阅读说明：本技术 冷冻干燥的抗体组 (Lyophilized antibody panel ) 是由 斯蒂芬·K·H·利 丹尼尔·马约尼斯 弗拉迪米尔·巴拉诺夫 奥尔加·奥尔纳茨基 贝迪卢·阿洛 于 2020-03-27 设计创作，主要内容包括：公开了用于使用元素分析进行研究的冷冻干燥的抗体组。所述抗体组包含分别用一种或多种同位素进行元素标签化或元素标记的多种抗体,从而每种不同的抗体与其他抗体是同位素可区分的。每种元素标签可以包含一种或多种独特的元素或独特的同位素组合。可以将元素标签化的抗体组混合冷冻干燥。因此,在通过元素分析仪,如质谱仪研究前,可以容易且有效地将冷冻干燥的元素标签化的抗体组再混悬并与样品混合。这种冷冻干燥的元素标签化的抗体组可以提供元素标签化测定的益处,同时还易于使用并长期保持稳定。(A freeze-dried antibody panel for studies using elemental analysis is disclosed. The antibody set comprises a plurality of antibodies that are each element-tagged or element-labeled with one or more isotopes, such that each different antibody is isotopically distinguishable from the other antibodies. Each elemental tag may comprise one or more unique elements or unique isotopic combinations. The element-tagged antibody panel can be mixed and lyophilized. Thus, a freeze-dried element-tagged antibody set can be easily and efficiently resuspended and mixed with a sample prior to study by an element analyzer, such as a mass spectrometer. Such a freeze-dried element-tagged antibody panel can provide the benefits of an element-tagged assay, while also being easy to use and stable over long periods of time.)

具体实施方式

本发明公开的某些方面和特征涉及用于使用元素分析研究的冷冻干燥的抗体组。抗体可以是其片段，如纳米抗体或Fab片段。此外，在本文所讨论的实施方式中，可以使用常规亲合试剂(不仅包括抗体，而且还包括其他亲合试剂，如凝集素、适体和非抗体蛋白-配体对，如抗生蛋白链菌素-生物素)代替抗体。

抗体组可以包括分别用一种或多种同位素元素标签化的或元素标记的多种不同抗体，从而每种不同抗体与其他抗体通过同位素可区分。每种元素标签可以包括一种或多种独特的元素、同位素或独特的同位素组合。可以将元素标签化的抗体组混合冷冻干燥。因此，在通过元素分析仪，如质谱仪研究前，可以容易且有效地将冷冻干燥的元素标签化的抗体组再混悬并与样品混合。这种冷冻干燥的元素标签化的抗体组可以提供元素标签化测定的益处，同时还易于使用并长期保持稳定。任何主题方法或试剂盒的元素标签可以是质量标签，如当检测方法是质谱和/或当元素标签包含富集的同位素时。相同的质量标签或重叠的质量标签是指具有相同同位素(或同位素质量)标记原子并且通过质谱难以区分的质量标签。

本发明公开的某些方面和特征还涉及用于使不同样品独特地条型码化，从而允许样品在通过元素分析仪研究前合并的技术。不同的样品条型码化试剂可以分别包括可用于将该样品条型码化试剂与其他样品条型码化试剂相区分的独特的同位素组合。多种样品可以单独与不同的样品条型码化试剂混合，从而允许样品条型码化试剂结合至样品中的靶标(例如，测定条型码化珠和/或细胞)，因此用其自身独特的条型码标记每种样品。即使在将样品混合在一起后，可以基于从元素分析仪中所收集的数据中独特的同位素组合的存在来提取每种样品的数据。在一些情况下，甚至可以在实施测定，如使用冷冻干燥的元素标签化的抗体组的测定之前将样品混合在一起。

元素分析是其中分析样品的元素组成并且有时同位素组成的方法。可以通过一些方法实现元素分析，其包括：光学原子光谱，如火焰原子吸收、石墨炉原子吸收和电感耦合等离子体原子发射，其探测原子的外部电子结构；质谱原子光谱，如感应耦合质谱，其探测原子质量；X-射线荧光、粒子感应的X-射线发射、X-射线光电子光谱和俄歇电子能谱，其探测原子的内部电子结构。可以使用其他元素分析技术。

可以基于操作人员或具体应用的需要选择用于在本发明中使用的质谱仪。质谱仪的实例类型包括四极杆、飞行时间、扇形磁场、高分辨率、单或多集电极质谱仪。通常，将飞行时间或扇形磁场质谱仪用于记录快速、瞬时事件，其中传输持续时间(transitdurations)预期来自颗粒(例如，珠、细胞或激光烧蚀羽流)。在某些方面，飞行时间质谱仪可以具有高通滤波器，如具有80amu或以上的质量截止值。在某些方面，原子化和电离源，如电感耦合等离子体(ICP)可以位于飞行时间或扇形磁场质量检测器的上游。

本发明公开的某些方面特别适合于与称为质量分析的一类元素分析一起使用，其中确定了同位素或元素的质量。质量分析可以包括原子量分析，如质谱流式细胞术。质量分析可以特别适合于识别元素的同位素，并因此将一种同位素与另一种不同的同位素相区分或将同位素的一种组合与同位素的另一种不同的组合相区分。因此，在适当情况下，对于本文所公开的本发明公开的所有方面，质量分析可以是元素分析所期望的形式。

元素分析仪是用于样品的原子组成定量的仪器。元素分析仪可以使用本文所描述的元素分析技术中的一种。元素分析仪可以具有用于检测或区分同位素的设定数目的通道。例如，质谱仪可以具有可用于检测不同同位素的一些质量通道。特定元素分析仪可用的通道数目可以是有限的。因此，出于特定目的(例如，标记冷冻干燥的抗体组的抗体或者使样品条型码化)，通道的任何亚组的使用可以使剩余的通道对于其他目的可用。例如，空的通道可以用于实施其他测定或其他条型码化。

在一些情况下，可以基于单个颗粒实施元素分析，这被称为颗粒元素分析。颗粒元素分析包括确定单个颗粒(例如，逐个细胞)的元素组成，如使用基于质谱仪的流式细胞仪。本发明公开的某些方面利用了基于逐个细胞的颗粒元素分析，这可以被称为细胞计数元素分析。在一些情况下，可以基于整体实施元素分析，这被称为整体元素分析或溶液元素分析。整体元素分析包括确定整个样品体积的元素组成。

元素分析可以用于研究样品，如生物样品。如果用已知的元素标签标记样品，则元素分析期间的元素标签的检测可以指示与元素标签有关的样品特征。

如本文所提及的，质谱流式细胞术是检测生物样品中的元素标签(质量标签)，如以单细胞分辨率同时检测多种可区分的质量标签的任何方法。质谱流式细胞术可以包括独立于细胞或除细胞之外的质量标签化珠的分析。任何主题试剂盒和方法可以包括或适合于质谱流式细胞术。质谱流式细胞术包括混悬液质谱流式细胞术和成像质谱流式细胞术(IMC)。

混悬液质谱流式细胞术包括通过质谱(例如，通过原子量光谱)分析混悬的元素标签化细胞和/或珠，并且描述于美国专利公开，包括US20050218319、US20150183895、US20150122991中，以上所有专利作为参考并入本文。

成像质谱流式细胞术包括元素标签化的生物样品，如组织切片或细胞涂片的任何成像质谱(例如，成像原子量光谱)。IMC可以通过激光辐射、离子束辐射、电子束辐射和/或电感耦合等离子体(ICP)中的一种或多种使细胞样品的质量标签原子化和电离。质谱流式细胞术可以同时从单个细胞检测不同的质量标签，如通过飞行时间(TOF)或扇形磁场质谱(MS)。质谱流式细胞术的实例包括其中细胞流入ICP-MS的混悬液质谱流式细胞术和其中(例如)通过激光烧蚀(LA-ICP-MS)或通过原离子束(例如，对于SIMS)对细胞样品(例如，组织切片)采样的成像质谱流式细胞术。基于激光的IMC描述于美国专利公开US20160131635、US20170148619、US20180306695和US20180306695，以上所有专利作为参考并入本文。在某些方面，当所述样品是用于通过IMC分析的细胞涂片时，如本文所描述的，可以处理细胞，如通过用冷冻干燥的组染色、样品条型码化和/或测定条型码化。类似地，可以单独或与细胞混合，通过IMC分析本文所描述的测定珠。

可以在元素分析之前对质量标签采样、原子化和电离。例如，可以通过辐射，如激光束、离子束或电子束对生物样品中的质量标签采样、原子化和/或电离。作为另外一种选择或者另外，可以通过等离子体，如电感耦合等离子体(ICP)使质量标签原子化和电离。在混悬液质谱流式细胞术中，包括质量标签的完整细胞可以流入ICP-MS，如ICP-TOF-MS。在成像质谱流式细胞术中，一种辐射形式可以除去(并且可选地电离和原子化)包括质量标签的固体生物样品，如组织样品的一部分(例如，像素、所关心的区域)。IMC的实例包括质量标签化的样品的LA-ICP-MS和SIMS-MS。在某些方面，离子光学可以消除除质量标签的同位素以外的离子。例如，离子光学可以除去较轻的离子(例如，C、N、O)、有机分子离子。在ICP应用中，离子光学可以除去气体，如Ar和/或Xe，如通过高通四极杆滤波器。在某些方面，IMC可以以细胞或亚细胞分辨率提供质量标签(例如，与质量标签结合的靶标)的图像。

与荧光免疫组织化学方法类似，质谱流式细胞术(包括成像质谱流式细胞术)的工作流程可以包括在用抗体和/或其他特异性结合伴侣染色之前的细胞(例如，组织)固定和/或透性化。与荧光方法相反，在质谱流式细胞术中，质量标签(例如，包含非细胞内源性重金属)通过特异性结合伴侣，如抗体与靶标分析物结合。成像质谱流式细胞术，如荧光显微镜学可以包括抗原修复步骤，其中将样品暴露于一定条件，如热以暴露用于通过生物分子结合的靶标分析物。通常在通过质谱检测质量标签之前，清洗掉未结合的生物分子。值得注意地，其他检测方法，如元素分析(例如，发射光谱或X射线分散光谱)也在主题专利申请的范围内。

值得注意地，相对于其他成像方法，抗原修复条件对于IMC可以是特别重要的，因为元素标签(例如，质量标签)可以在组织中产生比其他标签，如荧光团更多的空间位阻。然而，高严格性修复条件(如组织切片对高温的延长暴露)可以使样品变性，从而破坏要检测的表位。在某些方面，可以在试剂盒中提供金属加热块，如铝加热块，或者所述金属加热块可以用于加热用于抗原修复的组织切片。本发明人已发现这种块提供了均匀的热量分布并且允许对于受控的抗原修复进行适当快速的温度转变。照此，主题专利申请的方法或试剂盒，如对于任何成像质谱流式细胞术应用或另一种成像应用，如光学显微术。

用于质谱流式细胞术的其他试剂包括含金属生物传感器(例如，在如缺氧、蛋白质合成、细胞周期和/或细胞死亡的条件下沉积或结合的生物传感器)和/或基于化学性质结合至结构(例如，DNA、细胞膜、层)的含金属组织化学化合物。另外，质量标签(例如，主题专利申请的质量标签或其他质量标签)可以组合以提供独特的条型码，从而在与其他样品或实验条件混合前，标记特定样品或实验条件。

在IMC中，组织样品可以是切片，例如，可以使用具有1-10μm的范围内，如2-6μm之间的厚度的切片。在一些情况下，可以使用小于500nm、400nm、200nm、100nm或50nm厚的超薄切片，如从树脂-包埋的组织块切下的样品。制备这些切片的技术是IHC领域熟知的，例如，使用切片机，包括脱水步骤、固定、包埋、透性化、切片等。因此，可以化学固定组织，然后可以在所期望的平面制备切片。低温切片或激光捕获显微切片也可以用于制备组织样品。可以使样品透性化，例如，以允许试剂标记胞内靶标。即使在抗原修复(例如，通过加热)后，生物分子对分析物的接近可以是空间位阻的。照此，较小的生物分子和某些质量标签可以最好地使生物分子接近其靶标分析物。

成像质谱流式细胞术中的细胞分割可以允许利用自动细胞分类以及主要专利申请的其他方面。然而，不同的组织和细胞类型具有不同的表面标志物，这使得单一通用膜染色是困难的。

用于细胞分割(cell segmentation)的试剂盒可以包括包含不同细胞表面靶标的多种抗体的膜染色剂，其中所述抗体缀合至相同的质量标签。在某些方面，膜染色剂包含抗连接蛋白的抗体和抗非连接蛋白的抗体。

膜染色剂不包含对除质膜以外的区室内的靶标染色的抗体。膜染色剂可以结合至比膜染色剂的任何单个抗体更多的细胞类型的膜。所述多种抗体可以处于混合物中。

试剂盒还可以包括核染色剂和/或胞液染色剂，例如，为了更好地使个体识别细胞并指导沿膜的细胞分割。试剂盒还包含抗细胞表面靶标的抗体组，其中所述组的抗体缀合至不同的质量标签并且如本文所描述的，用于识别细胞群体(例如，通过群体的自动分类)。

在某些方面，可以在其他抗体组之前、同时或之后应用膜染色剂。可以对通过成像质谱流式细胞术获得的图象实施细胞分割。分割方法在本领域中是已知的并且，例如，由Wang等人描述于"Cell Segmentation for Image Cytometry:Advances,Insufficiencies,and Challenges."Cytometry.Part A(2019):708-711中。通常，细胞分割受益于细胞膜和细胞内部(例如，通过核染色剂显像的细胞核)的清楚标记。

有关蛋白定位的信息集中在人类蛋白质图谱(Human Protein Atlas)中，它是可搜索的以识别在不同组织和细胞类型间特异性定位至质膜(例如，细胞连接)的蛋白靶标。因此可以识别蛋白靶标的补充组，其识别一些组织内和一些组织间的细胞膜，并且可以用相同元素标签使那些靶标的蛋白标签化以提供主题专利申请的膜染色剂。膜染色剂可以包括特异性结合至突触融合蛋白4、溶质载体家族16成员1、红细胞膜蛋白带4.1样蛋白3、接头相关蛋白质复合物2mu 1亚基、G蛋白亚基β2、膜突蛋白、EZR、CTNNB1、ATP酶Na+/K+转运亚基β3、磷脂酰乙醇胺结合蛋白1、联蛋白β1、联蛋白β1、溶质载体家族1成员5、埃兹蛋白(Ezrin)、S100、钙结合蛋白A4和锚蛋白3的1、2、3、4或更多种抗体，据报道它们也表达在不同细胞系之间保守的膜蛋白。作为另外一种选择或者另外，膜染色剂可以包括特异性结合至CDH17、CTNNA1、DNAJC18、GJB6、TJP3和C4of19的1、2、3、4或更多种抗体，据报道它们也表达在不同细胞系和/或组织之间保守的细胞连接蛋白。

为了检测RNA，可以制备如本文所讨论的生物样品中的细胞，从而使用本文所述的方法和装置分析RNA和蛋白质含量。在某些方面，在杂交步骤之前固定和透性化细胞。可以作为固定和/或透性化提供细胞。可以通过交联固定剂，如甲醛、戊二醛固定细胞。作为另外一种选择或者另外，可以使用沉淀固定剂，如乙醇、甲醇或丙酮固定细胞。可以通过去污剂，如聚乙二醇(例如，Triton X-100)、聚环氧乙烷(20)单月桂酸山梨聚糖酯(吐温-20)、皂苷(一组两亲性糖苷)或化学品，如甲醇或丙酮使细胞透性化。在某些情况下，可以使用相同的试剂或试剂组进行固定和透性化。Jamur等人在"Permeabilization of Cell Membranes"(Methods Mol.Biol.,2010)中讨论了固定和透性化技术。

生物样品可以包括具有需要分析的生物特性的任何样品。例如，样品可以包括动物、植物、真菌或细菌的生物分子、组织、流体和细胞。它们还可以包括病毒来源的分子。典型的样品包括(但不限于)痰液、血液、血细胞(例如，白细胞)、组织或细针吸活组织检查样品、尿液、腹膜液和胸膜液，或者来源于它们的细胞。生物样品还可以包括组织切片，如采集用于组织学目的冷冻切片。生物样品的另一种典型来源为病毒和动物、植物、细菌、真菌的细胞培养物，其中可以操纵基因表达状态以探索基因间的关系。在一些情况下，可以研究其他样品，如人工样品。当研究人来源的样品时，本发明公开的某些方面是特别有用的，并且当研究人外周血的样品时，特别有用。

可以用元素标签使样品标签化或标记样品以帮助通过经元素分析的研究确定有用信息。元素标签是可以通过元素分析检测的可检测同位素(例如，元素或元素的同位素)。在一些情况下，元素标签可以仅包括可检测同位素本身，尽管不需要始终是这种情况。在一些情况下，元素标签可以包括一种或多种同位素与之偶联的底物或者其中另外含有一种或多种同位素的底物。以这种方式，为了产生元素标签化的部分，可以独立于偶联至部分的底物(例如，在此之前，同时或之后)，将可检测同位素偶联至底物。例如，元素标签可以包括含有包含可检测同位素的多个侧基(例如，含金属螯合基团)的聚合物链，聚合物链能够结合至部分以使该部分元素标签化。在另一个实例中，元素标签可以包括珠或纳米颗粒，所述珠或纳米颗粒可以在其中或在其表面上包含一种或多种可检测同位素，所述珠或纳米颗粒能够结合至部分以使该部分元素标签化。如本文所使用的，位于珠或纳米颗粒表面上的同位素或同位素组成包括通过表面上的聚合物包埋或结合至表面(例如，共价结合或其他方式)的同位素或同位素组成。在一些情况下，珠或纳米颗粒可以包括可选地通过二氧化硅壳体包封的固体金属核心或包埋和/或螯合金属的聚合物核心和聚合物表面(例如，使用聚-L-赖氨酸、PEG(聚乙二醇)、PEG MEA(甲醚丙烯酸脂)、PVMS(甲基乙烯基聚硅氧烷)、聚多巴胺、聚苯乙烯和/或其他适合的聚合物)。在某些方面，聚合物(例如，和/或其单体前体)可以是疏水性的，例如，可以包括丙烯酸、酰胺和亚酰胺、碳酸酯、二烯、酯、醚、氟烃、烯烃和/或芳基，例如酚基，如儿茶酚。聚合物还可以提供反应基团，如胺和/或硫醇反应基团。例如，所述反应基团可以是反应性官能团(例如，硫醇、胺、硫醇反应性的、胺反应性的或者点击化学官能团)，如通过聚合形成的苯醌。聚合物可以形成薄膜，如单层膜。

主题专利申请的珠可以是适合于生物分子附接的元素编码的颗粒，从而使得能够进行大规模多路生物分析方法。例如，可以根据美国专利公开20100144056的一个或多个方面制备聚合物珠，该专利作为参考并入并在下文中进行了总结。

在一种方法中，合成了含有嵌入内部的金属离子或原子的聚合物颗粒。所述颗粒的聚合物基质可以用于包封金属离子，但是同时提供了在水媒介物中的胶体稳定性。所述颗粒的聚合物基质使金属离子与水相的直接接触最小，并且所述颗粒表面的官能团对于将抗体或其他生物分子附接至所述颗粒可用。这些官能团还可以用于附接生物分子可以与之附接的接头臂或间隔臂基团。所关心的聚合物颗粒具有约几nm至约20μm的范围内的直径，其中最关心的那些具有约50nm至约500nm的直径。

可以合成含有嵌入内部的金属离子或原子的聚合物颗粒。颗粒的聚合物基质可以用于包封金属离子，但是同时提供了在水媒介物中的胶体稳定性。在某些方面，可以使用螯合镧系(或其他金属)离子。

