT-iEGFP在禽致病性大肠杆菌AH50中的稳定性，将AH50(pBT-iEGFP) 接种于无抗生素的LB液体培养基中盲传5代，每个代次的细菌分别用PBS做10倍倍比稀释，分别涂布LB平板和氯霉素LB平板，37 ℃培养过夜，分别计数氯霉素抗性LB平板和无抗性LB平板细菌CFU，AH50(pBT-iEGFP) 重组菌的百分比= 氯霉素抗性平板CFU/无抗性平板CFU× 100%，比较五代盲传过程中 pBT-iEGFP在AH50的稳定性。结果如图4所示，AH50(pBT-iEGFP) 在五代盲传过程中百分比均高于90 %以上，表明pBT-iEGFP在AH50中非常稳定。
2.4 重组菌表达绿色荧光蛋白：AH50(pBT-iEGFP) 接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤细菌两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。结果如图5显示，在0 ng/mL 无水四环素条件下，AH50 (pBT-iEGFP) 无绿色荧光显现；无水四环素浓度达到5 ng/mL时，AH50 (pBT-iEGFP) 呈现微弱的绿色荧光；当无水四环素浓度达到10 ng/mL时，AH50(pBT-iEGFP) 呈现明显绿色荧光；当无水四环素浓度达到25 ng/mL时，AH50(pBT-iEGFP) 呈现较强荧光；当浓度达到50 ng/mL和100 ng/mL时，AH50(pBT-iEGFP) 呈现强荧光。该实施例表明，pBT-iEGFP质粒能在禽致病性大肠杆菌工AH50中成功诱导表达绿色荧光蛋白，且随着无水四环素浓度的提高，绿色荧光表达明显增强。
实施例3 pBT-iEGFP质粒在鼠伤寒沙门菌中诱导表达绿色荧光蛋白
1.重组菌的构建：将鼠伤寒沙门菌SL1344接种至LB液体培养基中，培养至对数生长早期 (OD600= 0.4~0.6)，冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，1.8 kV 200 Ω条件下，将质粒电转化至鼠伤寒沙门菌SL1344中，涂布氯霉素LB平板筛选阳性克隆，PCR鉴定阳性克隆，鉴定阳性菌株命名为SL1344(pBT-iEGFP)。
2.重组菌对无水四环素敏感性：SL1344(pBT-iEGFP) 接种于LB液体培养基中，培养12 h，测定细菌OD600值，调整OD600值至1.0，按照1:10的比例接种于3 mL LB培养基中，在培养基中分别添加无水四环素浓度为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL，每间隔1 h，测定细菌OD600值，观察无水四环素对SL1344(pBT-iEGFP) 的抑制作用。结果如图6所示，添加不同浓度的无水四环素对SL1344(pBT-iEGFP) 无明显的抑制作用，表明无水四环素在5~100 ng/mL浓度下，对SL1344(pBT-iEGFP) 无杀菌活性，适合做SL1344(pBT-iEGFP) 表达绿色荧光蛋白的诱导剂。
3.质粒遗传稳定性测定：为探讨pBT-iEGFP在鼠伤寒沙门菌SL1344中的稳定性，将SL1344(pBT-iEGFP) 接种于无抗生素的LB液体培养基中盲传5代，每个代次的细菌分别用PBS做10倍倍比稀释，分别涂布LB平板和氯霉素LB平板，37 ℃培养过夜，分别计数氯霉素抗性LB平板和无抗性LB平板细菌CFU，SL1344(pBT-iEGFP) 重组菌的百分比= 氯霉素抗性平板CFU/无抗性平板CFU× 100%，比较五代盲传过程中 pBT-iEGFP在SL1344的稳定性。结果如图7所示，SL1344(pBT-iEGFP) 在五代盲传过程中百分比均高于92 %以上，表明pBT-iEGFP在SL1344中非常稳定。
4.重组菌表达绿色荧光蛋白：SL1344(pBT-iEGFP) 接种氯霉素LB溶液中，分别加入0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导12 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。结果如图8显示，在0 ng/mL 无水四环素条件下，SL1344(pBT-iEGFP) 无绿色荧光显现；无水四环素浓度达到5 ng/mL时，SL1344(pBT-iEGFP) 呈现微弱的绿色荧光；当无水四环素浓度达到10和25 ng/mL时，SL1344(pBT-iEGFP) 呈现明显绿色荧光；当无水四环素浓度达到50 ng/mL时，SL1344(pBT-iEGFP) 呈现较强荧光；当浓度达到100 ng/mL时，SL1344(pBT-iEGFP) 呈现强荧光。该实施例表明，pBT-iEGFP质粒能在鼠伤寒沙门菌SL1344中成功诱导表达绿色荧光蛋白，且随着无水四环素浓度的提高，绿色荧光表达明显增强。