颗粒的聚合物基质使金属离子与水相的直接接触最小，并且颗粒表面的官能团可以对于将抗体或其他生物分子附接至颗粒可用。这些官能团还可以用于附接生物分子可以与之附接的接头臂或间隔臂基团。作为另外一种选择，如本文所讨论的，可以在珠表面上合成具有不同结构的聚合物膜并允许生物分子附接。在某些方面，珠是如本文所描述的测定条型码化珠。珠的内部可以包含测定条型码，如金属同位素的可区分的组合。珠的内部可以是任何多种适合的结构，如固体金属核心、金属螯合聚合物内部、纳米复合材料内部或杂化材料(hybrid)内部。固体金属核心可以通过使一种或多种金属元素和/或同位素的混合物(例如，溶液)经受高热和/或高压来形成。纳米复合材料结构可以包含纳米颗粒/纳米结构的组合(例如，基质)(例如，分别包含不同的物理性质并且促进一种或多种测定条型码元素/同位素和/或为包含测定条型码元素/同位素的其他纳米颗粒提供支架)。珠的内部可以包含包埋测定条型码金属和/或螯合测定条型码金属的聚合物(例如，通过侧基，如DOTA、DTPA或其衍生物)。适合的聚合物骨架可以是支链的(例如，超支化的)或者形成基质。在一些方面，可以在乳液中形成聚合物。聚合物可以包含苯乙烯、丙烯酸脂及其任何衍生物或者本领域中已知的其他聚合物的亚基。在某些方面，测定珠内部可以存在在附接至测定生物分子(例如，寡核苷酸或抗体)之前，需要官能化(例如，通过在整个表面上的聚合反应)的惰性表面(例如，如固体金属表面)。已将元素标签提供给质谱流式细胞术以用于缀合至或预缀合至特异性结合靶标分析物的生物分子，例如，亲合试剂，如抗体(例如，抗体或其衍生物，如抗体Fab片段)。用于缀合的元素标签可以包含预加载了金属的聚合物，或者用于加载到聚合物上的单独的金属溶液(例如，在缀合至生物分子之前)。聚合物可以包含主链和多种金属结合侧基，如包含螯合剂的侧基(例如，DTPA、DOTA或其衍生物)。缀合至生物分子，如抗体的元素标签可以预加载有金属。在某些方面，金属是富集的同位素，如镧系同位素。镧系是化学类似的，并且已发现镧系元素标签(包括缀合至抗体的那些)在适合于质谱流式细胞术的程度上在溶液中稳定。然而，非镧系金属可以不具有类似的稳定性。在某些方面，金属元素或其同位素可以在镧系家族以外，如非镧系过渡金属或后过渡金属。适合于质谱流式细胞术的后过渡金属包括原子序数48-50(如镉、铟和/或锡)和80-84的元素。可以通过冷冻干燥改善加载了后过渡金属(post-transition metal)的聚合物的稳定性。主题方法和试剂盒包括如本文所描述的冷冻干燥的这些非镧系元素标签，只要与其他元素标签分开或与其他元素标签化的生物分子混合。中重元素(Medium weight elements)(例如，或者它们的同位素)可以通过质谱流式细胞术提供较弱的信号，如当所述元素在从ICP和/或有机分子元素中除去氩二聚体的高通滤波器附近(例如，距它30、20或10amu以内)。这些中重元素或同位素可以具有39至52之间的原子序数。此外，非镧系元素，如某些过渡金属和后过渡金属可以不被螯合，如对于聚合物上的侧基易于实现的。照此，本文所描述的非镧系金属(例如，其同位素)可以对于细胞条型码化是有用的，例如，用元素标签化的CD 45的活细胞条型码化。例如，活细胞条型码可以包括冷冻干燥的镉同位素标签化的CD45。

测定珠表面可以包含聚合物、接头以将测定生物分子与表面间隔开和/或增加胶体稳定性(例如，PEG接头)、用于附接(或附接至)测定生物分子和/或样品条型码的官能团。

可以用多种不同的同位素或独特的同位素组合产生元素标签。独特的元素标签可以具有不同的(例如，通过元素分析可区分的)元素、同位素或同位素的组合。例如，在一组元素标签中，如果通过质量(例如，通过其一种或多种同位素的组成可区分)与该组的其他元素标签可区分，则元素标签可以是独特的。出于清楚的目的，在整个说明书中提及了元素标签或独特的元素标签，然而将理解本发明公开的某些方面利用了独特的元素标签的多个拷贝。元素标签可以包括一种或多种同位素，如单一元素的一种或多种同位素(例如，¹⁴²Nd和¹⁴³Nd)或者多种元素的一种或多种同位素(例如，¹⁴²Nd和¹⁴¹Pr)。在某些方面，元素标签可以包括原子量在80amu以上的金属原子。该金属可以选自贵金属、镧系、过渡金属和/或后过渡金属。元素标签可以包含聚合物。例如，聚合物可以将金属(例如，镧系)螯合至聚合物骨架上的金属结合侧基(如DOTA或DTPA)，或者可以将金属(例如，碲)掺入聚合物本身的碳主链中，或者可以用于围绕(包埋)金属。元素标签可以包括金属纳米颗粒，如金属纳米晶体(例如，在其表面上官能化以结合亲合试剂)。元素标签的金属可以是同位素纯的。所述元素标签可以结合和官能化以结合生物分子(例如，亲合试剂，如抗体)。

每种元素标签可以包括通过元素分析可检测的一种或多种可辨别的同位素以确定所述元素标签的存在。由于不同的元素标签可以具有独特的同位素或同位素组合，因此元素分析可以用于基于其独特的同位素特征(signature)来识别所述元素标签。可以选择可辨别的同位素以帮助使用元素分析的检测。例如，可以将可辨别的同位素选择为样品内源同位素的预期范围以外的同位素或者由于特定元素分析技术所引入的同位素。例如，生物样品通常将不固有地包括大于80amu的金属，并因此用于与这些样品一起使用的元素标签可以包括大于80amu的金属。在另一个实例中，某些类型的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)利用氩，并因此用于通过ICP-MS的分析的元素标签可以利用质量大于氩的元素，如大于80amu的金属。可以使用滤波技术来排除作为正在使用的元素标签中的可辨别的元素所选择的那些的范围以外的元素，因此自动排除了样品内源的元素和元素分析期间引入的元素(如果有的话)。例如，在ICP-MS中，可以应用四级杆滤波器以排除质量小于80amu的离子，因此使检测器不被不关心的离子(例如，不可能是可检测的同位素的离子)覆没(overwhelm)。

当提及给定元素标签的同位素的组合时，可以在元素标签的每种实例或者在混合在一起的元素标签的不同实例存在该组合。

元素标签化的部分是包括元素标签的化学部分。可以使用任何适合的部分，尽管在本发明公开的某些方面，使用了具有靶向功能的部分。靶向功能是结合至靶标的能力(例如，靶标蛋白或分子)。如本文所使用的，对结合靶标的部分的提及将理解为能够结合至靶标的部分，无论是否已发生真实的结合。可以通过特异性结合(例如，如在对于特定抗原特异的抗体中)、共价键、杂交(例如，核酸的杂交)或者其他适合的键合机制发生靶向功能。含金属部分可以是用金属标签化的元素标签化的部分。适合的含金属部分的实例包括含金属小分子或药物(例如，顺铂)、组织化学染色(例如，钌红、三色染色或四氧化锇)、金属标签化的寡核苷酸和金属标签化的抗体。在一些情况下，元素标签化的部分可以是生物分子，尽管不需要始终是这种情况。生物分子可以是任何生物分子，如亲合试剂(例如，抗体、适体)、核酸(例如，杂交至靶标的核酸)、凝集素、糖或其他这种分子。

如本文所使用的，术语亲合试剂可以表示已知与各个靶标分子(例如，肽、抗原或小分子)形成高特异性非共价键的生物分子(例如，抗体、适体、凝集素或序列特异性结合肽)。用独特的元素标签标记的亲合试剂是用独特且与相同样品中大量其他元素标签可区分的元素标签标记的亲合试剂。当缀合至元素标签时，可以将亲合试剂认为是元素标签化的部分。尽管本文中的一些实施方式和实施例列举了抗体，但是在任何这些实施方式中可以使用亲合试剂(例如，抗体或非抗体亲合试剂)代替抗体。

元素标签化的部分可以包括或结合至元素标签。在一些情况下，元素标签化的部分可以包括元素标签，如在含有铂作为元素标签的顺铂的情况下。在一些情况下，元素标签化的部分可以结合至元素标签，如结合至元素标签的抗体，所述元素标签包含具有可区分的同位素(例如，金属)与之结合的金属-螯合基团的聚合物支架。聚合物支架的使用可以允许多个同位素结合至单一元素标签化的部分。因此，聚合物支架可以通过包括可区分的同位素的更多拷贝来提供更强的元素信号。在一些情况下，聚合物支架可以通过具有沿聚合物支架在不同位置所含有的不同的同位素用于帮助提供可区分的同位素组合。这种聚合物支架可以含有附接至聚合物的不止一种亚基的一些金属-螯合配体。能够结合聚合物中的至少一个金属原子的金属-螯合基团的数目可以在约1至10,000之间，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或500-1,000。至少一个金属原子可以结合至至少一个金属-螯合基团。聚合物可以具有约1至10,000之间，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或500-1,000的聚合度。因此，基于聚合物的元素标签可以包含约1至10,000，如5-100、10-250、250-5,000、500-2,500或500-1,000个标记原子。

在一些情况下，元素标签可以使用选自下列的聚合物：线性聚合物、共聚物、支化聚合物、接枝共聚物、嵌段聚合物、星形聚合物和超支化聚合物。聚合物的主链可以衍生自取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺并且可以是丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸脂、甲基丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的均聚物或共聚物的取代衍生物。可以从可逆加成断裂聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)和阴离子聚合合成聚合物。提供聚合物的步骤可以包括聚合物从选自下列的化合物的合成：N-烷基丙烯酰胺、N,N-二烷基丙烯酰胺、N-芳基丙烯酰胺、N-烷基甲基丙烯酰胺、N,N-二烷基甲基丙烯酰胺、N-芳基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸脂及其功能等价物。聚合物可以是水溶性的。该部分不受限于化学含量。然而，如果骨架具有相对可重复的尺寸(例如，长度、标签原子个数、可重复的树枝状聚合物性质等)，则它简化了分析。还考虑了对于稳定性、溶解度和无毒性的要求。因此，通过沿主链放置多个官能团加上不同的反应基团(连接基团)的合成策略(其可以用于通过接头和可选地间隔臂将聚合物附接至分子(例如，亲合试剂))，进行了功能性水溶性聚合物的制备和表征。通过控制聚合反应，聚合物的尺寸是可控制的。通常，将选择聚合物的尺寸，从而使得聚合物的回旋辐射尽可能小，如在2至11纳米之间。结合至元素标签的部分的长度可以在约10纳米的数量级，并因此相对于元素标签与之结合的部分的尺寸，过大的聚合物标签可能空间阻碍该部分的靶向功能。

在一些情况下，能够结合至少一个金属原子的金属-螯合基团可以包含至少4个乙酸基团。例如，金属螯合基团可以是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)基团；1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)基团；或者DTPA或DOTA衍生物基团。替代基团包括乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。金属-螯合基团可以通过酯或通过酰胺附接至聚合物支架。适合的金属螯合聚合物的实例包括得自FluidigmCanada,Inc.的X8和DM3聚合物。

可以用通过元素分析可辨别的元素标签来标记元素标签化的部分。可以选择元素标签化的部分以结合至或偶联至期望通过元素标记物标记，然后通过元素分析检测的任何适合的结构(例如，靶标)。例如，适合的元素标签化的部分可以包括用于杂交的寡核苷酸探针，细胞状态探针(例如，作为存活力标志物的顺铂或者作为缺氧或合成标志物的有机碲)或者其他适合的分子。

在本发明公开的某些方面，将元素标签化的抗体用作元素标签化的部分。抗体可以对特定细胞类型特异。细胞类型(例如，细胞群体)可以表示细胞群体或细胞群体的特定亚组。对细胞类型特异的抗体可以具有能够结合至在该特定细胞类型中或上所存在的分子或抗原(例如，抗原表位)的抗原结合位点(例如，互补位)。在一些情况下，抗体可以对外周血上或内的靶标特异，如外周血单核细胞(PBMC)的表面靶标或胞内靶标。

本发明公开的某些方面将组分描述为处于混合物(mixture或admixture)中。如本文所使用的，术语混合物(mixture或admixture)包括结合在一起的组分(例如，物理上一起位于相同容器或外壳中)。容器或外壳包括与另一空间体积可分开的任何适合的空间体积。容器或外壳可以是密封的，如气密的。适合的容器或外壳的实例包括管(例如，试管)、盒、小袋、多孔板的孔或其他这类容器。

在一些情况下，本发明公开的多个方面可以利用校准材料来帮助校准元素分析仪。校准材料可以是对于向元素分析仪提供校准可用的任何适合的金属或含金属材料。在一些情况下，校准材料可以是含金属的珠，其具有来自在一定元素质量范围内的不同元素的不同同位素的混合物。校准材料可以含有已知量的一种或多种已知的同位素。

本发明公开的某些方面利用元素标签化的抗体以使得能够使用元素分析，如质谱流式细胞术进行生物样品的高度多路的单细胞分析。这些技术可以使得能够分离单一组中的多种标志物，而无需补偿。在一些情况下，可以分离单一组中的大于30种标志物。

通过质谱流式细胞术实现的大量检测通道(例如，大于20但小于60)提供了利用组合测定的机会。例如，可以通过生物分子(例如，抗体)的共有亚组将抗体组彼此相关并且对于组间不同的抗体使用相同的质量标签来增加通常等于通道数目的所检测的靶标数目。例如，在给定细胞样品(例如，数据集)中所检测的靶标数目可以至少是所使用的检测通道的1.2、1.5或2倍。

可以用共有组对细胞染色，从而在不同组中所识别的细胞群体可以彼此相关，但前提是剩下质量标签通道以用于在各个等份的不同组中使用。由于组对于不同抗体使用了一些质量标签(以检测不同的靶标)，因此可以将样品条型码作为识别哪些质量标签与哪些抗体相关的“组条型码”应用于等份中的细胞。作为另外一种选择，“主(master)”共有组可以染色样品的一部分(等份)的细胞并用于将通过其他组所识别的群体彼此相关(并且对于这种相关是必需的)。主共有组可以具有不同或仅部分重叠的抗体亚组，所述抗体亚组是分别染色不同的细胞等份的多个差异组中的每一个所共有的。可以存在2个或以上，3个或以上，4个或以上，5个或以上或者10个或以上与共有组共有抗体的差异组。差异组可以具有比共有(in common)的抗体多的与另一个差异组共有的质量标签。

工作流程将包括将单一样品(例如，人PBMC)分成不同等份，并用不同的细胞类型特异的组对每个等份染色。基于组，相同的质量通道亚组将用于不同的细胞类型特异性标志物(例如，T细胞组可能不具有任何或一些B细胞组中的B细胞标志物，并且反之亦然)。Amazon-型软件解决方案将识别通过不同的组染色的细胞，并且可以将它们组合到相同的数据集中。

通过组的细胞的条形码化可以允许软件自动识别对每种细胞染色的组。主题专利申请的方面包括该软件，其包括还实施在本发明申请中所描述的其他自动分析的软件。

识别所有基本细胞类型的标志物的共有的亚组可以是其自己的组或者是所有组的亚组。这可以用于识别主要细胞类型中的每一种的相对丰度，然后与细胞类型特异性组进行组合使用以识别整个组中的特异性细胞类型(群体)的相对丰度。

软件解决方案可以排除所述组中不具有所关注的细胞类型的细胞事件，从而使每种细胞事件对于所关心的靶标染色。例如，可以除去T细胞组中的任何B细胞事件。如以上重点中所描述的，这可以在计算主要细胞类型的相对丰度之后完成。一种或多种差异组可以具有研究标志物。可以在整个组中共有这些中的一些或全部。对于用户可以存在一个或多个不用的通道以检测其自身所关心的靶标。

在某些方面，元素分析方法包括：将样品细胞分成多个部分；用质量标签化的抗体的共有组染色细胞；用差异组的质量标签化生物分子对各个部分的细胞染色，其中各个差异组包含不在其他差异组中，但是用存在于其他差异组中的质量标签进行标签化的生物分子；和/或使用元素分析研究所述样品以检测各个细胞上不同的质量标签的存在。共有组可以在两个或更多个部分，如3个或以上，4个或以上或者5个或以上的部分中是保守的。共有组可以检测区分亲代群体(parent population)的阳性表达的表面靶标，其中所述亲代群体一起覆盖了大部分免疫细胞。一个或多个(例如，2个或以上，3个或以上或者4个或以上)各个差异组分别检测区分亲代群体之一内的亚群，但是不区分大部分免疫细胞的亚群的阳性标志物。

共有组可以不染色所有部分(例如，可以仅染色一个部分)，并且共有组包含与两种或更多种差异组的抗体相同的抗体的不同亚组。

各个差异组可以是提供共有组所识别的亲代群体内的亚群，其中亲代群体选自包括或由下列组成的群体：T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、CD8 T细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞和/或单核细胞/巨噬细胞。作为另外一种选择或另外，差异组可以识别细胞功能，例如，当所述差异组检测参与胞内信号转导、细胞因子产生和/或细胞周期的靶标时。

在某些方面，除差异组中的抗体以外或者作为所述抗体的替代使用了寡核苷酸，例如，当所述寡核苷酸直接或间接特异性杂交至靶标RNA时。例如，寡核苷酸可以杂交至编码如本文所描述的细胞因子的RNA。

其中用差异组染色包括通过用寡核苷酸标签化的抗体染色各个部分并将质量标签化的寡核苷酸直接或间接杂交至抗体标签化的寡核苷酸的信号放大。

如本文中对组所描述的，可以将一种或多种共有组和差异组冷冻干燥。

在分成部分之前用共有组染色细胞，或者在用共有组染色之前划分细胞(例如，其中共有组与每种差异组混合)。方法还可以包括用识别差异组(并因此识别与所述组的质量标签有关的靶标)的组条型码标记划分的细胞，例如，其中在添加至所述划分的细胞之前，与它的差异组混合来提供所述组条型码。在用组条型码标记之后并且在研究之前合并部分。可以以与图13中所示的样品条型码类似的方式应用组条型码，或者可以除样品条型码以外施用所述组条型码。

可以在研究前，对一种或多种其他样品(其本身对于单独的染色分成等份)实施上述方法，用不同的样品条型码标记样品并将条形码化的样品合并。在分成部分前，可以将条型码化的样品合并。

方法还可以包括基于共有组及其差异组，将单个研究的细胞分类成细胞群体。例如，共有组可以识别T细胞亲代群体，但是用于所述部分之一的不同的T细胞组可以识别该亲代群体内的亚群。在本发明申请中讨论了适合于这些方法的其他群体和组。

可以通过对共有组和差异组(例如，对类似的样品，如包括PBMC的样品)训练的自动化软件分类。可以通过设门，通过在高维空间中运行的训练的聚类算法(其中维度与用于分类的表面标志物的数目有关)或者通过神经网络进行分类。

可以将差异组用于识别通过共有组所识别的亲代群体的亚群。方法还可以包括将基于不同的不同组(different distinct panels)所识别的所研究的细胞群体整合到基于共有组的相同的数据集中。整合可以包括：弃去识别为共有组不能识别其亚群的亲代群体的细胞的数据；识别通过各个部分的不同组所识别的亚群中的原始样品中的细胞的比例；和/或对于通过共有组所检测的相同亲代群体，显示通过不同的不同组所检测的靶标的表达。

方法还可以包括在染色前，在不同条件下刺激不同样品或样品部分的细胞。

试剂盒可以包括包装用于任何上述方法的共有组和差别组。共有组和差别组可以包装在如以上方法所描述的试剂盒中。

在某些方面，用于元素分析(例如，质谱分析)的试剂盒可以包括包含多种缀合抗体的共有组。共有组可以包括多种缀合至不同质量标签的抗体，其中每种不同的质量标签是基于其同位素组成可区分的。多种抗体可以处于混合物中。多种差别组可以包括质量标签化生物分子(例如，抗体和/或寡核苷酸)，其中各个差别组包括在一个或多个其他组中不存在，但是用存在于所述一个或多个其他组中的质量标签进行标签化的生物分子。

本发明公开的某些方面使得抗体组能够冷冻干燥以实现具有高稳定性的组。可以就使用冷冻干燥的抗体组所测定的样品的元素标签同位素的离子计数相对于使用非冷冻干燥的抗体组所测定的相同样品的比较来描述冷冻干燥的抗体组的稳定性。冷冻干燥的抗体组相对于非冷冻干燥的抗体组的更高的稳定性可以视为来自冷冻干燥的抗体组的元素标签的离子计数比来自非冷冻干燥的抗体组的元素标签的离子计数更高。此外，可以将稳定性描述为抗体破坏(例如，影响抗体结合活性的破坏)的函数和/或元素标签和/或元素标签化的部分上可区分的同位素的金属原子的金属保留的函数。例如，稳定的组将显示出很少至无影响抗体结合活性的破坏和/或很少至无来自元素标签和/或元素标签化的部分的金属原子的损失。本文所描述的冷冻干燥的组显示出比具有相同组成的非冷冻干燥的组更好的稳定性。

已为质谱流式细胞术提供了元素标签以用于缀合至或预缀合至抗体生物分子。用于缀合的元素标签可以包含预加载了金属的聚合物，或者用于加载到聚合物上的单独的金属溶液(例如，在缀合至生物分子之前)。聚合物可以包含主链和多种金属结合侧基，如包含螯合剂的侧基(例如，DTPA、DOTA或其衍生物)。缀合至生物分子，如抗体的元素标签可以预加载有金属。在某些方面，金属是富集的同位素，如镧系同位素。镧系是化学类似的，并且已发现镧系元素标签(包括缀合至抗体的那些)在适合于质谱流式细胞术的程度上在溶液中稳定。然而，非镧系金属可以不具有类似的稳定性。在某些方面，金属元素或其同位素可以在镧系家族以外，如非镧系过渡金属或后过渡金属。适合于质谱流式细胞术的后过渡金属包括原子序数48-50(如镉、铟和/或锡)和80-84的元素。可以通过冷冻干燥改善加载了后过渡金属的聚合物的稳定性。主题方法和试剂盒包括如本文所描述的冷冻干燥的这些非镧系元素标签，只要与其他元素标签分开或与其他元素标签化的生物分子混合。

中重元素(Medium weight elements)(例如，或者它们的同位素)可以通过质谱流式细胞术提供较弱的信号，如当元素在从ICP和/或有机分子元素中除去氩二聚体的高通滤波器附近(例如，距它30、20或10amu以内)。这些中重元素或同位素可以具有39至52之间的原子序数。此外，非镧系元素，如某些过渡金属和后过渡金属可以不被螯合，如对于聚合物上的侧基易于实现的。照此，本文所描述的非镧系金属(例如，其同位素)可以对于细胞条型码化是有用的，例如，用元素标签化的CD 45的活细胞条型码化。例如，活细胞条型码可以包括冷冻干燥的镉同位素标签化的CD45。

通常，产生并获得大的多路组可以包括抗体滴度的优化、完整的组验证、样品制备和分析。从多个单个管(例如，30个不同的管)中制备染色混合物是繁重的并且可能倾向于出现误差。另外，特别是当基于金属标签化的抗体时，预制备的染色混合物可能倾向于随时间破坏并且可能显示出不良的稳定性。例如，含有多种抗体的非冷冻干燥的金属标签化的抗体组可以保持约1周或以下的稳定，然而本发明公开的某些方面涉及可以保持约1年或以上稳定的类似的冷冻干燥的抗体组。因此，冷冻干燥的抗体组可以帮助抗体组大规模产生和分布，同时允许长期储存抗体组，从而改善了利用相同组的后续测定中的一致性。

可以通过自动样品制备系统至少部分进行根据主题方法的样品制备。该系统可以在染色前处理样品，可以将样品与一种或多种抗体组、测定珠和/或条型码接触，可以实施离心和清洗步骤和/或可以将样品递送至质谱流式细胞系统。

因此，本发明公开的某些方面涉及包含在单一外壳(例如，单一管)中的冷冻干燥的多路(例如，30-路)免疫分型组，其可以与有效的工作流程和自动化软件解决方案一起用于使用质谱流式细胞术的人全血分析。在一些情况下，所述组可以集中在T细胞谱系中，同时还捕获其他相关免疫群体。可以将血液直接添加至冷冻干燥的抗体管中，随后是红细胞(RBC)裂解，清洗和固定步骤，并最后在元素分析仪(例如，ICP-MS系统)上进行染色样品的数据采集。

软件工具可以接收元素分析仪的数据并自动产生有关多种细胞计数信息的报告，如活细胞数目、特异性细胞群体的百分比、染色强度、柱状图、2D点图和t分布随机邻域嵌入(tSNE)图。软件可以自动计算与手动设门相当的群体频率。自动化软件可以消除可能在手动分析(例如，手动设门)期间发生的用户偏差并且显著减少分析每个数据文件所需的时间量。所述组和软件工具可以使研究人员能够流水线进行全血的免疫分型，同时准确且可重复地监测患者样品中免疫细胞亚型的变化。在一些情况下，可以向软件工具自动加载适合的元素标签以使得能够快速将元素分析仪数据解码为有用的结果。

抗体及其他元素标签化的部分可以用于识别样品中细胞靶标的存在。抗体或元素标签化的部分可以具有用于细胞靶标的靶向功能，并因此在清洗样品后与样品保持在一起。因此，与抗体或元素标签化的部分上的特定元素标签有关的不同的同位素或同位素组合的任何检测指示了该细胞靶标的存在。细胞靶标可以是表面靶标或胞内靶标。胞内靶标的实例可以包括细胞周期和增殖靶标、胞内信号转导靶标和胞内细胞因子靶标。由于使细胞透性化有时可以破坏细胞表面标志物，因此可以在透性化之前用与表面靶标有关的抗体或元素标签化的部分对样品染色。然而，由于细胞的透性化有时是正确触及胞内靶标所必需的，因此在透性化之后用与胞内靶标有关的抗体或元素标签化的部分染色样品。

在一些情况下，可以使用嵌入剂(intercalator)。在一些情况下，嵌入剂可以是元素标签化的部分。嵌入剂可以包含元素标签的元素或与之偶联。例如，铱可以用作嵌入剂并且可以同时起到其自身元素标签的作用。因此，研究期间铱的检测指示了嵌入剂的存在。其他适合的嵌入剂包括铑和顺铂。嵌入剂可以包含在冷冻干燥的组中或者与冷冻干燥的组分开提供。如果在透性化之前将嵌入剂与样品细胞混合，则嵌入剂可以是细胞存活力染色剂，其指示了细胞是否是活细胞。在这些情况下，在研究期间嵌入剂所检测的存在指示了死细胞。然而，如果在透性化之后将嵌入剂与样品细胞混合，则嵌入剂可以起到细胞鉴定染色剂或细胞存在染色剂的作用，其可以指示细胞的存在，因为嵌入剂应进入所有透性化细胞。在这些情况下，在研究期间嵌入剂所检测的存在指示了正在通过元素分析仪分析的细胞。在一些情况下，可以与冷冻干燥的抗体组一起或混合包含嵌入剂，如铑。

选择用于在冷冻干燥的组中使用的抗体可以选择以实施某些测定。在一些情况下，可以产生冷冻干燥的组或冷冻干燥的组的亚组以用于多种测定，因此有助于通过简单选择适当的组或组的亚组的组合来进行所期望的测定。本文描述了用于与本发明公开的某些方面一起使用的多种组或组的亚组。相对于可能的抗体列表所描述的每个组或组的亚组可以包括来自该列表的两种或更多种抗体或者来自该列表的任何数目的抗体，多至并且包括来自该列表的所有抗体。如本文所使用的，组的亚组可以包括来自本文所描述的组的抗体的任意组合。在一些情况下，组的亚组可以与不同的组或组的亚组合并以产生一个或多个本文所描述的组。

在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自以下列表的两种或更多种抗体，列表包括：Cd45、CD45RA、CD45RO、Cd123、CD4、CD8a、CD11C、CD57、CXCR3、CD185、CD38、CD56、CD3、CD20、CD66b、HLA-DR、IgD、CD27、CD28、CD127、CD19、CD16、CD161、CD194、CD25、CD294、CD197、CD14、CCR6和TCRδγ。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包括来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种抗体。如本文所公开的，本发明公开的某些方面对于将多种不同的元素标签化的抗体掺入单一冷冻干燥的组中是有用的。在一些情况下，这种组对于人外周血的免疫分型可以是特别有用的。在一些情况下，这种组可以是包含来自相同样品的细胞的标记部分(例如，等份)的差异组的试剂盒或方法中的共有组，如本文进一步所描述的。这些差异组可以包括以下组中的一种或多种。

在一些情况下，冷冻干燥的组可以包括包含特别适合于确定有关白血病细胞和/或淋巴瘤细胞的细胞计数信息的抗体的白血病组和/或淋巴瘤组。

本文描述了多种实例冷冻干燥的组。出于描述的目的，可以就抗体和靶标描述组，其中在括号中表示靶标。在一些情况下，只要不同的抗体对替代的抗体的靶标特异，则可以用任何给定抗体替代所述不同的抗体。在某些实施方式中，可以提供(例如，在试剂盒中)多个冷冻干燥的组，从而可以基于样品和/或应用将它们组合。

在一些情况下，用于人急性髓细胞性白血病(AML)分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括HIB19(CD19)、104D2(CD117)、ICRF44(CD11b)、10.1(CD64)、CD7-6B7(CD7)、6H6(CD123)、HI30(CD45)、WM53(CD33)、克隆(靶标)(Clone(Target))、W6D3(CD15)、581(CD34)、UCHT1(CD3)、IM7(CD44)、HIT2(CD38)、L243(HLA-DR)和12G5(CXCR4)。在一些情况下，该组对于AML分型可以是特别有用的。AML是成年人中最常见的急性白血病类型，它是由于正常造血作用的破坏所造成的骨髓内的恶性肿瘤的产生。由于产生染色体重排和多基因突变，因此AML在骨髓细胞、红系细胞、巨核细胞性细胞和单核细胞的细胞谱系的前体内产生。AML的免疫表型是高度不均一的；经常通过AML表达的标志物包括CD15、CD33、CD34和CD64。

在一些情况下，用于人B细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括HIB19(CD19)、1A6-2(IgD)、2H7(CD20)、多克隆(IgA)、BL13(CD21)、L128(CD27)、HIB22(CD22)、CB3-1(CD79b)、HIT2(CD38)、ML5(CD24)、MHM-88(IgM)和L243(HLA-DR)。在一些情况下，该组可以帮助人B细胞的鉴定和分型，包括初始、记忆、过渡和血浆B细胞群体。

在一些情况下，用于识别细胞周期信息的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括N/A(S-期(IdU))、J112-906(pRb[Ser807/811])、GNS-1(细胞周期素B1(CyclinB1))、B56(Ki67)和HTA28(pHistone H3[Ser28])。在一些情况下，该组可以帮助评价细胞周期状态：增殖、G0(衰老)、G1、S-期、G2和M-期(有丝分裂)。对于识别细胞周期状态以及其他细胞计数信息，该组与其他组的组合可以是特别有用的。

在一些情况下，用于人辅助性T细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括G034E3(CCR6)、NP-6G4(CCR5)、RPA-T8(CD8)、C398.4A(ICOS)、HI100(CD45RA)、UCHT1(CD38)、G025H7(CXCR3)、205410(CCR4)、GP-3G10(CD161)、UCHL1(CD45RO)、2A3(CD25)、RF8B2(CXCR5)、SK3(CD4)、EH12.2H7(PD-1)和A019D5(CD127)。在一些情况下，该组可以用于人CD4+辅助性T细胞亚型的鉴定和分型，包括辅助性T1细胞(T_H1)、T_H2、T_H17、T_H22、滤泡辅助性T细胞(T_FH)和T调控细胞(T_REG)。CD4+ T细胞向功能不同的辅助性T细胞亚型的分化对于正常免疫调节可以是重要的。通过外部和内部线索说明了这些亚型，并且所产生的细胞群体获得了通过特征细胞因子，“主调节因子(master regulator)”转录因子的表达和特征性细胞表面表型所定义的稳定表型。

在一些情况下，用于基本人外周血分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括2H7(CD20)、HI30(CD45)、M5E2(CD14)、3G8(CD16)、SK1(CD8)、UCHT1(CD3)和SK3(CD4)。该组对于测定新鲜或冷冻的人全血或PBMC可以是有用的。该组可以用于识别CD4+ T、CD8+ T、B细胞、单核细胞、NK和粒性白细胞。

在一些情况下，用于基本人外周血分型的其他冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括RPA-T4(CD4)、RPA-T8(CD8a)、2H7(CD20)、3G8(CD16)、HI30(CD45)、M5E2(CD14)和UCHT1(CD3)。该组对于测定新鲜或冷冻的人全血或PBMC可以是有用的。该组可以用于识别CD4+ T、CD8+ T、B细胞、单核细胞、NK和粒性白细胞。

在一些情况下，用于人外周血分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括UCHT1(CD3)、RPA-T4(CD4)、RPA-T8(CD8a)、Bu15(CD11c)、M5E2(CD14)、3G8(CD16)、HIB19(CD19)、2H7(CD20)、O323(CD27)、HIT2(CD38)、HI30(CD45)、HI100(CD45RA)、VI-PL2(CD61)、CD66a-B1.1(CD66)、6H6(CD123)、HIR2(CD235a/b)和L243(HLA-DR)。该组对于测定新鲜或冷冻的人全血或PBMC可以是有用的。该组对于主要外周血细胞亚型的识别可以是有用的，所述细胞亚型包括粒性白细胞、嗜碱细胞、浆细胞样树突状细胞、自然杀伤细胞、效应T杀伤细胞、初始T杀伤细胞、激活的T杀伤细胞、记忆T杀伤细胞、效应T辅助细胞、初始T辅助细胞、激活的T辅助细胞、记忆T辅助细胞、记忆B细胞、初始B细胞、血浆B细胞、脊髓树突状细胞、非典型单核细胞、典型单核细胞和血小板。

在一些情况下，用于人T细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括HI111(CD11a)、RPA-T4(CD4)、RPA-T8(CD8a)、3G8(CD16)、2A3(CD25)、HI30(CD45)、G043H7(CCR7)、FN50(CD69)、UCHL1(CD45RO)、BJ18(CD44)、O323(CD27)、HI100(CD45RA)、UCHT1(CD3)、HCD57(CD57)、L243(HLA-DR)和A019D5(CD127)。该组对于测定新鲜或冷冻的人全血或PBMC可以是有用的。该组对于主要T细胞亚型的鉴定可以是有用的，所述主要T细胞亚型包括初始、中央记忆、效应和效应记忆CD4+和CD8+细胞，并且该组还可以对这些亚型的激活和归巢状态进行分类。

在一些情况下，用于扩增的人T细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括TS1/8(CD2)、UCHT2(CD5)、CD7-6B7(CD7)、SN4 C3-3A2(CD9)、CD28.2(CD28)、9F10(CD49d)、HP-3G10(CD161)、205410(CCR4)、NP-6G4(CCR5)和G025H7(CXCR3)。该组对于测定新鲜或冷冻的人全血或PBMC可以是有用的。当与人T细胞分型组合并时，该组可以是特别有用的，在这种情况下，合并的组可以用于识别所有主要T细胞亚型，包括初始、中央记忆、效应和效应记忆CD4+和CD8+细胞、初始和记忆Treg、TH1和TH2细胞，并且可以用于对这些亚型的激活和归巢状态进行分类。

在一些情况下，用于人胚胎干(ES)细胞或诱导多能干(iPS)细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括TRA-1-60(TRA-1-60)、O3O-678(Sox2)、40/Oct-3(Oct-3/4)、N31-355(Nanog)、IM7(CD44)和9E10(c-Myc)。

在一些情况下，用于人造血干细胞和祖细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括HI10a(CD10)、WM15(CD13)、581(CD34)、G0H3(CD49f)、104D2(CD117)、DL-101(CD138)和12G5(CXCR4)。该组可以用于人骨髓和脐血内的造血祖细胞群体的鉴定和分型，包括造血干细胞(HSC)。该组可以有用地与人外周血分型组合并，从而可以从设门策略中排除谱系阳性细胞。

在一些情况下，用于人胞内细胞因子I测定的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括B27(IFNγ)、MQ1-17H12(IL-2)、MP4-25D2(IL-4)、TRFK5(IL-5)、MQ2-13A5(IL-6)、N49-653(IL-17A)、SHLR17(IL-17F)、B(颗粒酶)、B-D48(穿孔素)、D21-1351(MIP1β)和Mab11(TNFα)。该组可以用于测定新鲜或冷冻的人全血、PBMC或细胞系。该组可以帮助测量11种主要的细胞因子以及裂解蛋白、颗粒酶B和穿孔素。该组可以与人外周血分型组合并以允许对表达细胞因子的细胞进行广泛免疫分型。

在一些情况下，用于人调节性T细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括9F10(CD49D)、RPA-T4(CD4)、205410(CCR4)、HI100(CD45RA)、UCHT1(CD3)、A1(CD39)、PCH101(Foxp3)、DX2(CD95)、UCHL1(CD45RO)、2A3(CD25)、14D3(CD152)、L243(HLA-DR)和A019D5(CD127)。该组可以用于识别调节性T细胞。调节性T细胞(Treg)是对于免疫应答的调控重要的CD4+辅助性T(Th)细胞的抑制性亚型。通过转录因子Foxp3的表达定义Treg。其他Treg标志物包括高-亲合力IL-2Rα链(CD25)和细胞毒T淋巴细胞-相关抗原4(CTLA-4)的组成型表达以及IL-7Rα链(CD127)的低表达。CD4+CD25+Foxp3+Treg可以分为两种主要类型：胸腺来源的Treg(tTreg)和周围来源的Treg(pTreg)。

在一些情况下，用于人单核细胞/巨噬细胞分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括HIB19(CD19)、ICRF44(CD11b)、CD7-6B7(CD7)、CD66a-B1.1(CD66)、5-271(CD36)、GHI/61(CD163)、HI30(CD45)、Bu15(CD11c)、M5E2(CD14)、3G8(CD16)、HIT2(CD38)、15-2(CD206)、WM53(CD33)、UCHT1(CD3)和L243(HLA-DR)。该组可以用于识别单核细胞和巨噬细胞并对其分型。单核细胞在血液、骨髓和脾脏中循环并且占总的人白细胞的约2-12％。单核细胞已被认为是用于组织巨吞噬细胞和树突状细胞更新的脊髓前体的全身性贮存库，尽管存在独立于单核细胞产生的DC和巨噬细胞亚群。所招募的单核细胞是对微生物的免疫应答的先天性效应因子，并且它们通过吞噬、活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、髓过氧物酶和炎性细胞因子的产生杀死病原体。可以基于CD14和CD16的表达，将单核细胞分类为“经典”(CD14+CD16-)、中间(CD14+CD16+)和非经典(CD14loCD16+)。

在一些情况下，用于信号转导测定的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括47(pSTAT5)、58D6(pSTAT1)、D3F9(p38)、4/P-Stat3(pSTAT3)、L35A5(Iκβα)、D13.14.4E(pERK1/2)和N7-548(pS6)。该组可以用于定量多条关键信号通路的基础和诱导的磷酸化：JAK/STAT、NFκB和MAPK。该组可以与其他组合并以测量不均一样品(如血液或脾细胞)中的细胞信号转导。作为另外一种选择，当测量均一样品，如细胞系时，它可以用作独立的组。

在一些情况下，用于基础小鼠脾脏/淋巴结分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括30-F11(CD45)、M1/70(CD11b(MAC1))、145-2C11(CD3e)、53-6.7(CD8a)、RM4-5(CD4)和RA3-6B2(B220)。该组对于识别新鲜或冷冻的分离的小鼠脾细胞和胸腺细胞中的CD4+ T、CD8+ T、B细胞、巨噬细胞和单核细胞可以是有用的。

在一些情况下，用于小鼠脾脏/淋巴结分型的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括RB6-8C5(Ly6G/C(Gr1))、N418(CD11c)、H1.2F3(CD69)、30-F11(CD45)、M1/70(CD11b(MAC1))、6D5(CD19)、3C7(CD25)、145-2C11(CD3e)、TER119(TER-119)、MEL-14(CD62L)、53-6.7(CD8a)、H57-597(TCRβ)、PK136(NK1.1)、IM7(CD44)、RM4-5(CD4)和RA3-6B2(B220)。该组对于识别新鲜或冷冻的分离的小鼠脾细胞和胸腺细胞中的主要小鼠脾脏/淋巴细胞亚型可以是有用的，所述细胞亚型包括效应CD4+ T、效应记忆CD4+ T、中央记忆CD4+ T、激活的CD4+ T、效应CD8+ T、效应记忆CD8+ T、中央记忆CD8+ T、Treg、浆细胞样DC、脊髓DC、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和粒性白细胞。

在一些情况下，用于小鼠胞内细胞因子I测定的冷冻干燥的组可以包括来自以下列表的抗体(和靶标)，列表包括XMG1.2(IFNy)、JES6-5H4(IL-2)、11B11(IL-4)、TRFK5(IL-5)、MP5-20F3(IL-6)、JES5-16E3(IL-10)、TC11-18H10.1(IL-17A)和MP6-XT22(TNFa)。该组可以用于测定新鲜或冷冻的小鼠来源的白细胞中的主要小鼠细胞因子，所述白细胞包括脾细胞、胸腺细胞、骨髓和淋巴结细胞或细胞系。该组可以与小鼠脾脏/淋巴结分型组一起使用以允许对表达细胞因子的细胞进行广泛免疫分型。