实施例4 pBT-iEGFP质粒在马耳他布鲁菌中诱导表达绿色荧光蛋白
1.重组菌的构建：将马耳他布鲁菌M5接种至TSB液体培养基中，培养至对数生长早期 (OD600= 0.6~0.8)，冰浴10 min，无菌预冷水洗涤菌体两遍，预冷的10 %甘油无菌水悬浮细胞，每管分装100 µL，加入1 µg pBT-iEGFP质粒，冰浴10 min，将混合物加入1 mm电转化杯中，2.4 kV 400 Ω条件下，将质粒电转化至M5中，涂布氯霉素TSB平板筛选阳性克隆，PCR鉴定阳性克隆，鉴定阳性菌株命名为M5(pBT-iEGFP)。
2.重组菌对无水四环素敏感性：M5(pBT-iEGFP) 接种于TSB液体培养基中，培养24h，测定细菌OD600值，调整OD600值至1.0，按照1:100的比例接种于3 mL LB培养基中，在培养基中分别添加无水四环素浓度为0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100ng/mL，每间隔4 h，测定细菌OD600值，观察无水四环素对M5(pBT-iEGFP) 的抑制作用。结果如图9所示，无水四环素在5~50 ng/mL浓度时对M5(pBT-iEGFP) 无明显的抑制作用，浓度在100 ng/mL时，M5(pBT-iEGFP) 生长要略缓慢，表明无水四环素在5~50 ng/mL浓度下，对M5(pBT-iEGFP) 无杀菌活性，适合做M5(pBT-iEGFP) 表达绿色荧光蛋白的诱导剂。
5.质粒遗传稳定性测定：为探讨pBT-iEGFP在马耳他布鲁菌M5中的稳定性，将M5(pBT-iEGFP) 接种于无抗生素的TSB液体培养基中盲传5代，每个代次的细菌分别用PBS做10倍倍比稀释，分别涂布TSB平板和氯霉素TSB平板，37 ℃培养过夜，分别计数氯霉素抗性TSB平板和无抗性TSB平板细菌CFU，M5(pBT-iEGFP) 重组菌的百分比= 氯霉素抗性平板CFU/无抗性平板CFU× 100%，比较五代盲传过程中 pBT-iEGFP在M5的稳定性。结果如图10所示，M5(pBT-iEGFP) 在五代盲传过程中百分比均高于93 %以上，表明pBT-iEGFP在M5中非常稳定。
3.重组菌表达绿色荧光蛋白：M5(pBT-iEGFP) 接种氯霉素TSB溶液中，分别加入0ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL无水四环素诱导24 h，加入0.3%的福尔马林溶液灭活24 h，取500 µL培养菌液，PBS洗涤两遍，无菌水悬浮，取5~10 µL悬浊液涂布载玻片，酒精灯烘干，荧光显微镜观察细菌荧光。结果如图11显示，在0 ng/mL 和5ng/mL无水四环素条件下，5 ng/mL无绿色荧光显现；无水四环素浓度达到10 ng/mL时，M5(pBT-iEGFP) 呈现极微弱的绿色荧光；当无水四环素浓度达到25 ng/mL时，M5(pBT-iEGFP)呈现明显绿色荧光；当无水四环素浓度达到50 ng/mL时，M5(pBT-iEGFP) 呈现较强荧光；当浓度达到100 ng/mL时，M5(pBT-iEGFP) 呈现强荧光。该实施例表明，pBT-iEGFP质粒能在马耳他布鲁菌M5中成功诱导表达绿色荧光蛋白，且随着无水四环素浓度的提高，绿色荧光表达明显增强。
实施例5 pBT-iEGFP质粒在示踪胞内感染布鲁菌中的应用
1.细胞准备：小鼠RAW264.7细胞按照2.5×105 cells/mL接种于24孔细胞培养板中，细胞孔中预装14 mm直径的圆形爬片，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜，待细胞长成单层备用。
2.细胞感染：TSB培养实例4中构建的M5(pBT-iEGFP)菌株至对数生长期, 测定细菌OD600值，调整细菌浓度，按照细菌：细胞 (200:1) 比例接种布鲁菌至单层细胞中，400×g离心培养板5 min，使细胞均匀感染细菌，之后，于37℃ 5 % CO2条件下感染1 h；PBS洗涤细胞3遍，去除未黏附的细菌，加入含100 µg/mL的庆大霉素DMEM杀菌1 h，PBS洗涤细胞3遍，去除胞外未入侵的细菌，随后，加入含20 µg/mL的庆大霉素和2 %小牛血清的DMEM维持细胞，完成布鲁菌感染细胞过程。