在一些情况下，其他组或组的亚组可以包括对调节性T细胞表面标志物(例如，PD-1、CTLA-4、GITR、CXCR3、IL-12R、IL-4R、CRTH2、IL-17Rb、IL-23R、CCR6、IL-1Rb、OX40L、CD40L、SLAM、IL-21R、ICOS、CXCR5、TIM3、1B11、LAG3和/或BTLA)；胞内调节性T细胞转录因子标志物(例如，FoxP3、RORgT、T-bet、Bcl6和/或GATA3)；胞内细胞因子和趋化因子标志物(例如，IFNg、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17A、IL-22、IL-23、TGFb、TNFa、穿孔素和/或颗粒酶b)；可成药靶标标志物(例如，BTLA、GITR、4-1BB、OX40、TIGIT、Helios和/或ICOS)；和/或脊髓来源的抑制性细胞标志物(例如，CD11b、CD15和/或CD33)特异的抗体。

CD 4T细胞组可以包括以下中的至少两种：CCR6(G034E3)、CD45RA(HI100)、CD4(RPA-T4)、LAG3(多克隆；R&D Systems)、CCR4(205410)、CD62L(DREG-56；BioLegend)、CD49b(AK-7；BD Biosciences)、CXCR3(G025H7)、CD161(HP-3G10)、TIGIT(MBSA43；eBioscience)、ICOS(DX29；BD Biosciences)、CD226(11A8；BioLegend)、CD8α(SK1)、CD25(2A3)、CTLA-4(14D3)、CXCR5(51505)、CD3(UCHT1；BioLegend)、PD-1(EH12.2H7)，可选地以在括号中列出的克隆形式。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

NK组可以包括以下中的至少两种：CD27、CD4、CD8、CD57、TRAIL、KIRDL2/L3/S2、CD16、CD117、KIR2Ds4、LILRB1、NKp46、NKG2D、NKG2C、2B4、NKp30、CD122、KIR3DL1、CD94、CCR7、KIRDL3、NKG2A、HLA-DR、KIR2DL4、CD56、CD45、KIR2DL5和CD25。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

CD8 T细胞组可以包括以下中的至少两种：CD3、CCR7、CD11a、CD7、CD8、CD27、CD28、CD29、CD43、CD45RA、CD45RO、CD49d、CD57、CD62L、KLRG1和HLA-DR。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

Treg组可以包括以下中的至少两种：CCR6 G034E3、LAP TW4-2F8、CD45RA HI100、CD103 Ber-ACT8、CD31 WM59、CD8 RPA-T8、CD147 HIM6、GITR 621、CCR4 205410、CD28CD28.2、CD49d 9F10、CD62L DREG-56、CD3 UCHT1、CXCR3 G025H7、CD73 AD2、CD161 HP-3G10、CD39 A1、ICOS C398.4A、OX40 Ber-ACT35、CCR10 6588-5、CD137 4B4-1、CD27 L128、GARP 7B11、CD25 2A3、CD25 M-A251、CTLA4 14D3、CD4 SK3、CD38 HIT2、HLA-DR L243、CD71OKT-9和KLRG1 2F1/KLRG1 APC。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

B细胞组可以包括以下中的至少两种：CD10、CD117、CD11c、CD127、CD16、CD179a、CD179b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD235、CD24、CD27、CD33、CD34、CD38、CD40、CD43、CD45、CD45RA、CD49d、CD5、CD61、CD62L、CD66b、CD7、CD72、CD79b、CXCR4、HLADR、IgD、IgMi/IgMs(IgH)、κ、λ、Pax5、PreBCR、RAG1和TdT。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

单核细胞和MDSC组可以包括以下中的至少两种：CD14、CD16、HLA-DR、CD163、CD206、CD33、CD36、CD32、CD64、CD13、CD11b、CD11c、CD86、CD274、CCR2、CD163、CD13、CD123和CD206。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

DC组可以包括以下中的至少两种：EpCAM/CD326、CD19、CD117、CD11b、BDCA2/CD303、CD16、CD127/IL-7R、CD123/IL3R、CD66b、CD163、CD45、CCR7、CD14、CD11c、BDCA3/CD141、CD335/NKp46、BDCA-1/CD1c、CD1a、CD172a/b/SIRPα、HLADR、CD34、CD115/CSF1R、CX3CR1/CX3CR1、CD116/GMSFR、CD275/ICOSL、TLR4、CD274/PDL1、CLEC9A/DNGR1、CD135/FLT3、Dectin-1/CLEC7A、CD206/MMR、CD83、朗格素(Langerin)/CD207、CD45RA、CD33、CD2、CD81、CD5(UCHT2)、CD26、XCR1-PE、抗-APC抗体、Siglec-6/CD327 PE、CD100-APC、Axl、CADM1/SynCAM、CD205/DEC205、BDCA2/CD303 APC、BDCA3/CD141 PECy7、BDCA4/CD304 APC、CD123 BUV395、CD16 BV650、CD163 FITC、CD19 PerCP/Cy5.5、CD20 PerCP/Cy5.5、CD1aPacific Blue、CD2 APC/Cy7、CD206/MMR APC(cline 15-2)、CD3 PerCP/Cy5.5、CD335PerCP/Cy5.5、CD4 BV785、CD45 BV785、CD5 BV737、CD66b PerCP/Cy5.5、CD8a APC/Cy7、CD81 PerCP/Cy5.5、CLEC9A/DNGR1 APC、CD209/DC-SIGN APC、Dectin1/CLEC7A PE、HLADRBV605、朗格素(Langerin)/CD207 PE、TCF4/E2-2、抗成纤维细胞(Anti-fibroblast)(TE7)、CD140a、DARC和桥粒蛋白-3(Desmogelin-3)。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。在某些方面，组可以包括杂交(直接或通过杂交方案)至靶标RNA，如编码细胞因子的RNA的元素标签化的寡核苷酸探针。例如，组可以包括编码下列的RNA的两种或更多种元素标签化的寡核苷酸探针：IFNg、IL-2、TNF、CXCL8、IL8、CCl4、IL-1B、IL-6、CCL2、ILRN和Il1a。在一些情况下，冷冻干燥的组可以包含来自该列表的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种抗体。组可以以冷冻干燥形式或者以溶液提供。组可以是如本文所描述的差异组。

尽管本文描述了多种实例冷冻干燥的组，但是抗体的其他组合或其他元素标签化的部分可以用于帮助实施所期望的测定。在一些方面，可以以非冷冻干燥形式，如以溶液形式提供以上所描述的一种或多种组。可以以混合物(以联合的组)提供两种或更多种以上的组。

本文所公开的每一种冷冻干燥的组可以与基于组中的抗体，用于识别某些特性的具体的设门策略相关。为了帮助快速分析，与具体的组有关的设门策略可以预加载到用于分析元素分析仪数据的软件中。一旦选择(例如，手动或自动)，则软件可以使用该设门策略从元素分析仪数据中产生结果。例如，使用人外周血分型试剂盒，预加载的设门策略可以基于样品中多种抗体的存在(例如，与抗体结合的元素标签的存在)来区分不同的主要外周血细胞亚型。在一些情况下，多种组或组的亚组的组合，如本文中所识别的那些可以使得能够使用新的或其他设门策略。例如，当将人外周血分型组和人造血干细胞和祖细胞分型组合并时，则新的设门策略可以用于帮助从结果中排除谱系阳性细胞。

在每个组内，可以用独特的元素标签使每种抗体标签化，从而独特的同位素或同位素的组合与组中的每种抗体相关。在一些情况下，特别是对于设计以结合另一个组使用的组，来自一个组的独特的元素标签不同于另一个组的独特的元素标签。可以将每种抗体对每种同位素或同位素的组合的定位存储为元素标签定位图(mapping)。可以通过本文所公开的软件使用该元素标签定位图以解释从元素分析仪所接收的数据。

在一些情况下，冷冻干燥的抗体组可以包括一种或多种补充试剂。这些补充试剂可以包括在使用冷冻干燥的抗体组的抗体实施测定中可用的任何适合的可冷冻干燥试剂。适合的补充试剂的实例包括红细胞裂解液、清洗缓冲液、固定试剂、透性化试剂等。

制备冷冻干燥的组的方法可以包括获得抗体，将抗体与它们各自的元素标签缀合，在液体形式的用于质量控制的组中滴定缀合抗体，基于滴定结果在稳定剂中稀释液体抗体，将稀释抗体与赋形剂合并，将抗体和赋形剂混合物合并在一起以形成单一混合物，冷冻干燥的混合物，然后装回冷冻干燥的混合物并将其密封在容器内。在一些情况下，可以在将它们在混合物中合并在一起之前，将各个抗体和赋形剂混合物冷冻干燥，尽管通常在冷冻干燥之前合并多种抗体和赋形剂混合物。可以使用任何适合的赋形剂，如糖(例如，海藻糖、三氯半乳蔗糖和甘露糖醇)。海藻糖和/或蔗糖的使用可以帮助抑制蛋白去折叠，同时提供玻璃基质。甘露糖醇的使用可以起膨胀剂的作用。在一些情况下，赋形剂可以包括单独或与牛血清白蛋白(BSA)组合的糖。在一些情况下，所述赋形剂可以是约5％-20％(例如，10％)的糖在PBS中的溶液和5％-20％(例如，10％)BSA在PBS中的溶液的混合物。

冷冻干燥本身可以在多个阶段中发生，包括加热阶段、抽真空阶段、干燥阶段和保持阶段。在每个阶段期间，温度、升温时间、保持时间和/或真空度的具体设置(例如，冷冻干燥设置)可以用于控制冷冻干燥设备。冷冻干燥设备可以是任何适合于控制要冷冻干燥的混合物的温度和真空度的设备。在一些情况下，每个阶段可以包括多个不同的子阶段，每个子阶段具有不同的冷冻干燥设置。在加热阶段期间，温度可以在-60至0℃之间的某个温度保持一段持续时间，同时真空度保持在100-500托之间的范围内。在抽真空阶段期间，可以使真空度降低至100-500毫托之间的范围内。在干燥阶段期间，可以在-50至30℃之间的范围内操纵温度，同时将真空度保持在10-150毫托的范围内。在保持阶段期间，温度可以保持在10至30℃之间的温度，同时使真空度升高到100-500毫托之间的范围内。在保持阶段后，可以将冷冻干燥的混合物装回，这可以包括提高容器中的压力，如高达200托至760托的范围内，尽管在一些情况下，装回在低于环境压力的压力下发生。在一些情况下，在冷冻干燥的所有阶段期间，混合物的温度不升高到混合物的玻璃化转变温度以上。

在冷冻干燥过程期间，混合物的含水量降低。在某些情况下，冷冻干燥的组可以具有处于或小于按重量计5％的含水量，尽管在一些情况下，含水量可以处于或小于按重量计0.5％。在一些情况下，冷冻干燥的组可以具有处于或小于下列的含水量：5％、4.9％、4.8％、4.7％、4.6％、4.5％、4.4％、4.3％、4.2％、4.1％、4％、3.9％、3.8％、3.7％、3.6％、3.5％、3.4％、3.3％、3.2％、3.1％、3％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、.95％、0.9％、0.85％、0.8％、0.75％、0.7％、0.65％、0.6％、0.55％、0.5％、0.49％、0.48％、0.47％、0.46％、0.45％、0.44％、0.43％、0.42％、0.41％、0.4％、0.39％、0.38％、0.37％、0.36％、0.35％、0.34％、0.33％、0.32％、0.31％、0.3％、0.29％、0.28％、0.27％、0.26％、0.25％、0.24％、0.23％、0.22％、0.21％、0.2％、0.19％、0.18％、0.17％、0.16％、0.15％、0.14％、0.13％、0.12％、0.11％和/或0.1％。在一些情况下，冷冻干燥的组可以具有处于或大于按重量计0.05％的含水量，如按重量计0.05至1％之间的含水量。

冷冻干燥的组可以保存在任何适合的容器中，如管、小袋或孔板的孔中。在一些情况下，单个组可以储存在单个容器中。在一些情况下，单个组可以均匀分配在多个容器中，如孔板的多个孔中。在一些情况下，冷冻干燥的组可以储存在惰性气氛(例如，N₂)或空气(例如，干燥空气)内。冷冻干燥的组可以储存在密闭容器中。

可以类似于其他抗体组使用冷冻干燥的组。可以在添加要分析的样品之前或之后，使冷冻干燥的组在溶液中再混悬。在一些情况下，在与冷冻干燥的组混合之前，人外周血样品可以与肝素混合。在一些情况下，可以将血液样品直接混合到含有冷冻干燥的组的容器中，尽管不需要始终是这种情况。在将样品与冷冻干燥的组混合之后，可以将混合的样品培育一段时间，清洗，然后使用元素分析仪研究。在一些情况下，可以在研究前发生进一步染色，如胞内靶标染色，这可能需要样品的透性化和固定。

在某些方面，试剂盒包括元素标准品(例如，在其自身的试剂盒中提供或者与本文所描述的其他试剂，如冷冻干燥的组和/或条型码化珠一起提供)。元素标准品可以包括包含已知量的多种不同的金属同位素的微珠。在某些方面，元素标准品可以包含具有不同的量的一种或多种金属同位素的微珠。例如，元素标准品微珠可以包含2种或以上、3种或以上、4种或以上或者5种或以上的微珠群体，其中每种群体包含类似的量的多种金属同位素中的每一种，但是群体在至少一种金属同位素的量方面不同。群体内给定同位素的类似的量可以表示给定同位素的量的标准偏差(所述群体的珠中该同位素的原子个数)可以是该群体中珠的给定同位素的平均的量的小于10％、小于25％、小于50％、小于100％、小于200％或者小于300％。珠的群体可以具有与试剂盒中的每一种其他群体相比，以显著不同的量存在的至少一种同位素(例如，与第一其他群体相比显著不同的同位素可以不同于显著不同于第二其他群体的同位素)。例如，群体之间的同位素的平均的量之间的差异可以的所述群体之一或两者内的标准偏差的大于2倍、大于3倍、大于4倍或者大于5倍。

在某些方面，元素标准品微珠可以包含在至少一些微珠群体之间量具有差别的至少2、3、4、5、6、7、8或9种可变同位素。元素标准品微珠的同位素(例如，可变同位素)可以覆盖大于10、大于20、大于30、大于40或者大于50amu的质量范围。至少一种同位素可以在全部或一些微珠群体内保持恒定，从而恒定同位素和可变同位素之比可以用于表示珠群体(例如，识别珠中可变同位素的预期的量)。

微珠可以具有大于100nm至小于1000um，如500nm至100um之间的尺寸。照此，微珠可以具有每个珠大于一千、一万、十万或一百万个原子。可以根据本文中对其他珠所描述的任何方法，如制备测定和/或样品条型码化珠的方法(例如，无结合生物分子的步骤，如SBP与表面的结合)或者任何适合的方法制备微珠。

元素标准物可以用于质量细胞计数器的校准和/或对整个样品运行所获得的信号的归一化。例如，元素标准品可以用于定量所结合的抗体，如每个细胞所结合的抗体。元素标准品微珠可以与细胞混合并在质量细胞计数器上运行(例如，从而可以单独检测微珠事件和细胞事件)。照此，微珠中至少一种同位素的质量可以不同于用于细胞的任何质量标签。

在某些方面，方法包括基于本文所描述的元素标准品(例如，包括元素标准品的试剂盒)校准质量细胞计数器(在样品运行开始和/或期间)。作为另外一种选择或者另外，方法可以包括基于本文所描述的元素标准品(例如，包括元素标准品的试剂盒)归一化质谱流式细胞术数据。例如，可以将来自细胞(即来自特定质量通道)的同位素信号归一化至在类似时间所采集的来自微珠的具有类似质量和/或量的同位素的强度。例如，来自结合至细胞的特异性分析物的金属同位素标签化的抗体的信号可以归一化至在细胞事件的时间窗内获得的质量和强度最类似的同位素信号的强度。可以基于在该细胞事件的时间窗内所检测的元素标准品微珠，对不同质量和/或强度产生标准曲线以归一化来自细胞事件的信号。时间窗可以是小于1000秒、小于100秒或者小于10秒。可以从数据集中弃去在时间窗内未对其获得的群体的元素标准品微珠的细胞事件。可以基于最近的微珠事件归一化细胞事件(例如，基于通过对于每个微珠群体最近的微珠事件所提供的信号归一化)。在某些方面，可以将相同的校准曲线用于校准时间窗内的所有细胞事件。

在某些方面，元素标准品微珠(例如，元素标准品微珠群体)中的多种同位素中的每一种的量(例如，原子的平均个数和可选地偏差)可以是已知的，并且附接至与细胞分析物结合的抗体的给定同位素的原子的量(例如，原子的平均个数和可选地偏差)可以是已知的并且一起用于计算每个细胞所结合的(例如，与分析物结合的)抗体。例如，可以通过FPLC(例如，尺寸排除FPLC和/或阴离子离子交换FPLC)进行标记抗体的分级和分析，并且可以将蛋白的整体的量用于反算抗体的量，并且可以通过质谱确定整个金属(bulk metal)。可以检验元素标准品微珠(例如，通过电子显微镜)以确定尺寸和均一性。仪器(例如，在整个样品运行和/或样品运行之间)的校准可以进一步使得能够定量所结合的抗体。

在某些方面，具有元素标准品微珠的试剂盒或方法可以与本文所描述的其他方面组合，包括金属标签化的抗体和/或测定条型码化珠的冷冻干燥的混合物。例如，可以在相同试剂盒或甚至容器中提供元素标准品微珠(例如，与冷冻干燥的抗体混合)。作为另外一种选择，在通过质谱流式细胞术分析之前，随后可以将用本文所述的冷冻干燥抗体染色的细胞与元素标准品微珠合并。归一化(如每个细胞所结合的抗体的定量)可以改善对细胞群体设门的能力，如通过本文所描述的自动设门软件。

以下实例程序列出了人外周血样品染色的步骤。以100U/mL的最终浓度，将肝素钠盐添加至需要染色的血液等份(10uL 10KU/mL至1mL血液)。将该混合物涡旋2秒并在室温下培育至少20min。在5ml管中制备抗体混合物(例如，冷冻干燥的抗体组)。将一定体积的肝素-封闭的血液直接添加至5mL管中，从而最终体积(血液+抗体混合物)为300μL，并且将混合物涡旋2秒以确保冷冻干燥制品再混悬。将混合物在室温下培育30分钟。染色完成后立即向每根管中添加250μL Cal-Lyse裂解溶液。在室温下避光培育10分钟。向每根管添加3mL的水。将管涡旋2秒并在室温下培育10分钟。细胞混悬液开始将是不透明的并且在培育10分钟之后变为半透明的。如果10分钟之后细胞混悬液未完全半透明，则将样品重涡旋并将其在室温下培育另外5分钟。将管离心并将上清液倾倒至50mL废液管内。向每根管添加3mL细胞染色缓冲液。将管离心并倾倒上清液。将清洗步骤重复2次，总计清洗3次。在每次清洗后，目视检查细胞小粒和细胞上清液。如果细胞小粒或上清液为红色，则重复清洗直至上清液透明且细胞小粒为白色。然后，固定细胞并插入DNA。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将16％的甲醛的新鲜稀释液制备为1.6％的工作溶液。向每根管添加1mL 1.6％的甲醛。将所述管涡旋2秒并在室温下培育10分钟。在室温下以800×G离心5min并倾倒上清液。在固定和透性化缓冲液中将嵌入剂稀释至125nM的最终浓度。向每根管添加1mL嵌入剂+缓冲混合物。将管涡旋2秒，并在4℃培育过夜。可以将细胞在4℃，在甲醛中保持多至48小时。如果需要或可用，则可以将固定的细胞接种到所制备的载玻片上。然后，在样品采集前清洗细胞。向每根管添加2mL细胞染色缓冲液。将管涡旋2秒，并在室温下以800×G离心5min。一旦离心完成，倾倒上清液。将清洗步骤重复1次，总计清洗2次。向每根管添加2mL细胞采集溶液。将管大致涡旋。计数细胞以确定采集期间的再混悬的最终体积。在室温下以800×G离心5min。一旦离心完成，吸出或移液掉上清液。保留细胞小粒并在4℃储存直至对于采集就绪。在15mL管中产生按体积计90％的细胞采集溶液和10％的4种元素校准珠的混合物。一旦对于采集就绪，将细胞在细胞采集溶液+4种元素校准珠的混合物中以0.5×10⁶个细胞/mL至1.5×10⁶个细胞/mL之间的浓度再混悬。从5mL具有细胞过滤器盖(cell-strainer cap)的聚苯乙烯圆底管除去细胞过滤器盖，并将其放置在5mL聚丙烯圆底管上。通过细胞过滤器盖过滤再混悬的细胞。在预-调节的ICP-MS仪上采集样品。以不超过600个样品/s采集样品。应采集至少400,000个事件。

如本文所使用的，固定和透性化是指通过试剂，如戊二醛、甲醛、福尔马林、乙醇、甲醇等的细胞组分的化学交联和用去污剂在细胞膜中产生孔。适合的去污剂可以容易地选自非离子型去污剂。期望地，以约0.001％至约0.1％之间的浓度使用这些去污剂。可以使用的一种去污剂为Triton X-100(Sigma T9284)。其他适合的去污剂的实例包括Igepal和Nonidet P-40。本领域技术人员可以容易地选择其他适合的去污剂。

本发明公开的某些方面对于分析全血，如人外周血是有用的。在一些情况下，在用冷冻干燥的组染色前，可以将全血分离成PBMC和分离的血浆。冷冻干燥的组可以染色PBMC。在一些情况下，无论是通过冷冻干燥的组染色之前或之后，可以用如本文所公开的样品条型码对样品或来自样品的PBMC标签化。当标签化时，在通过元素分析仪研究之前，可以将样品混合在一起。可以使用元素分析仪，如质谱分析仪研究染色的PBMC。

来自元素分析仪的数据可以包括指明样品中多种同位素的存在的数据。具体地，该数据可以包括在样品清洗后，保持与样品结合的元素标签的可检测同位素的存在。元素分析仪可以逐个细胞或逐个颗粒研究样品，因此逐个细胞或逐个颗粒产生了数据。例如，来自元素分析仪的数据可以指示对于每种细胞或每种样品颗粒的多种同位素的存在。

在自动分析过程期间，软件可以将元素分析仪数据解码成有用且可读的结果。可以将该软件引入元素分析仪或单独提供(例如，在单独的计算装置上提供)。解码元素分析仪数据可以导致识别通过元素分析仪所检测的多种元素标签，可以将其称为元素标签数据。每种元素标签可以与特定标志物，如抗体、活细胞标志物或者样品条型码相关。这些相关性可以存储为软件可访问的元素标签定位图。然后，软件可以将该元素标签定位图应用于元素标签数据以产生有用且可读的结果。在一些情况下，软件可以选择(例如，手动或自动)具体的设门方案(gating scheme)以在元素标签数据的解释中使用。例如，对于特定冷冻干燥的抗体组，可以将特定设门方案用于帮助解释元素标签数据，从而来自冷冻干燥的抗体组的多种抗体的存在或不存在可以帮助识别具体的细胞类型(例如，激活的T辅助细胞、记忆T辅助细胞或记忆B细胞)。然后，软件可以输出适合的结果，以显示或储存文件。

在一些情况下，软件可以自动识别样品的细胞类型。细胞类型的自动识别可以基于对共有表面标志物亚组的类似表达的细胞群体的预定设门。作为另外一种选择或者另外，还可以通过聚类算法指导细胞类型的鉴定。

在一些情况下，软件可以输出细胞类型结果。细胞类型结果可以包括多种细胞类型的相对定量(例如，总细胞的％、亲代细胞(母体细胞群体)的％、祖代细胞的％等)，如CD4αβT细胞(例如，总CD4、初始、中央记忆、效应、效应记忆和调节性)；CD8αβT细胞(例如，总CD8、初始、中央记忆、效应、效应记忆)；δγT细胞；B细胞(例如，总B细胞、初始、记忆、静息记忆、过渡性)；NK细胞；单核细胞；和/或树突状细胞。

在一些情况下，软件可以输出标志物强度。标志物强度可以包括每种细胞类型的标志物和/或根据用户判断的任何其他标志物的强度(例如，中值强度)。例如，可以产生视觉输出，其在表型树中显示每种细胞类型的强度“颜色”。在另一个实例中，将每个结果与含有频率、强度和细胞计数的可报告结果(reportable)的用户-产生的数据集相比较，其可以通过目视显示进行显示(例如，如果中值比正常值大1.5西格玛(sigma)，则颜色可以目视为“热”；如果中值比正常值小1.5西格玛，则颜色可以目视为“冷”)。

在一些情况下，软件可以输出其他结果，如任何两个标志物的点图和/或任何标志物的柱状图。在一些情况下，软件可以对具有不止一种模式的分布(例如，双峰分布)的任何标志物自动插旗。在一些情况下，软件可以输出具有所期望的可报告结果(例如，频率、强度和细胞计数)的报告文本文件。在一些情况下，软件可以维护可报告结果(例如，频率、强度和细胞计数)的数据库。在一些情况下，软件可以输出具有用户选择的图和表的印刷质量格式的报告。

本发明公开的某些方面涉及基于每个样品和可选地每个测定，使用元素标签对样品的条型码化。如本文所公开的，基于它们的同位素组成，元素标签可以是独特且可区分的。例如，在样品或测定条型码中使用的元素标签(或元素标签的组合)可以具有将它与其他元素标签相区分的独特的同位素或独特的同位素组合。因此，当在样品的元素分析期间识别测定条型码时，可以做出以下推断：正在研究的特定细胞或颗粒已经历了与测定条型码有关的测定(例如，处理/刺激条件、用特定标签化的SBP组染色等)。值得注意地，测定和/或样品条型码可以用于标识包含两种或更多种测定条型码或者两种或更多种样品条型码的颗粒双峰(并从中排除数据)。

可以通过将样品中的分析物结合至与正在检测的特定靶标分析物相关的测定条形码来实现测定条型码化。测定条型码可以包括固体载体(例如，测定珠)、捕获生物分子(例如，特异性结合样品中的靶标分析物并将其结合至测定珠表面的测定生物分子)和与该靶标分析物相关的同位素的可区分的组合(测定条型码)。所述固体载体可以是平面表面/载玻片(例如，包含测定条型码化的阵列)或者测定条型码化珠。测定生物分子可以是寡核苷酸(例如，其特异性杂交至靶标RNA或DNA)、亲合试剂(例如，抗体、适体或凝集素)或者底物(例如，包含在存在目标酶，如目标蛋白酶的情况下切割的元素标签的肽)。测定生物分子可以结合至测定珠，从而不同的测定生物分子(例如，结合至不同靶标分析物的测定生物分子)结合至具有不同测定条型码的珠。如本文所描述的，报告分子(reporter)可以提供测定生物分子的检测。该报告分子可以包括(直接或间接)结合至靶标分析物的报告生物分子(例如，寡核苷酸或抗体)。报告分子还可以包括用于检测与测定珠结合的(例如，通过结合至本身结合至珠的测定生物分子结合)靶标分析物的存在的元素标签。

总体上，测定生物分子和报告分子可以提供提高的特异性，因为两者均需结合靶标分析物以提供信号。此外，通过测定生物分子结合的分析物将存在于珠的表面上(或者与表面间隔开)，从而具有大元素标签的报告分子仍可以结合至靶标。照此，本文所描述的信号放大方法可以用于检测靶标分析物。

如本文在质谱流式细胞术的背景中所使用的，信号放大是将大于30、大于50、大于100、大于200或大于500个标记原子(例如，富集的同位素)与靶标分析物(即通过特异性结合伴侣结合的靶标分析物的单一实例)结合。在某些方面，标记原子可以是重金属，如镧系或过渡金属。在某些方面，可以对大于2、5、10或20个靶标分析物进行信号放大。在某些方面，信号放大可以包括质量标签与生物分子的支链缀合(branched conjugation)、高灵敏度聚合物、大质量标签颗粒、质量标签纳米颗粒、多种元素标签化的寡核苷酸(例如，包括相同元素标签的多种实例)与靶标结合的杂交方案和/或多种元素标签的酶促沉积的使用。在某些方面，信号放大使用了如本文所描述的质量标签聚合物。

质量标签化的寡核苷酸可以直接或间接杂交至靶标寡核苷酸。例如，一种或多种中间寡核苷酸可以提供支架，在支架上可以杂交多种质量标签化的寡核苷酸，借此放大信号。因此，主题专利申请的方面包括用于基于杂交的信号放大的寡核苷酸。

靶标寡核苷酸可以是细胞内源的DNA或RNA分子(如编码RNA、小干扰RNA或微小RNA)。靶标寡核苷酸可以是单链的。靶标寡核苷酸可以具有已知的具体序列(或者与已知的具体序列的同源性)。在某些方面，生物分子，如抗体或其衍生物可以缀合至靶标寡核苷酸，从而缀合至包含已知序列的合成单链DNA寡核苷酸。在这些情况下，抗体和所述寡核苷酸两者可以被称为生物分子。

在生物分子与样品中的分析物结合之后，多种质量标签化的寡核苷酸可以直接或间接杂交至第一寡核苷酸。所述杂交可以是支链或直链的。在某些方面，聚合酶可以使第一寡核苷酸沿模板延伸以提供用于元素标签附接的其他位点(如用于元素标签化的寡核苷酸的其他杂交位点)。质量标签化的寡核苷酸可以包括单个标记原子，或者可以包括包含多个标记原子的聚合物。质量标签化的寡核苷酸可以在寡核苷酸本身的化学结构中包含标记原子，如重金属原子。

信号放大可以独特地有益于基于珠的测定，其中可以放大相同的报告标签(标记金属元素或同位素)并在不同的珠和它们的靶标分析物中使用。在某些方面，除在信号放大杂交方案中使用之外，可以用本文所描述的高灵敏度聚合物或纳米颗粒使质量标签化的寡核苷酸质量标签化。

在某些方面，测定珠可以是可定制的，从而用户可以对每个测定条型码化珠测定所关心的生物分子。这种附接可以通过化学键，或者可以通过将测定生物分子定位至相同混合物中的特定测定条型码化珠。这种定位可以通过提供测定条型码化珠来实施，测定条型码化珠提供了对于每种测定条型码独特的寡核苷酸序列，并且用户可以将不同的定位寡核苷酸附接至不同的生物分子以附接至珠表面，其中定位寡核苷酸特异性杂交至独特的寡核苷酸序列中的一种。

在其中测定生物分子是寡核苷酸的情况下，元素标签化的报告寡核苷酸可以杂交至靶标RNA或DNA的另一个部分，借此当靶标RNA或DNA结合至珠时提供信号。在其中测定生物分子是亲合试剂，如在第一表位结合分析物的抗体的情况下，元素标签化报告亲合试剂(例如，报告抗体)可以结合至所述分析物上的另一个表位，借此当靶标分析物结合至珠时提供信号。分析物还可以被报告分子，如元素标签化的报告抗体或寡核苷酸结合。报告分子可以包括提供高丰度的同位素(例如，单一同位素的大于50、100、200、500、1000个拷贝)的高灵敏度(例如，强度)元素标签，借此使得能够检测结合至测定珠的较少数目的靶标分析物。这种高灵敏度元素标签可以包括纳米颗粒(例如，包含官能化以结合生物分子，如抗体或寡核苷酸的金属纳米晶体表面)或者超支化聚合物。例如，包含相同纳米金颗粒元素标签的多个报告生物分子将提供高信号并利用以下事实：可以通过测定条型码区分包含相同元素标签的单独的报告生物分子(例如，提供它们所特异的分析物的珠)。在某些方面，纳米颗粒标签(例如，金纳米颗粒)可以通过生物素-抗生物素蛋白(例如，生物素-抗生蛋白链菌素)相互作用与报告探针结合。例如，纳米颗粒(例如，金纳米颗粒)可以缀合至抗生蛋白链菌素。报告分子还可以包含提供不同于高丰度同位素的低丰度同位素(例如，同位素的小于100、50、30、20、10或5个拷贝)的低灵敏度元素标签，借此允许检测/定量丰度过高，从而高丰度同位素将使检测器饱和的分析物的量。在某些方面，高和低丰度同位素具有质量差异(例如，大于5、10、20、30、40或50amu)，从而高丰度同位素对检测器的饱和不影响低丰度同位素的检测。不同分析物的报告分子(例如，包含结合至不同测定珠的靶标分析物的抗体)可以包含相同的同位素或同位素的组合，因为将通过珠的独特的测定条型码来区分所述分析物。

在某些方面，报告分子可以包括通过元素标签的多种实例与靶标分析物的单一实例的结合提供信号放大的报告系统。信号放大可以通过酶促沉积、杂交(例如，支链杂交、链杂交和/或多个报告寡核苷酸与单一长中间寡核苷酸的杂交)、延伸(例如，单一延伸、滚环延伸)和/或一系列支链缀合。在某些方面，可以通过相同报告系统检测通过测定珠检测的多种(例如，全部)分析物。在某些方面，信号放大报告系统可以具有高灵敏度元素标签。

例如，可以通过附接至报告生物分子的酶，将包含酶底物部分的元素标签从溶液沉积到珠(或者附接至珠的分子)上。这种反应可以是通过经由结合至报告生物分子的辣根过氧化物酶作用的酪胺元素标签的共价结合。

方面包括杂交方案，从而多种元素标签化的寡核苷酸间接(通过一种或多种寡核苷酸中间体)杂交至单个寡核苷酸靶标。例如，寡核苷酸靶标可以是靶标RNA或DNA(例如，gDNA或cDNA)序列，或者可以是报告抗体上存在的寡核苷酸。

如本文所描述的，质谱流式细胞术使得足够的检测通道(质量通道)能够检测珠中的样品和测定条型码两者，同时允许用于报告分子的其他通道(例如，用于检测测定靶标)。照此，本文所描述的珠测定可以是用于质谱流式细胞术的样品和/或测定条型码。例如，可以将多种不同条件(例如，药物候选，如酶或者一种或多种酶的激动剂或拮抗剂)应用于生物样品，并且可以通过酶测定珠检测它对多种靶标的作用。可以通过暴露于相同条件的不同的测定珠所共有的样品条型码来识别各个条件。可以在分析之前，如暴露于条件之前合并测定条型码化珠。可以在分析之前合并样品条型码化珠。

在某些方面，酶可以是蛋白酶、激酶、磷酸酶或DNA修饰蛋白，如DNA甲基转移酶。靶标可以是通过酶作用的底物，并且在通过酶对其作用之前或之后，报告分子(例如，如本文所描述的报告生物分子)仅可以结合靶标。例如，磷酸化特异性抗体检测蛋白靶标的磷酸化形式，当通过激酶作用时其丰度可以升高或者当通过磷酸酶作用时其丰度可以降低。当酶为蛋白酶时，报告分子可以与肽底物末端结合，并且当切割底物时，从与珠的结合中移除(从而报告元素标签的减少表明蛋白酶活性的升高)。

样品条型码可以用于表明在特定测定中测试一些酶(或其激动剂/拮抗剂)中的哪些。例如，可以将候选酶、激动剂、拮抗剂添加至生物流体，如细胞裂解液，然后将所述样品与测定条型码化珠接触以检测酶的活性。作为另外一种选择，可以将候选施用于细胞(例如，直接或通过基因工程)或生物，如患者或哺乳动物测试受试者，并且从该来源所采集的样品可以与测定珠接触。样品条型码化允许同时筛选多个候选。在任一种情况下，可以如本文对于珠所描述的添加样品条型码以识别候选。例如，可以使大于10、大于20、大于50、大于100、大于500或大于1000个不同的样品条型码化。例如，12种不同的同位素的6种的独特组合提供了924种不同的组合(例如，用于最多924种样品的条型码化)。另一种12种不同的同位素可以用于条型码化接近1000种测定。照此，可以使大于10、大于20、大于50、大于100、大于500或大于1000种不同的测定珠条型码化(例如，检测通过候选作用的不同底物的量的珠)。如本文所描述的，将保留至少一个通道以用于通过报告分子对底物的检测。这可以允许使用通过质谱流式细胞术的直接读数进行前所未有的筛选。

通过活细胞内的酶进行蛋白的翻译后修饰。已知的翻译后修饰包括蛋白磷酸化和去磷酸化以及甲基化、异戊烯化(prenelation)、硫酸化和泛素化。已知蛋白，特别是酶上的磷酸基团的存在或不存在在多种生物化学通路和信号转导通路中起调控作用。

在美国专利公开US20070190588中讨论了用于质谱流式细胞术的基于珠的激酶测定，该专利作为参考并入并在下文中进行了总结。然而，尚未对样品和测定条型码化两者提议这类基于珠的测定，所述条型码化提供了筛选优势并且是通过质谱流式细胞术的高多路性(high plexity)能够独特地实现的。

激酶的功能是将磷酸基团(磷酸化)从高能供体分子，如ATP转移至特异性靶标分子(底物)。从靶标除去磷酸基团的酶被称为磷酸酶。最大的激酶组是蛋白激酶，其作用于特异性蛋白质并改变它们的活性。作用于小分子(脂质、碳水化合物、氨基酸、核苷酸等)的多种其他激酶通常以它们的底物命名并且包括：腺苷酸激酶、肌酸激酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、二磷酸核苷激酶、胸苷激酶。

蛋白激酶催化磷酸酯从三磷腺苷(ATP)向靶向的肽或蛋白底物的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的转移。通过它们使底物在各个序列上磷酸化的能力来区分蛋白激酶。可商购的激酶可以处于活性形式(通过供应商磷酸化)或者处于非活性形式并且需要通过另一种激酶的磷酸化。

蛋白磷酸酶将磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸残基处的磷酸单酯水解成磷酸盐离子和具有游离羟基的蛋白或肽分子。这种作用与蛋白激酶直接相反。实例包括：水解磷酸化-酪氨酸残基的蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和肌醇单磷酸酶。

另一个方面将提供用于磷酸酶测定的方法，其包括：以用元素标签(元素标签可以可选地是对于所有底物相同的元素标签)标记的每种类型的磷酸化底物附接至单一类型的元素标记的载体的方式，在大量溶液中培育多种具有与之附接的金属离子配位络合物的元素标记的载体，所述每种溶液包含用元素标签(元素标签可以可选地是对于所有底物相同的元素标签)标记的不同的游离的磷酸化底物；在大量单独的溶液中，从附接至金属离子配位络合物(金属离子配位络合物附接至大量元素标记的载体)的结合的底物中分离游离的磷酸化底物；在使得磷酸酶能够使磷酸化底物去磷酸化的条件下，培育大量元素标记的载体，元素标记的载体具有与之附接的大量用元素标签(元素标签可以可选地是对于所有底物相同的元素标签)标记的磷酸化底物，所述附接是通过在具有ADP和至少一种磷酸酶的单一溶液中与附接至所述载体的金属离子配位络合物的附接进行的；从用元素标签(元素标签可以可选地是对于所有底物相同的元素标签)标记的结合的磷酸化底物分离游离的非磷酸化底物，元素标签附接至金属离子配位络合物，金属离子配位络合物附接至大量元素标记的载体；和对用元素标签(元素标签可以可选地是对所有底物相同的元素标签)标记的结合的磷酸化底物实施颗粒元素分析，元素标签附接至金属离子配位络合物，金属离子配位络合物附接至大量元素标记的载体。

本发明的申请人的教导的另一个方面是提供用于检测和测量样品中元素的试剂盒，其中所测量的元素包含附接至磷酸化底物的元素标签、金属离子配位络合物元素和独特标记的载体的元素，其包括：用于直接标签化磷酸化底物的元素标签；大量磷酸化底物；独特标记的载体；金属离子配位络合物；和可选地，磷酸酶、磷酸酶缓冲液和ADP。

本发明的申请人的教导的另一个方面是提供用于激酶测定的方法，其包括：以单一类型的非磷酸化底物附接至单一类型的元素标记的载体的方式，在使得激酶能够使底物磷酸化的条件下，培育ATP、至少一种激酶、游离金属离子配位络合物和固定化在元素标记的载体上的大量非磷酸化底物；将固定在具有附接的金属离子配位络合物的元素标记的载体上的大量磷酸化底物与游离金属离子配位络合物和大量固定化的非磷酸化底物分离；并通过元素分析测量在具有附接的金属离子配位络合物的元素标记的载体上固定化的大量磷酸化底物。

本发明的申请人的教导的另一个方面是提供用于检测和测量样品中元素的试剂盒，其中所测量的元素包含附接至非磷酸化底物的元素标签和金属离子配位络合物，其包括：用于直接标签化非磷酸化底物的元素标签；非磷酸化底物；固体载体；金属离子配位络合物；和可选地，激酶；激酶缓冲液；和ATP。

如本文所讨论的，载体可以是作为样品并条形码化的编码的珠。

由于它们在维持动物体内平衡中的作用，酶的测定和药理学调控已成为识别可能的治疗剂的关键元素。蛋白酶是最近显示在信号转导通路中起重要作用的蛋白降解酶的亚类，它的调控异常可以导致癌症、心血管疾病和神经障碍。在约400种已知的人蛋白酶中，数十种正在作为潜在的药物候选进行研究。目前认为蛋白酶的小-分子抑制剂是用于退行性疾病治疗，用于癌症治疗和作为抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂的有价值的治疗性先导物。

在美国专利公开US20170023583中讨论了用于质谱流式细胞术的基于珠的蛋白酶测定，该专利作为参考并入并在下文中进行了总结。然而，尚未对样品和测定条型码化两者提议这类基于珠的测定，所述条型码化提供了筛选优势并且是通过质谱流式细胞术的高多路性(high plexity)能够独特地实现的。