3.EGFP诱导表达和爬片制备： M5(pBT-iEGFP)感染RAW264.7细胞20 h后，在细胞培养液中加入终浓度100 ng/mL的无水四环素诱导胞内布鲁菌表达EGFP，诱导时间为6 h，PBS洗涤细胞3遍，在细胞爬片中加入4 %甲醛PBS溶液进行固定，室温固定半小时，取出爬片备用。
4.间接免疫荧光试验：PBS洗涤爬片2遍，0.05 %的Tween20-PBS (PBST)溶液洗涤爬片3遍，每次5 min，0.5 % TritonX-100-PBS室温透化细胞15 min，PBST 洗涤爬片3遍，每次5 min，5 % BSA封闭爬片1 h，PBST 洗涤爬片3遍，每次5 min，0.5 % BSA-PBS溶液1: 500倍稀释加入鼠抗布鲁菌抗体，37℃孵育1 h，PBST洗涤爬片3遍，每次5 min，0.5 %的BSA-PBS溶液1: 1000倍稀释加入Alexa Flour 555标记羊抗鼠IgG二抗，PBST洗涤爬片3遍，每次5min，无菌去离子水洗涤爬片1遍，晾干爬片，加上1滴封片剂，倒扣在载玻片上，待观察胞内布鲁菌荧光。
5.荧光观察：将制备的载玻片加上一滴香柏油，日本尼康Eclipse 80i正置显微镜1000×放大倍数观察爬片，如图12所示，布鲁菌M5(pBT-iEGFP)感染细胞在加入无水四环素情况下，发出明显绿色荧光，相同情况下，通过抗体荧光染色可以发现，胞内所有细菌发出红色荧光，但有部分红色荧光的细菌并不能在无水四环素诱导条件下发出绿色荧光（如图12白色箭头所指细菌），表明只有在胞内活的布鲁菌能在无水四环素诱导条件下成功表达EGFP而发出绿色荧光，而胞内死亡的细菌由于不具有活菌特性，不能成功诱导表达EGFP发出绿色荧光，本实例证明，pBT-iEGFP质粒能有效在感染的过程中指示活的细菌，排除胞内死的细菌，能成功鉴别感染的细菌是活菌还是死菌，具有重要的示踪活菌的价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>一种诱导表达绿色荧光蛋白广宿主质粒的构建及其在荧光示踪中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6538
<212> DNA
<213> pBT-iEGFP质粒全长序列
<400>
ACCTTCGGGAGCGCCTGAAGCCCGTTCTGGACGCCCTGGGGCCGTTGAATCGGGATATGCAGGCCAAGGCCGCCGCGATCATCAAGGCCGTGGGCGAAAAGCTGCTGACGGAACAGCGGGAAGTCCAGCGCCAGAAACAGGCCCAGCGCCAGCAGGAACGCGGGCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTTTTTATGCATGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTACGTTGGAGCCGCATTATTTTCGCTTTATGAATCTAAAGGGTGGTTAACTCGACATCTTGGTTACCGTGAAGTTACCATCACGGAAAAAGGTTATGCTGCTTTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCTAATCCGCATATGATCAATTCAAGGCCGAATAAGAAGGCTGGCTCTGCACCTTGGTGATCAAATAATTCGATAGCTTGTCGTAATAATGGCGGCATACTATCAGTAGTAGGTGTTTCCCTTTCTTCTTTAGCGACTTGATGCTCTTGATCTTCCAATACGCAACCTAAAGTAAAATGCCCCACAGCGCTGAGTGCATATAATGCATTCTCTAGTGAAAAACCTTGTTGGCATAAAAAGGCTAATTGATTTTCGAGAGTTTCATACTGTTTTTCTGTAGGCCGTGTACCTAAATGTACTTTTGCTCCATCGCGATGACTTAGTAAAGCACATCTAAAACTTTTAGCGTTATTACGTAAAAAATCTTGCCAGCTTTCCCCTTCTAAAGGGCAAAAGTGAGTATGGTGCCTATCTAACATCTCAATGGCTAAGGCGTCGAGCAAAGCCCGCTTATTTTTTACATGCCAATACAATGTAGGCTGCTCTACACCTAGCTTCTGGGCGAGTTTACGGGTTGTTAAACCTTCGATTCCGACCTCATTAAGCAGCTCTAATGCGCTGTTAATCACTTTACTTTTATCTAATCTAGACATCATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCGTTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAATCCATATGACTAGTAGATCCTCTAGAGTCGACTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCACCTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTCCCTATCAGTGATAGAGTATAATAGAGTCGAATTGTTAGCGGAGAAGAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAGATAGGTAATCTCTGCTTAAAAGCACAGAATCTAAGATCCCTGCCATTTGGCGGGGATTTTTTTATTTGTTTTCAGGAAATAAATAATCGATCGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGCCGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAGGCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGACGATATGATCATTTATTCTGCCTCCCAGAGCCTGATAAAAACGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGCGGCGAGGCGGCTACAGCCGATAGTCTGGAACAGCGCACTTACGGGTTGCTGCGCAACCCAAGTGCTACCGGCGCGGCAGCGTGACCCGTGTCGGCGGCTCCAACGGCTCGCCATCGTCCAGAAAACACGGCTCATCGGGCATCGGCAGGCGCTGCTGCCCGCGCCGTTCCCATTCCTCCGTTTCGGTCAAGGCTGGCAGGTCTGGTTCCATGCCCGGAATGCCGGGCTGGCTGGGCGGCTCCTCGCCGGGGCCGGTCGGTAGTTGCTGCTCGCCCGGATACAGGGTCGGGATGCGGCGCAGGTCGCCATGCCCCAACAGCGATTCGTCCTGGTCGTCGTGATCAACCACCACGGCGGCACTGAACACCGACAGGCGCAACTGGTCGCGGGGCTGGCCCCACGCCACGCGGTCATTGACCACGTAGGCCGACACGGTGCCGGGGCCGTTGAGCTTCACGACGGAGATCCAGCGCTCGGCCACCAAGTCCTTGACTGCGTATTGGACCGTCCGCAAAGAACGTCCGATGAGCTTGGAAAGTGTCTTCTGGCTGACCACCACGGCGTTCTGGTGGCCCATCTGCGCCACGAGGTGATGCAGCAGCATTGCCGCCGTGGGTTTCCTCGCAATAAGCCCGGCCCACGCCTCATGCGCTTTGCGTTCCGTTTGCACCCAGTGACCGGGCTTGTTCTTGGCTTGAATGCCGATTTCTCTGGACTGCGTGGCCATGCTTATCTCCATGCGGTAGGGTGCCGCACGGTTGCGGCACCATGCGCAATCAGCTGCAACTTTTCGGCAGCGCGACAACAATTATGCGTTGCGTAAAAGTGGCAGTCAATTACAGATTTTCTTTAACCTACGCAATGAGCTATTGCGGGGGGTGCCGCAATGAGCTGTTGCGTACCCCCCTTTTTTAAGTTGTTGATTTTTAAGTCTTTCGCATTTCGCCCTATATCTAGTTCTTTGGTGCCCAAAGAAGGGCA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<210> 2
<211>42
<212> DNA
<213> iEGFP-F
<400>
AGGGAACAAAAGCTGGGTACCCCGTTTCCATTTAGGTGGGTA
<210> 3
<211>37
<212> DNA
<213> iEGFP-R
<400>
CGCGGTGGCGGCCGCTCGATCGATTATTTATTTCCTG
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