仍需要允许同时测量多个酶促反应的稳健、敏感且定量的酶测定。该测定可以允许保留有价值的生物样品和试剂，实现高通量并降低测定时间，并且降低酶分析的总成本。

本发明的一个方面是用于检测生物流体中的蛋白酶活性的方法。所述方法可以包括将编码的珠附接至肽底物的第一氨基酸以形成固定化的肽底物，所述肽底物包含第一氨基酸和最后的氨基酸并且是蛋白酶的底物：将元素标签附接至所述肽底物的最后的氨基酸以形成标签化的肽底物：将所述固定化、标签化的肽底物与生物流体一起培育：并通过元素分析检测所述生物流体中的元素标签和编码的珠。如本文所讨论的，所述编码的珠可以是测定和样品条型码化的。

蛋白酶测定试剂盒可以包括附接至肽底物(固定化的肽底物)的第一氨基酸的测定编码珠，所述肽底物可以包括第一氨基酸和最后的氨基酸并且可以是蛋白酶的底物。元素标签可以附接在肽底物的最后的氨基酸处或附近以形成标签化的肽底物。如本文所讨论的，所述编码的珠可以是测定和样品条型码化的。

测定珠的混合物可以一起靶向至少5、10、20、50、100、200、500、1000或更多个分析物。在某些方面，样品条型码可以区分来自至少5、10、20、50或100或更多种不同的样品的测定条型码化珠和/或细胞。

在某些方面，可以通过它们对其特异的分析物改变测定条型码化珠的数目和/或尺寸。例如，特异性结合高丰度靶标分析物的测定条型码化珠可以在其表面上具有比特异性结合相同样品中低丰度靶标分析物的测定条型码化珠更少的抗体，或者数目更多。例如，在测定条型码化珠的混合物中，对于第一靶标分析物特异的测定条型码化珠的丰度可以是对于第二靶标分析物特异的测定条型码化珠的2、5、10、20、50或100倍。当所述第一分析物的丰度大于所述第二分析物时，它将在结合它的大数目的测定条型码化珠中被稀释。测定条型码试剂盒可以包含如本文所描述的一种或多种测定条型码化珠和/或报告分子。

可以通过与特定样品有关的样品条型码标签化样品实现每个样品的条型码化。因此，当在元素分析期间识别样品条型码时，可以推断正在研究的特定细胞或颗粒是特定样品的一部分。因此，可以在应用样品条型码和使用元素分析研究之间的任何时间将多个样品混合在一起，同时不会损失将所研究的细胞或颗粒与它们各自样品相关的能力。通过允许样品混合在一起，元素分析仪可以以更高的通量运行并且可以简化样品的处理和储存。

样品条型码可以包括偶联至对于所有、绝大部分或大部分或者所有样品的细胞或颗粒具有靶向功能的元素标签化的部分(例如，测定条型码化试剂或样品条型码化试剂)的元素标签。如本文所使用的，术语绝大部分可以包括至少51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的样品的细胞或颗粒。

在一些情况下，条型码化试剂可以是能够含有或偶联至元素标签的珠。在一些情况下，独特的测定条型码可以位于珠内并且珠的表面可以含有，偶联至或官能化以偶联至独特的样品条型码。可以使用任何适合于含有或偶联至元素标签的珠，如聚合物-辅助的表面官能化的珠。这种聚合物可以是聚L-赖氨酸、PEG(聚乙二醇)、PEG MEA(甲醚丙烯酸脂)、PVMS(甲基乙烯基聚硅氧烷)、聚多巴胺、聚苯乙烯和/或本领域技术人员已知的另一种聚合物或衍生物。在一些情况下，可以通过用于结合具有靶向功能的部分(例如，抗体)的第一官能团和用于结合样品条型码的第二官能团官能化珠。然而，在一些情况下，珠可以仅用能够结合具有靶向功能的部分和结合样品条型码两者的单一官能团官能化。在一些情况下，封闭剂(例如，白蛋白)可以用于控制部分和样品条型码与珠的附接。在一些情况下，反应性官能团(例如，硫醇、胺、硫醇反应性，胺反应性或者点击化学官能团，或者甚至高反应性官能团，如异硫氰酸酯)可以用于帮助标记用封闭剂封闭的珠，只要所述官能团与细胞表面反应或者细胞提前透性化。这些官能团可以位于样品条型码上以帮助条型码化试剂或样品本身的标签化。作为另外一种选择，可以在溶液中提供或者可以通过珠表面上的螯合基团结合游离金属(例如，一组样品条型码同位素)。在某些方面，珠可以官能化以结合相同的样品条型码化试剂(或者被相同的样品条型码化试剂结合)，如在测定中用于条型码化细胞所使用的。在某些方面，样品条型码中的同位素的组合可以对于来自相同样品的珠和细胞是相同的。在一些情况下，可以(例如，使用封闭试剂，如BSA)封闭测定珠。在这些情况下，样品条型码可以结合至封闭试剂。

细胞的样品条型码化试剂可以包括(结合样品中的多种细胞类型或多个细胞的)元素标签化的抗体、官能化以非特异性结合至细胞(例如，通过共价相互作用)的元素标签和/或溶液中的金属。细胞的样品条型码化试剂还可以包括使样品条型码进入细胞的试剂(例如，DMSO、细胞透性化试剂，如去污剂或乙醇等)。测定条型码化珠的样品条型码化试剂可以存在于珠内，珠的表面上或者可以涂覆至珠。如果用于向珠应用，则样品条型码化试剂可以包含如本文所描述的官能团以结合至珠的表面(例如，以结合至珠所提供的官能团或者珠表面上存在的封闭试剂)。给定样品的样品条型码化试剂可以包括对该样品特异的独特的同位素组合。在某些方面，可以用相同测定条型码标记来自相同样品(例如，单个血液样品)的细胞和测定条型码化珠。用于细胞和珠的标记的相同测定条型码可以包含同位素的相同组合和/或相同的附接方式(例如，官能团)。

可以在混合物中或者与冷冻干燥的抗体组一起提供样品条型码化试剂。可以在混合物中或者与测定条型码化珠一起提供样品条型码化试剂。可以在混合物中或者与冷冻干燥的抗体组一起提供测定条型码化珠。可以在混合物中或者与冷冻干燥的抗体组(例如，当样品条型码化试剂结合测定条型码化珠和样品中的细胞两者时)一起提供测定条型码化珠和样品条型码化试剂。在以上某些实施方式中，可以在测定条型码化珠中、上或与之一起提供样品条型码化试剂。

在一些情况下，高反应性官能团(例如，硫醇、胺、硫醇反应性、胺反应性或点击化学官能团)可以用于帮助使用样品条型码的细胞标记。这些官能团可以位于样品条型码上以帮助标记条型码化试剂或样品本身。作为另外一种选择，可以在溶液中提供游离金属(例如，一组样品条型码同位素)，可以将其施用于细胞(例如，在存在如醇、去污剂和/或DMSO的试剂的情况下，以允许金属进入细胞)。

在一些情况下，用于测定条型码和样品条型码的元素标签可以包括元素标签化的冷冻干燥的组不常用的或者镧系家族以外的元素和/或同位素。例如，可以使用Pd或Te使测定条型码和/或样品条型码被条型码化。在一些情况下，用于测定条型码和/或样品条型码的元素标签可以是含有螯合至聚合物(例如，螯合至聚合物上的DOTA基团)或结合至镉结合蛋白的镉同位素的镉元素标签。

在一些情况下，可以提供在单一容器和分别含有独特的样品条型码的多个单独的容器中含有条型码化试剂，如珠的试剂盒。所述条型码化试剂可以或可以不包括测定条型码。用户可以将单独体积的这些条型码化试剂与要测试的不同样品混合。然后，可以将每个样品与独特的样品条型码混合，从而允许样品条型码结合至已在或结合至样品的条型码化试剂和/或结合至样品本身的细胞或颗粒。在清洗后，这种样品-条型码-标签化的样品将包括所有均包括相同的样品条型码，但具有或不具有测定条型码的条型码化试剂。因此，这种样品条型码可以用于识别这种具体样品的细胞或颗粒。可以通过其他样品及其他样品条型码实施相同方法，因此导致产生了一批多个样品-条型码-标签化的样品，其中每个样品被独特且可区分的条型码标签化。可选地，在一些情况下，当样品条型码本身可以直接靶向样品的细胞或颗粒时，可以在无单独的条型码化试剂的情况下使用样品条型码。

在一些情况下，可以存储具体样品及其样品条型码之间的关系，如存储在定位图中。可以通过研究或分析软件访问这种样品条型码信息以基于所检测的样品条型码的存在，自动将元素分析仪数据或其他结果归属于适合的样品。

在一些情况下，可以提供报告试剂以及测定试剂和/或用于检测结合至测定试剂的分析物的存在。在通过测定珠结合分析物之前或之后，报告试剂可以直接(特异性或非特异性)结合至样品中的分析物。报告试剂可以包括生物分子，如寡核苷酸(例如，杂交结合至测定条型码化珠的靶标RNA或DNA的寡核苷酸)或者亲合试剂(例如，抗体、凝集素或适体)。这种报告生物分子可以用于帮助识别研究期间条型码化试剂(例如，珠)和/或靶标颗粒的存在。报告试剂可以包括对于相同对象的所有报告试剂(例如，珠的所有报告试剂或者特定靶标分析物的所有报告试剂)通用，但是与其他元素标签(例如，样品条型码化元素标签)可区分的元素标签。每种报告试剂可以与特定对象，如条型码化试剂(例如，珠)或靶标分析物相关。所述报告试剂可以包括对于它们的相关对象具有靶向功能的抗体或其他部分。因此，当报告试剂与其他试剂(例如，条型码化试剂)或样品混合时，所述报告试剂可以用该报告试剂的元素标签对它们的相关对象标签化。当在通过元素分析研究期间检测该元素标签时，可以推断正在研究的颗粒属于与特定报告试剂相关的类型。例如，如果检测与条型码化珠的报告试剂有关的元素标签，则可以推断此时正在检测的对象并因此在该时间之前和之后的特定窗内检测的元素与该条型码化珠有关(例如，是与该珠内或上的元素标签有关的同位素)。如本文所使用的，细胞类型的报告试剂可以是冷冻干燥的抗体组的抗体形式。

报告生物分子可以包括元素标签(例如，聚合物链上或者包埋在珠内或珠上的一个或多个同位素的系列)。在一些情况下，报告试剂(如报告抗体)可以对与(例如，通过测定试剂，如珠的表面上存在的测定抗体结合的)特定测定试剂有关的游离分析物特异。所述报告抗体和测定抗体(例如，偶联至测定珠的抗体)可以是相同类型的抗体或者可以是不同类型的抗体。在一些情况下，如果所述报告抗体不同于测定抗体(例如，如果使用多克隆抗体)，则可以选择不干扰测定抗体与靶标分析物的结合的报告抗体。在一些情况下，报告试剂和测定试剂可以从两种不同的抗体(例如，单克隆抗体)产生，尽管不需要始终是这种情况。

当对于多个靶标分析物使用多种不同的测定试剂时，可以产生和/或使用多组报告试剂，每组含有相同的元素标签(例如，非同位素不同的元素标签)，但是偶联至元素标签的报告抗体不同。因此，尽管报告试剂组的多种报告抗体可以靶向多种不同的靶标分析物，但是它们均将使用与所有报告试剂有关的相同元素标签来标签化那些多种靶标分析物。作为另外一种选择或另外，报告试剂可以包括高灵敏度和低灵敏度元素标签，如本文中进一步描述的。

在一个实例中，可以提供具有一组10-12种不同的条型码化试剂的试剂盒，可以提供分别具有独特的测定条型码的所述条型码化试剂，可以单独提供一组6种不同的元素标签以用于随后与条型码化试剂和/或样品组合，可以提供与条型码化试剂一起包含或者与条型码化试剂分开且具有其自身独特的元素标签的条型码化试剂报告分子(例如，靶向条型码化试剂的报告试剂)并且可以与具有独特的元素标签的每个细胞报告分子一起提供一组30-40个细胞报告分子(例如，分别靶向特异性细胞类型的报告试剂)。可以根据需要调整每种试剂、条型码和/或报告分子的数目。

在一些情况下，可以将条型码化试剂和/或条型码冷冻干燥并包含在冷冻干燥的组中，如本文所描述的冷冻干燥的组中。

在一些情况下，可以通过制备具有测定条型码和样品条型码的一些独特组合的条型码化试剂，以预配置形式提供条型码化试剂。在此情况下，可以将每种独特的条型码化试剂保存在不同的容器中，如孔板的不同的孔中。在一个实例中，可以建立孔板，从而沿特定列(或行)的所有的孔共有相同的测定条型码，然而沿特定行(或列)的所有的孔共有相同的样品条型码。在另一个实例中，可以建立孔板，从而每个填充的孔含有具有特定独特的样品条型码和多种测定条型码的不同组合的条型码化试剂。因此，第一孔可以含有均具有第一样品条型码，但分别具有不同的测定条型码的条型码化试剂，并且第二孔可以含有均具有第二条型码，但分别具有不同的测定条型码的条型码化试剂。在一些情况下，预配置的条型码化试剂可以需要生产数千组独特的珠。

在一些情况下，可以通过制备具有独特的测定条型码和官能化以结合样品条型码的表面的条型码化试剂以半配置形式提供条型码化试剂(例如，珠)。在这些情况下，每组条型码化试剂可以偶联至具有与测定有关的靶向功能的部分(例如，抗体)，而测定与该条型码化试剂组的测定条型码有关。

当提供半配置的(semi-configured)条型码化试剂时，在将条型码化试剂与样品混合前，样品条型码可以结合至条型码化试剂。在一个实例中，可以将不同的条型码化试剂混合在一起，然后在一组容器(例如，孔板中的孔)中放置。然后，可以将独特的样品条型码添加至每个容器，并且可以将其结果与独特的样品混合以对该样品实施测定-条型码-可识别的测定并同时用样品条型码使样品标签化。

当提供半配置的条型码化试剂时，在将条型码化试剂与样品混合后，样品条型码可以结合至条型码化试剂。在一个实例中，可以将半配置的条型码化试剂提供在一起或另外混合在一起。然后，可以将条型码化试剂添加至一组样品中的每一个中。单独地，在添加条型码化试剂之前或之后，可以将独特的样品条型码与一组样品中的每一个混合。样品条型码可以使条型码化试剂和/或所述样品的细胞或颗粒标签化。

在实例情况下，条型码化试剂可以包括用聚多巴胺官能化以用于附接捕获抗体的测定条型码化珠。可以添加另一种分子(例如，抗生物素蛋白)以及捕获抗体。在将捕获抗体添加至测定条型码化珠之后，珠可以混合并对于每个样品分成等份。对于样品条型码，可以添加官能化(例如，用生物素)以结合分子的元素标签的独特组合。

在一些情况下，样品条型码可以偶联至报告分子以使得该报告分子能够起到报告分子和样品识别分子两者的功能。例如，用于报告具体细胞类型的抗体还可以起作用以识别该细胞类型与之有关的样品。在这种情况下，可以产生抗体及其独特的元素标签的多个拷贝，其中每个拷贝接受独特的样品条型码。然后，可以将每个拷贝提供给多个样品中的每一个。在清洗和研究后，独特的样品条型码的检测可以指示特定样品的存在，并且对于该抗体，独特的元素标签的检测可以表示其靶标在该样品中的存在。在一些情况下，可以产生多个抗体组(例如，冷冻干燥的抗体组)，其中通过该组的每个抗体与共有相同的独特同位素或相同的独特同位素的组合的样品条型码偶联，每个抗体组与特定样品条型码相关。在使用时，每个样品-条型码化的抗体组可以分别与不同的样品组合，然后在使用元素分析研究前，可以清洗样品并混合在一起。

在一些情况下，样品特异性抗体组可以包括具有元素标签的抗体，从而在用样品特异性抗体组染色后，存在于所述样品中的同位素的组合对于该样品是唯一的。换句话说，可以通过将独特的同位素组合在抗体组的多个抗体间分配来将样品条型码引入抗体组。

在某些方面，可以使用活细胞条型码(例如，基于硫醇反应性碲的条型码或广泛表达表面标志物的元素标签化的抗体)，其可以增加还使样品(例如，新鲜血液)中的活细胞条型码化的益处。例如，活细胞条型码可以包括特异性结合CD45的元素标签化的抗体。可以与活细胞(例如，PBMC)的刺激或另一种处理一起实施这种方法。在一些情况下，样品条型码可以能够使活细胞条型码化。在一些情况下，样品条型码可以对活细胞无损害，如对活细胞无毒。

本发明公开的某些方面可以对于除细胞计数以外的应用有用。例如，可以在附接至抗体结合的珠的寡核苷酸中编码测定和样品条型码两者，并且可以将具有寡核苷酸的报告抗体用于检测结合至珠的分析物。可以在液滴中和从珠上的测定/样品条型码寡核苷酸和报告抗体上的寡核苷酸所形成的反应产物中分离珠。可以通过测序检测这种反应产物，从而允许检测更高数目的样品和测定条型码。

本发明公开的某些方面允许现有测定不可用的益处，如深度免疫分型；T细胞谱绘制；由于对于其他白细胞(如B细胞、NK细胞、树突状细胞和单核细胞)捕获细胞频率的能力，对其他免疫谱系的广泛覆盖；单细胞水平的信息量的最大化，特别是使用所组合的全部标志物并因此无需在多个管之间进行推断；通过使用样品条型码，对技术差异度的控制能力；通过添加所关心的功能所需的任何组或组的亚组，深入研究所关心的功能的能力；提供覆盖大部分消费者的需要的证实的抗体混合物的能力，因此降低或消除了对证实稍有不同的混合物所浪费的时间和精力；和在无操作人员偏差的情况下，通过实现快速理解对特定目的调节数据分析的能力。

在实例使用的情况下，多家企业竞争首先上市下一代产品或标记扩增。它们的策略是在免疫-肿瘤学(I/O)中，作为“篮子试验(basket trials)”实施早期临床试验，其中将单一疗法或组合疗法应用于多种适应症(例如，癌症类型)并仔细检查患者的临床益处的微弱迹象。在这些加速试验背景中，每种样品是特别宝贵的并且使每种分析方法，包括流式细胞术的信息量最大化是至关重要的。另外，免疫疗法种类的不良事件是免疫-介导的，其中潜在的结局信息存在于基线与经治疗的免疫表型的比较。当组合使用时，这些不良事件复合，如在该类中几乎普遍接受为未来标准的，并且其中已起始大量临床试验来测试那些组合。因此，本发明公开的方面对于这些企业是特别有用的。

在实例使用的情况下，合同研究组织起到了多家企业的临床试验，包括如果不是全部至少大部分流式细胞测试的所选的执行通道的作用。本发明公开的方面对于这些研究组织可以是特别有用的，特别是由于所获得的成本和时间效率，以及如本文所描述的冷冻干燥的组的长期稳定性。

在另一个实例使用的情况下，大型癌症研究中心可以用作I/II期的临床试验地点，但是通常用经过批准的药物治疗患者。这些中心可以收集其他信息以支持开发新的生物标志物和诊断测试的研究。本发明公开的方面对于这些研究中心可以是特别有用的，特别是由于所获得的成本和时间效率，以及如本文所描述的冷冻干燥的组的长期稳定性。在一些情况下，本发明公开的某些方面可以用作可以在它们的机构中证实和使用的实验室-开发的测试的一部分。

提供这些说明性实例以向读者介绍本文所讨论的一般主题，并且这些说明性实例不意欲限制所公开的概念的范围。以下部分参考其中类似数字表示类似元素的附图描述了多种其他特征和实例，并且将定向描述(directional descriptions)用于描述说明性实施方式，但是与说明性实施方式类似，不应用于限制本发明公开。在本文中，在说明中包含的元素可以不按比例绘制。

图1是根据本发明公开的某些方面的元素标签化的部分102的示意图。图1所示的元素标签化的部分102是用元素标签106标签化的抗体104，尽管当用元素标签106标签化时，可以使用任何适合的部分。元素标签106可以是同位素或同位素的组合。在一些情况下，元素标签106可以是具有多种含金属侧基，如一些螯合基团的聚合物链。在一些情况下，独特的同位素的多个拷贝可以包含在单个元素标签106内。在一些情况下，独特的同位素组合的多个拷贝可以包含在单个元素标签106内，尽管不需要是这种情况。

元素标签化的部分102可以是如本文所公开的冷冻干燥的抗体组的一部分。抗体104可以是对所关心的靶标具有靶向功能的任何适合的抗体。通过将元素标签化的部分102与样品适当混合，抗体104可以结合至所述样品中的任何靶标，因此用元素标签106使样品标记或标签化。然后，在清洗以除去任何未结合的元素标签之后，可以使用元素分析研究这种染色的样品。通过元素分析仪对独特的同位素或独特的同位素的组合的检测可以指示元素标签106的存在，并因此指示元素标签化的部分102的存在，并因此指示元素标签化的部分102所结合的任何靶标的存在。

图2A是根据本发明公开的某些方面的条型码化试剂208以及单独的样品条型码212的示意图。条型码化试剂208可以是珠214，尽管可以使用其他条型码化试剂。珠214可以含有位于珠214内的测定条型码210，如引入珠214的核心中。测定条型码210可以是一类元素标签，其包括通过元素分析可区分的独特的同位素或者独特的同位素组合。在一些情况下，珠214可以包括含有、结合或官能化以结合多个部分，如样品条型码212、捕获抗体218和/或测定特异性生物分子250的表面216。

珠214的表面216可以结合或官能化以结合特定测定的亲合试剂，如特定捕获抗体218或特定测定特异性生物分子250，其可以是非抗体生物分子。所述亲合试剂可以结合至特定靶标(例如，蛋白或其他结构)，因此用测定条型码210使靶标标签化。因此，在清洗以除去任何未结合的条型码化试剂后，测定条型码210的检测指示了亲合试剂(例如，捕获抗体218或测定特异性生物分子250)与之结合的靶标的存在。

在一些情况下，珠214的表面216可以官能化以结合样品条型码212。样品条型码212可以是含有使用元素分析可辨别的独特的同位素或者独特的同位素组合的元素标签。可以存在多组样品条型码，其中所有样品条型码来自具有相同同位素或同位素组合的一个组，而所有样品条型码来自独特且使用元素分析彼此可区分的不同的组。因此，可以用来自相同组的样品条型码将一组任何数目的不同的条型码化试剂标签化，因此将那些条型码化试剂中的每一种与和该组样品条型码有关的样品相关联。单独地，可以用来自另一组的样品条型码将不同组的任何数目的不同的条型码化试剂标签化，因此将该不同组的条型码化试剂与另一组的样品条型码相关联。

可以与条型码化试剂208分开提供样品条型码212，如含有多种不同的样品条型码的试剂盒中一样。因此，当准备或实施使用条型码化试剂208的测定时，在测定之前(例如，在将两者与样品混合之前，通过混合样品条型码212和珠214)或测定期间(例如，通过将样品条型码212与样品混合，然后混合其中的珠214)，样品条型码212可以与条型码化试剂208混合。

图2B是根据本发明公开的某些方面，在样品条型码212的附接后，图2A所示的条型码化试剂208的示意图。在一些情况下，样品条型码212的附接可以发生在生产期间。在这些情况下，可以提供条型码化试剂208，如试剂盒的一部分，其中样品条型码212结合至或另外包含在珠214的表面216内。在一些情况下，在捕获抗体218和/或测定特异性生物分子250的附接前，可以将样品条型码212偶联至条型码化试剂208。

在一些情况下，可以作为准备实施测定的一部分(例如，在将两者与样品混合之前，通过混合样品条型码212和珠214)或者作为实施测定的一部分(例如，通过将样品条型码212与样品混合，然后混合其中的珠214)实施样品条型码212的附接。

图3是根据本发明公开的某些方面的条型码化试剂308以及整合的样品条型码312的示意图。条型码化试剂308可以是珠314，尽管可以使用其他条型码化试剂。珠314可以在珠314内含有测定条型码310和样品条型码312两者，如引入珠314的核心中。测定条型码310和样品条型码312可以分别是一类元素标签，其包括通过元素分析可辨别的其自身的独特的同位素或者独特的同位素组合。

在一些情况下，珠314可以包括含有、结合或官能化以结合多种附接，如捕获抗体318和/或测定特异性生物分子350的表面316。珠314的表面316可以结合或官能化以结合特定测定的亲合试剂，如特定捕获抗体318或特定测定特异性生物分子350，其可以是非抗体生物分子。所述亲合试剂可以结合至特定靶标(例如，蛋白或其他结构)，因此用测定条型码310使靶标标签化。因此，在清洗以除去任何未结合的条型码化试剂后，测定条型码310的检测指示了亲合试剂(例如，捕获抗体318或测定特异性生物分子350)与之结合的靶标的存在。

图4是根据本发明公开的某些方面，使用元素分析仪424和冷冻干燥的抗体组422测定一种或多种样品420的系统的示意图。样品420可以是任何适合的样品，其包括全血或人外周血，尽管可以使用任何适合的样品。样品420可以是生物样品。冷冻干燥的抗体组422可以是如本文所公开的冷冻干燥的抗体组或组的亚组。冷冻干燥的抗体组422可以含有多种元素标签化的抗体，如图1所示的元素标签化的抗体104。

根据适当的规程，冷冻干燥的抗体组422可以与样品420混合，从而再混悬冷冻干燥的抗体组422。在一些情况下，条型码化试剂408可以可选地与冷冻干燥的抗体组422和样品420混合。适合的条型码化试剂408的实例包括样品条型码化试剂和测定条型码化试剂。在一些情况下，多种样品420中的每一种可以与各组的条型码化试剂408混合，其中一组中的每种条型码化试剂含有相同的样品条型码，因此将独特的样品条型码应用于多种样品420中的每一种。

在与冷冻干燥的抗体组422混合后，可以使用元素分析仪424，如质谱分析仪研究样品420。在一些情况下，如图4所示，元素分析仪424可以包括包含电感耦合等离子体焰炬426和质量检测器428的ICP-MS，尽管可以使用其他元素分析仪。电感耦合等离子体焰炬426可以接受染色和/或元素标签化的样品420的细胞或颗粒并使样品电离。可以可选地处理(例如，过滤)所产生的离子流并传送至质量检测器428。质量检测器428可以是飞行时间检测器或者其他适合的质量检测器。质量检测器428可以基于离子质量确定离子流中多种同位素的存在和量。质谱分析仪428可以输出指示多种同位素随时间的存在和量的数据。元素分析仪424因此可以输出元素数据，其可以包括指示多种同位素随时间的存在和量的数据。在一些情况下，可以将元素数据作为元素数据482储存在数据存储库(datastore)中，其随后可以通过元素数据处理器430访问以用于进一步分析。在一些情况下，元素数据可以导向至元素数据处理器430以用于直接分析。在一些情况下，可以将元素数据处理器430引入元素分析仪，如元素分析仪的软件组件，尽管在一些情况下可以将元素数据处理器430引入单独的计算装置。

元素分析仪424可以获得与多种同位素随时间的存在和量有关的元素数据。在一些情况下，可以处理这种元素数据并分割成时间段，从而特定时间段(例如，时间窗)内的所有元素数据可以与通过元素分析仪424检测的单个细胞、珠或颗粒相关。例如，分析含有一百个细胞的样品420的元素分析仪424可以产生覆盖至少一百个不同的时间段的元素数据。因此，在特定窗内识别的所有同位素的集合可以用于解决结合与特定窗有关的特定细胞、珠或颗粒，检测到了哪些靶标或条形码。

在一些情况下，定位(mapping)数据384可以存储在数据存储库中，所述数据存储库可以是与其中存储元素数据482的数据存储库相同或不同的数据存储库。定位数据484可以包括将同位素或同位素的组合与特定靶标或对象相关的信息。定位数据484可以包括识别区分细胞类型的靶标的表达的信息，因此有助于自动细胞类型鉴定。例如，对于靶向CD20、CD45、CD14、CD16、CD8、CD3和CD4的元素标签化的抗体，定位数据484可以识别如用于标签化这些元素标签化的抗体中的每一种的各自同位素¹⁴⁷Sm、¹⁵⁴Sm、¹⁶⁰Gd、¹⁶⁵Ho、¹⁶⁸Er、¹⁷⁰Er和¹⁷⁴Yb，因此将每种同位素定位至各自靶标。可以通过元素数据处理器430访问定位数据484。

在一些情况下，定位数据484可以包括任何数目的冷冻干燥的抗体组的定位。可以手动(例如，通过用户选择)或自动(例如，通过组本身的直接采用或通过染色样品内的独特的条型码的检测)检测正在使用的冷冻干燥的抗体组(例如，冷冻干燥的抗体组422)，因此告知元素数据处理器430使用哪种定位。在一些情况下，元素数据482可以包括其他元数据，如使用哪种冷冻干燥的抗体组的鉴定。除了将冷冻干燥的抗体组的元素标签定位至靶标外，定位数据484可以包括其他元素标签向靶标的定位，如样品条型码向样品的定位，测定条型码向测定的定位和报告条型码向报告靶标的定位。可以以与如何确定冷冻干燥的抗体组的定位相同的方式确定这些其他定位的使用。

元素数据处理器430可以接受元素数据482和定位数据484。元素数据处理器430可以使用定位数据484分析元素数据482以获得有关样品的信息，如有关样品内的细胞或其他颗粒的细胞计数信息。在一些情况下，元素数据处理器430可以使用不同的样品条型码按样品分离结果。在一些情况下，元素数据处理器430可以基于冷冻干燥的抗体组422的靶标识别并定量细胞类型。在一些情况下，识别并定量细胞类型可以包括将设门方案应用于元素数据，如本文中进一步详细公开的。

元素数据处理器430可以以任何适合的方式，如本文所描述的那些方式输出结果。实例输出可以包括存储至数据存储库，在显示器上呈现；或者输入以进一步处理。元素数据处理器430可以输出任何适合的信息类型，如本文中所识别的那些。例如，元素数据处理器430可以输出细胞类型结果(例如，相对定量)；标志物强度(例如，在表型树中对每种细胞类型显示强度“颜色”的目视输出)；标志物频率、标志物强度和细胞计数；任何两种标志物的点图和/或任何标志物的柱状图；或者其他适合的信息。

图5是根据本发明公开的某些方面，显示未知颗粒520、521的分析和处理的示意图。对第一未知颗粒520和第二未知颗粒521进行元素分析524。显示时间箭头以显示在第二未知颗粒521之前分析第一未知颗粒520。在与适合的抗体组和/或试剂混合后，第一和第二未知颗粒520、521可以是样品颗粒，如图4所示的样品420。

元素分析524可以导致元素数据582可分成第一时间窗586和第二时间窗587。元素数据582可以含有与元素分析524期间，通过元素分析仪检测的同位素有关的信息。例如，元素数据582可以含有第一时间窗586中的同位素¹⁹⁷Au、¹³⁹La、¹⁹⁷Au、¹⁰⁶Pd和¹⁶⁵Ho和第二时间窗587中的同位素¹⁷⁰Er、¹⁴⁵Nd、¹⁰⁸Pd、¹⁶⁵Ho和¹⁵⁴Sm。第一时间窗586中识别的同位素可以可归因于第一未知颗粒520的电离和检测。第二时间窗587中识别的同位素可以可归因于第二未知颗粒521的电离和检测。

可以对元素数据582进行处理530以产生输出结果(例如，第一结果588和第二结果589)。可以使用元素数据处理器，如图4所示的元素数据处理器430发生的处理530可以利用定位数据584。

定位数据584可以含有基于所检测的元素标签识别靶标或条型码的信息。如图5所示，出于说明性的目的，在给定元素标签中使用了某些实例同位素，尽管可以使用其他元素标签及其他同位素。在一个实例中，细胞类型定位数据可以包括一些靶标(例如，CD3、CD4、CD61、CD45)和它们各自相关元素标签(例如，¹⁷⁰Er、¹⁴⁵Nd、¹⁶⁵Ho、¹⁵⁴Sm)；样品条型码数据可以包括一些样品(例如，第一、第二、第三、第四)和它们各自相关元素标签(例如，¹⁰⁶Pd、¹⁰⁸Pd、¹³⁰Te、¹²⁶Te)；测定条型码数据可以包括一些测定(例如，A、B、C、D)和它们各自相关元素标签(例如，¹³⁹La和¹⁴⁰Ce、¹³⁹La和¹⁵³Eu、¹³⁹La和¹⁶⁵Ho、¹³⁹La和¹⁷⁵Lu)；并且报告抗体数据可以包括一些靶标(例如，分析物1、分析物2、分析物3和分析物4)以及它们常见的相关元素标签(例如，¹⁹⁷Au)。在某些方面，报告抗体可以包括高灵敏度元素标签(例如，金纳米颗粒)和低灵敏度元素标签(例如，螯合至镧系原子的聚合物)。

来自第一时间窗586的同位素包括所检测的同位素¹⁹⁷Au的多种实例，因此可以推断第一未知颗粒520是靶标分析物(例如，分析物1、分析物2、分析物3、分析物4中的一种)。这种报告试剂可以用于仅靶向测定珠将靶向的靶标分析物。因此，可以推断第一未知颗粒520不是细胞，而是测定珠(例如，偶联至靶标分析物的测定珠)。该第一时间窗586中的另一个所检测的同位素包括¹³⁹La和¹⁶⁵Ho，这表明第一未知颗粒520可能是测定珠C。此外，第一时间窗586中所检测的同位素包括¹⁰⁶Pd，这表明第一未知颗粒520是第一样品的一部分。可以作为第一结果588的一部分提供该信息。

来自第二时间窗587的同位素不包括与报告抗体(所述报告抗体与测定珠的靶标有关)有关的任何同位素。然而，来自第二时间窗587的同位素包括¹⁷⁰Er、¹⁴⁵Nd、¹⁶⁵Ho和¹⁵⁴Sm，这表明第二未知颗粒521分别含有CD3、CD4、CD61和CD45。此外，可以推断第二未知颗粒521是细胞。通过充分的其他细胞类型的靶标信息，可以对细胞类型做出推断，如本文中进一步详细公开的。尽管第一时间窗586和第二时间窗587两者均包含¹⁶⁵Ho，但是报告抗体的缺乏和可选地其他细胞类型靶标(例如，CD3、CD4、CD45)的存在指示了所检测的¹⁶⁵Ho同位素来自细胞类型抗体，而不是来自测定条型码。最终，第二时间窗587中¹⁰⁸Pd同位素的存在指示第二未知颗粒521是第二样品的一部分。可以作为第二结果589的一部分提供该信息。

因此，尽管通过元素分析仪顺序分析了第一和第二未知颗粒520、521，但是元素数据的处理仍可以将颗粒520、521区分成它们各自的颗粒类型和它们各自的样品。

图6是根据本发明公开的某些方面，显示3种实例元素标签632、634、636的示意图和显示它们各自的元素数据的图638、640、642。每种元素标签632、634、636可以是如元素标签化的部分(例如，图1所示的元素标签化的部分102)、样品条型码(例如，图2所示的样品条型码212)或者测定条型码(例如，图2所示的测定条型码210)中所使用的元素标签。与各自元素标签632、634、636有关的图638、640、642显示了如通过研究含有各自元素标签632、634、636的样品的元素分析仪(例如，图4所示的元素分析仪424)所检测的，特定元素的表达的真实或相对强度。如本文所使用的，术语“元素A”、“元素B”或“元素C”是指可以用于标签化元素标签的一般元素，如金属。

元素标签632是单个同位素元素标签的实例。元素标签632包括元素A 644，并且不包括用于将该元素标签与其他元素标签(例如，元素标签632可以包括其他元素，如碳和氢，但是这些其他元素是结构性的，而不是出于区分的目的)相区分的其他元素。该元素标签632可以包括元素A 644的一种或多种实例，如同位素的n个不同的拷贝。通过元素分析仪的研究，元素标签632的元素数据可以显示元素A在对应于元素标签632中的元素A 644的n个拷贝的水平上的相对表达。

元素标签634是与元素标签632可区分的单个同位素元素标签的实例。元素标签634包括元素B 646。该元素标签634可以包括元素B 646的一种或多种实例，如同位素的y个不同拷贝。通过元素分析仪的研究，元素标签634的元素数据可以显示元素B在对应于元素标签634中的元素B 646的y个拷贝的水平上的相对表达。因此，元素标签634与元素标签634是同位素可区分的，因为检测了不同的同位素并且可选地因为在不同的相对表达检测了不同的同位素。

元素标签637是与元素标签632、634可区分的多个同位素元素标签的实例。元素标签637包括元素D 645、元素E 647和元素F 649。该元素标签637可以包括元素D 645、元素E647和元素F 649中的每一种的一种或多种实例。如图6所示，元素标签637含有元素D 645、元素E 647和元素F 649的y个不同拷贝。通过元素分析仪研究，元素标签637的元素数据可以显示元素标签637中的元素D、E和F的存在(例如，可选地相对表达)。因此，由于检测了独特的同位素组合，元素标签637与元素标签634、636是同位素可区分的。可以基于一系列所检测的同位素(例如，元素D、E和F)，可选地基于元素标签中所检测的同位素之间的相对表达和/或可选地基于当与其他元素标签相比，所检测的同位素的真实表达水平来识别独特组合。

元素标签636是与元素标签632、634、637可区分的多个同位素元素标签的实例。元素标签636包括元素A 644、元素B 646和元素C 648。该元素标签636可以包括元素A 644、元素B 646和元素C 648的一种或多种实例，如元素A 644的n个不同拷贝、元素B 646的y个不同拷贝和元素C 648的z个不同拷贝。通过元素分析仪研究，元素标签636的元素数据可以显示元素A、B和C在对应于元素标签636中各自元素的n、y和z个拷贝的水平上的相对表达。因此，由于检测了独特的同位素组合，元素标签636与元素标签634、636、637是同位素可区分的。可以基于一系列所检测的同位素(例如，元素A、B和C)，可选地基于元素标签中所检测的同位素之间的相对表达(例如，元素C的表达小于元素A的表达，元素A的表达小于元素B的表达)和/或可选地基于当与其他元素标签相比时，所检测的同位素的真实表达水平(例如，A:n、B:y、C:n可以与元素标签636相关，然而另一种元素标签可以与A:z、B:n、C:y相关)来识别独特组合。

因此，可以通过独特的单个同位素或独特的同位素组合产生多种独特的元素标签。在一些情况下，同位素的组合可以表示包含处于特定表达水平的单一同位素的组合，其可以与包含处于不同且可区分的表达水平的相同单一同位素的同位素的不同组合是可区分的。

可以将每个独特的同位素或同位素的组合认为是元素条型码，其可以用于识别它所偶联的任何部分。因此，当偶联至对特定靶标具有靶向功能的部分时，元素条型码可以在元素标签化的部分已接触含有靶标的样品或者已冲洗掉未结合的元素标签化的部分之后用于识别靶标。

基于元素分析的类型，特定数目的同位素可以是可靠地可区分的。例如，实例ICP-MS系统可以能够辨别多至x个不同的质量通道，因此能够可靠地辨别x种不同的同位素(例如，同位素1、2、3、4、5、……、x)。因此，可以仅基于确定元素标签中可检测的同位素的存在，对至少2^x种同位素的不同组合产生独特的条型码。在这些2^x不同组合中，可以期望除去可能在样品中检测的某些同位素组合。例如，如果将一组同位素或同位素组合在冷冻干燥的抗体组中用作元素标签或者在一组可能的冷冻干燥的抗体组中使用，则可以期望将完全不同的同位素用于样品条型码化和/或测定条型码化，以避免将同时或接近同时检测的抗体组合误解为不同的同位素组合的可能性。例如，元素标签636可以包括元素C 648，从而即使同时或接近同时检测元素标签632、634，分析仪或处理器将不会错误地将元素A和B的检测理解为元素标签636，因为未检测到元素C。在一些情况下，可以进一步保护元素标签636以避免通过未使用来自元素标签632、634的任何同位素的错误鉴定的可能性。

在一些情况下，将测定条型码和/或样品条型码配置以具有不相重叠的同位素，尽管不需要始终是这种情况。在一些情况下，测定条型码和/或样品条型码可以包括一组可能的同位素中的一些同位素的独特组合。例如，如果将总计6种不同的同位素用于样品条型码化，则每种样品条型码可以包括总计6种同位素中的3种的独特组合，因此导致产生了20种不同的独特的样品条型码。例如，当用于条型码的可能的独特的同位素的总数为n并且对每种条型码所选的独特的同位素的数目为k，则可能的独特的条型码的总数为

在一些情况下，用于细胞类型鉴定的元素标签含有一种或多种单一同位素，如元素标签632，634，因为通常测定将包括检测全部与单一细胞偶联的多个标签。在一些情况下，用于测定珠条型码化的元素标签含有独特的同位素组合，因为在单一时间窗内检测多种测定珠的可能性最小并因此检测重叠元素标签的概率最小。独特的同位素组合对于测定珠的使用允许以更少的独特的同位素实现更独特的元素标签。

图7是根据本发明公开的某些方面，用元素标签化的部分702、样品条型码712和条型码化试剂708标签化的样品细胞720的示意图。样品细胞720可以是样品的任何细胞，如血细胞。在一些情况下，代替样品细胞720，可以使用另一种颗粒或靶标，如存在于血液血浆中的蛋白(例如，白蛋白)。将图7所示的样品细胞720描述为通过元素标签化的部分702、样品条型码712和条型码化试剂708标签化，尽管在本文所描述的多种用途中，这种样品可以用这些对象中的一种、两种、全部三种或更多种的任意组合标签化。

元素标签化的部分702可以是任何适合的部分(例如，图1所示的元素标签化的部分102)，如冷冻干燥的抗体组的元素标签化的抗体。抗体704可以结合至元素标签706。抗体704可以通过任何适合的方式结合至样品细胞720，如结合至样品细胞720的表面上的抗原。在一些情况下，元素标签化的部分可以浸润样品细胞720(例如，透性化的样品细胞720)并结合至胞内靶标。

与元素标签化的部分702有关的元素标签706可以对具有相同抗体704的全部元素标签化的部分702是相同的，但是具有不同抗体的元素标签化的部分(例如，靶向不同靶标)可以具有独特的元素标签。

样品条型码712可以是直接或通过中间部分(例如，抗体)结合至样品细胞720的元素标签。样品条型码712可以设计以结合至所有、绝大部分或大部分样品的细胞或颗粒。每种样品条型码712可以在所有样品条型码712中具有相同的同位素或同位素组合。

图8是根据本发明公开的某些方面，显示用多种同位素样品条型码812标签化的样品细胞820的示意图。样品细胞820可以是图7所示的样品细胞720。样品条型码812可以与样品细胞820偶联。样品条型码812可以包括对于样品细胞820具有靶向功能(例如，对于胞内靶标的细胞表面靶标具有靶向功能)的抗体852。样品条型码812的抗体852可以偶联至包含与样品条型码812有关的独特的同位素组合的元素标签832。例如，样品条型码812可以具有“A、B、C”的假想条型码，其中A、B和C表示独特的同位素(例如，¹⁰²Pd、¹⁰⁴Pd、¹⁰⁵Pd)。

图9是根据本发明公开的某些方面，显示用分配的样品条型码部分911、912、913标签化的样品细胞920的示意图。样品细胞920可以是图7所示的样品细胞720。样品细胞920的分配的样品条型码部分911、912、913可以导致与图8所示的应用于样品细胞820的样品条型码812相同的应用于样品细胞920的整个条型码。

样品细胞920可以包括与之偶联的多个分配的样品条型码部分911、912、913。每种样品条型码部分911、912、913可以包括各自的抗体952、954、956，其分别偶联至各自的元素标签932、934、936。只要抗体均具有与相同的样品细胞920有关的靶向功能，则分配的样品条型码系统中的每种抗体952、954、956可以是相同的或者可以是不同的。例如，抗体952可以靶向CD45，抗体954可以靶向CD298，并且抗体956可以靶向b2m。整个样品条型码的同位素(例如，假想同位素“A、B和C”)可以在多个条型码部分911、912、913中分配。因此，元素标签932可以含有同位素A，元素标签934可以含有同位素B并且元素标签936可以含有同位素C。因此，当使用元素分析仪研究样品细胞920时，将检测相同的“A、B、C”的整个样品条型码，尽管整个样品条型码分配在多个条型码部分911、912、913中。

图10是根据本发明公开的某些方面的条型码化试剂1008和报告抗体1019的示意图。条型码化试剂1008可以是珠1014，尽管可以使用其他条型码化试剂。珠1014可以含有位于珠1014内的测定条型码1010，如引入珠1014的核心中。测定条型码1010可以是一类元素标签，其包括通过元素分析可辨别的独特的同位素或者独特的同位素组合。在一些情况下，珠1014可以包括含有、结合或官能化以结合多种附接，如样品条型码1012、捕获抗体1018和/或测定特异性生物分子的表面1016。

珠1014的表面1016可以结合或官能化以结合特定测定的亲合试剂，如特定捕获抗体1018或特定测定特异性生物分子，其可以是非抗体生物分子。所述亲合试剂可以结合至特定靶标分析物1020(例如，蛋白或其他结构)，因此用测定条型码1010使靶标分析物1020标签化。因此，在清洗以除去任何未结合的条型码化试剂后，测定条型码1010的检测指示了亲合试剂(例如，捕获抗体1018或测定特异性生物分子1050)与之结合的靶标分析物1020的存在。

在一些情况下，珠1014的表面1016可以结合、含有或官能化以结合样品条型码1012。样品条型码1012可以是含有使用元素分析可辨别的独特的同位素或独特的同位素组合的元素标签。结合至珠1014的特定样品条型码1012可以对于靶标分析物1020从中来源的样品是特异的。通过使用多组具有独特的同位素或同位素组合的样品条型码，可以使用其自身的样品条型码组测定每种原始样品(例如，与样品混合或者偶联至测定试剂1008，然后与样品混合)，并因此特定样品条型码1012的检测可以用于识别靶标分析物1020来源于哪种样品。

在一些情况下，可以使用报告试剂1090。报告试剂1090可以包括对于靶标分析物1020具有靶向功能的报告抗体1019。报告抗体1019可以偶联至含有同位素或独特的同位素组合的元素标签1032。与元素标签1032有关的同位素或独特的同位素组合的检测可以指示通过元素分析仪检测的颗粒，并因此在特定时间窗内检测的另一种同位素与靶标分析物1020有关，并因此与测定珠1014有关。

可以使用多种不同的报告试剂1090，每种试剂具有对于多种不同的靶标分析物具有靶向功能的不同类型的报告抗体，尽管所有报告试剂1090可以包括相同类型的元素标签(例如，相同的同位素或同位素组合)。因此，每种报告试剂1090将具有相同的元素标签1032。由于报告试剂1090的目的仅是确定是否通过元素分析仪研究特定对象(例如，测定珠1014)，因此不需要区分不同的报告试剂1090。

在一些情况下，报告抗体1019可以是与测定珠1014的捕获抗体1018相同类型的抗体(例如，单克隆抗体)。在一些情况下，报告抗体1019是与测定珠1014的捕获抗体1018不同类型的抗体(例如，多克隆抗体)，尽管报告抗体1019和捕获抗体1018两者均对靶标分析物1020具有靶向功能。

图11是根据本发明公开的某些方面，显示冷冻干燥的抗体组1166的制备的示意图。冷冻干燥的抗体组1168首先可以作为一组1100元素标签化的抗体组1152、1154、1156、1158开始。组1100可以包括任何数目的抗体组。每个抗体组可以包括共有相同抗体和相同元素标签的一种或多种元素标签化的抗体。对于靶向6种不同靶标的组，组1100可以包含6种不同的抗体组，其中每组含有多种单个元素标签化的抗体。

如本文所描述的，可以根据需要制备组1100的元素标签化的抗体组1152、1154、1156、1158。举例来说，可以单个滴定并在稳定剂中稀释元素标签化的抗体组1152、1154、1156、1158中的每一个以实现所期望的浓度。可以将所得溶液单独与赋形剂混合并混合在一起以形成混合物1164，可以将混合物放入容器1162，如管中。在一些情况下，可以将补充试剂1160添加至混合物1164。这些补充试剂1160可以包括能够冷冻干燥的任何试剂。例如，可以作为补充试剂1160添加裂解试剂(例如，红细胞裂解试剂)、清洗缓冲液、固定试剂和/或透性化试剂。在一些情况下，可以作为补充试剂1160将条型码化试剂，如测定条型码化试剂或样品条型码化试剂(例如，样品条型码)添加至混合物1164。在一些情况下，可以作为补充试剂1160或补充材料添加一种或多种校准材料(例如，校准珠)。

如本文所公开的，混合物1164可以经受冷冻干燥处理。例如，混合物1164可以经受加热阶段、抽真空阶段、干燥阶段和保持阶段。在加热阶段期间，温度可以在-60至0℃之间的某个温度保持一段持续时间，同时真空度保持在100-500托之间的范围内。在抽真空阶段期间，可以使真空度降低至100-500毫托之间的范围内。在干燥阶段期间，可以在-50至30℃之间的范围内操纵温度，同时将真空度保持在10-150毫托的范围内。在保持阶段期间，温度可以保持在10至30℃之间的温度，同时使真空度升高到100-500毫托之间的范围内。在保持阶段后，可以装回容器1162，这可以包括提高容器中的压力，如高达200托至760托的范围内，尽管在一些情况下，装回在低于环境压力的压力下发生。在一些情况下，在冷冻干燥的所有阶段期间，混合物1162的温度不升高到混合物1162的玻璃化转变温度以上。在装回期间或之后，容器1162可以填充惰性气体或干燥空气的内部气氛1170，然后密封。

在冷冻干燥后，容器1162可以含有组成冷冻干燥的组1166的冷冻干燥的混合物1168。可以储存该冷冻干燥的组1166，并随后再混悬用于染色样品。

图12是根据本发明公开的某些方面，用于制备条型码化试剂1276、1278的方法1200的示意图。方法1200可以从元素标签化的核心1272开始。元素标签化的核心1272可以包括任何适合的元素标签1210，如含有选自La、Ce、Eu、Ho和Lu的同位素的组合的元素标签1210。元素标签化的核心1272可以包括同位素作为固体金属核心的一部分或者螯合或另外包埋金属同位素的聚合物核心。

聚合物前体1273(例如，亚基)可以与元素标签化的核心1272反应以产生包含由聚合物壳体1275所围绕的元素标签化的核心1272的元素标签化的珠1274。这种元素标签化的珠1274可以与捕获抗体1218或测定特异性生物分子1250反应。

在一些情况下，具有聚合物壳体1275的元素标签化的珠1274可以与具有暴露的胺基(例如，在Fc区上)的捕获抗体1218反应，从而允许捕获抗体1218与聚合物壳体1275形成共价键，因此导致产生基于抗体的元素标签化条型码化试剂1276。

在一些情况下，具有聚合物壳体1275的元素标签化的珠1274可以与具有暴露的胺基的测定特异性生物分子1220反应，从而允许测定特异性生物分子1220与聚合物壳体1275形成共价键，因此导致产生基于生物分子的元素标签化条型码化试剂1278。

在一些情况下，可以用样品条型码，如使用包含能够结合至聚合物壳体1275，从聚合物壳体1275替换抗体1218或生物分子1250或者结合至条型码化试剂1276、1278上存在的其他官能团的高反应性官能团的样品条型码对基于抗体的元素标签化条型码化试剂1276和/或基于生物分子的元素标签化条型码化试剂1278进一步标签化。

图13是根据本发明公开的某些方面，显示用于染色和分析血液样品的方法1300的流程图。尽管对于全血样品的分析公开了方法1300，但是根据情况，方法1300的方面可以用于分析其他样品。

在方框1302，提供了全血样品。全血可以是人外周血，无论是新鲜还是冷冻的。在一些情况下，在可选的方框1304，可以用样品条型码1304使全血标签化。

在方框1306，可以分离来自全血样品的PBMC。可以使用任何适合的技术，如通过离心分离PBMC。在一些情况下，在方框1308，可以可选地用样品条型码使PBMC标签化。

在方框1310，可以使用冷冻干燥的组，如本文所公开的冷冻干燥的抗体组或组的亚组染色PBMC。在一些情况下，用冷冻干燥的组染色PBMC可以包括记录所使用的冷冻干燥的组的类型信息，可以检索所述信息以确定元素标签和靶标之间的组的定位。染色PBMC可以包括在一定温度将冷冻干燥的组与PBMC混合一段时间，然后从PBMC冲掉未结合的抗体。在一些情况下，在方框1312，可以可选地用样品条型码使染色样品标签化。

在可选的方框1313，可以发生进一步的细胞处理。进一步的细胞处理可以包括其他处理和/或染色步骤，如细胞固定、细胞透性化和/或胞内染色。方框1313处的进一步细胞处理可以发生在方框1312处的样品条型码化之后，尽管不需要始终是这种情况。

在方框1314，可以从全血样品分离血浆。可以使用任何适合的技术，如通过离心分离血浆。在一些情况下，在方框1316，可以可选地用样品条型码使血浆标签化。

在方框1318，将具有报告抗体的游离的分析物珠测定添加至等离子体。游离的分析物珠测定可以包括一种或多种具有测定条型码的条型码化试剂和用于靶向血浆的游离分析物的捕获抗体或测定特异性生物分子。因此，结合至游离分析物的捕获抗体或测定特异性生物分子可以用它们各自的测定条型码使那些游离分析物标签化。报告抗体的使用可以是可选的。报告抗体可以用于识别珠或分析物的存在。可以选择报告抗体以结合至所有、绝大部分或大部分珠或分析物。特定对象的所有报告抗体可以共有相同的元素标签，从而该元素标签的检测指示了该对象类型(例如，珠或分析物)的存在。在方框1318添加游离分析物珠测定可以包括在一定温度将血浆与游离分析物珠测定混合一段时间，然后从血浆冲掉未结合的珠。在一些情况下，在方框1320，可以可选地用样品条型码使染色的血浆标签化。

在可选的方框1322，可以将PBMC样品和血浆样品混合在一起。在一些情况下，如果在方框1304、1308、1312、1316和/或1320应用样品条型码化，则可以将来源于方框1302的全血的染色样品(例如，PBMC和/或血浆)与来自其他全血来源(例如，来自不同患者的全血或者来自相同患者，但在与来自方框1302的全血不同的时间采集的全血)的染色样品混合在一起。由于样品条型码化，混合样品的研究可以导致产生含有可以用于通过原始样品来源分离数据的独特的样品条型码的数据。

在方框1324，可以通过元素分析仪，如质谱分析仪(例如，ICP-MS)研究可选地在方框1322混合或不混合的染色样品(例如，PBMC和/或血浆)。方框1324的研究可以导致产生样品的元素数据。

在方框1326，可以自动分析样品的元素数据。方框1326的自动分析可以包括访问元素标签对靶标的定位图。方框1326的自动分析可以包括识别样品的细胞或颗粒。方框1326的自动分析可以包括基于与样品条型码有关的所检测的元素标签，将识别的细胞或颗粒与特定样品相关。方框1326的自动分析可以包括基于所检测的测定条型码，将识别的细胞或颗粒与特定测定相关。方框1326的自动分析可以包括基于检测与一种或多种特定标志物有关的元素标签，将识别的细胞或颗粒与一种或多种特定标志物相关。在一些情况下，方框1326的自动分析可以包括基于相关标志物识别一类细胞或颗粒。在一些情况下，方框1326的自动分析可以包括产生含有与样品中细胞或细胞类型的定量或鉴定有关的信息的输出。方框1326的自动分析可以包括从如本文所公开的元素数据产生任何适合的输出。

某些方法和试剂盒可以仅包括图13中所描述的方框的亚组。例如，可以不实施样品条型码化，尽管来自相同样品的细胞和测定珠仍可以在研究前混合。作为另外一种选择，可以在研究前的任何步骤实施细胞和/或测定珠(例如，单独或混合)的样品条型码化，并且可以在样品条型码化之后和研究之前的任一点实施来自不同样品的细胞和/或测定珠的混合。例如，可以在任何步骤引入样品条型码，并在任何随后的步骤进行样品的混合。血清和血浆中的PBMC可以不分离，并且作为替代可以应用于元素标签化的抗体和测定条型码化珠的冷冻干燥的混合物，从而允许更流水线的工作流程(尽管细胞染色的质量可能由于游离分析物的丰度而降低)。可以与冷冻干燥的混合物一起混合包括样品条型码，或者可以单独提供样品条型码(用于在用冷冻干燥的组染色之前或之后添加至所述样品)。在某些方面，可以在步骤1302中提供组织样品或细胞培养物以代替全血，并且步骤1306中的细胞分离是可选的。在某些方面，步骤1318是包含除抗体以外的生物分子的报告试剂的添加。在其中研究细胞而非测定珠的实例中，方法可以(依次)包括步骤1302、1308、1310、可选地1313、1324和1326。在其中研究测定珠而非细胞的实例中，方法可以(依次)包括步骤1302、1314、1316、1322和1324。在一些实例中，可以与珠测定的添加分开(之前或之后)添加报告抗体，如在珠测定的添加之后，中间具有清洗步骤。在一些实例中，在方框1310之前使细胞透性化并且冷冻干燥的组的染色包括抗胞外和胞内靶标两者的抗体。在某些实例中，在分别添加冷冻干燥的组和珠测定之前将细胞(例如，PBMC)和游离分析物(例如，血浆)分离，并在样品条型码化和样品间混合之前合并。在一些情况下，在添加至冷冻干燥的组之前使细胞样品条型码化和混合。

图14是根据本发明公开的某些方面，显示用于自动分析元素数据的实例设门策略1400的示意图。实例设门策略1400包括3层设门，尽管可以使用任何数目的层。将多种2-维空间用于显示在使用元素分析研究的样品中检测的细胞或颗粒。与细胞或颗粒一起的同位素或标志物的存在越高，则显示细胞或颗粒的点将在空间中的更右侧(在x轴上)或更上方(在y轴上)出现。用x和y轴上的同位素标记图14中显示的空间，尽管应理解每个同位素可以表示特定标志物，如抗体或抗体的靶标。另外，可以沿轴使用同位素组成，而不是单个同位素，如当同位素组成用于使特定标志物标签化时。尽管出于说明性目的将这些2-维空间描述为点图，但是可以以任何适合的方式存储和操纵所述信息以实现所期望的设门策略。

在第一层中，在2-维空间1402中显示了来自样品的元素数据，其中同位素A在x轴上而同位素B在y轴上。该空间1402可以包括两个门1414、1416。与同位素A和同位素B的高值有关的对象(例如，细胞或颗粒)可以落入门1414内，而与同位素A和同位素B的低值有关的对象可以落入门1416内。在一些情况下，可以将门1414内的对象和/或门1416内的对象标记为特定类型的细胞或对象。

在第二层中，门1414内的对象可以在空间1404上作图，而来自门1416的对象在空间1410上作图。空间1404可以将同位素C在x轴上作图并且将同位素D在y轴上作图。空间1404可以设门以将对于同位素D具有高值且对于同位素C具有低值的对象分离到门1418内，而将对于同位素D具有低值且对于同位素C具有高值的对象分离到门1420内。在空间1410中，可以对来自空间1416的对象作图，其中同位素E位于x轴上而同位素F位于y轴上。空间1410可以含有单个门1440，它与具有同位素E和F两者的高值的对象有关。在一些情况下，可以将门1418、1420和/或1440内的对象标记为特定类型的细胞或颗粒。

门1418、1420和/或1440内的对象可以传递至第三层。在第三层中，将门1418内的对象在空间1406上作图，将门1420内的对象在空间1408上作图，并且将门1440内的对象在空间1412上作图。在空间1406中，可以将对象作图，其中同位素G位于x轴上而同位素H位于y轴上。可以对这些对象设门，其中门1422与用于同位素G和H两者具有高值的那些对象有关，而门1424与对于同位素H具有高值且对于同位素H具有低值的那些对象有关。可以将门1422和/或门1424中的对象标记为特定类型的对象。在空间1408中，对来自空间1420的对象作图，其中同位素C位于x轴上而同位素B位于y轴上。可以对这些对象设门，其中门1426与对于同位素B具有高值而对于同位素C具有中值的那些对象有关，门1428与对于同位素B具有中-高值而对于同位素C具有低值的那些对象有关，并且门1430与对于同位素B具有中值而对于同位素C具有低值的那些对象有关。可以将门1426、1428和/或1430中的对象标记为特定类型的对象。在空间1412中，对来自空间1440的对象作图，其中同位素F位于x轴上而同位素D位于y轴上。可以对这些对象设门，其中门1442与对于同位素F和D具有高值的那些对象有关，门1444与对于同位素D具有中-高值且对于同位素F具有高值的那些对象有关，门1446与对于同位素D具有中低值且对于同位素F具有高值的那些对象有关，并且门1448与对于同位素D和F具有低值的那些对象有关。可以将门1442、1444、1446和/或1448中的对象标记为特定类型的细胞或对象。

因此，设门方案可以包括确定其中数据可以可归因于特定结果的多维空间(例如，2-维空间)中的限定区域。设门方案可以包括随后基于新的多维空间(例如，不同的2-维空间)对上述限定区域内的数据应用连续的门。可以根据需要重复该过程以实现所期望的区分水平。因此，连续设门水平可以基于多种标志物的存在或不存在，帮助缩小特定细胞类型或对象类型。由于独特的细胞类型或对象类型将具有不同的表面标志物和/或胞内标志物组合，因此可以限定设门策略以基于多种标志物的存在或不存在识别这些多种细胞类型或颗粒类型。

在一些情况下，代替限定区域，可以根据具有大于或小于阈值数的标志物表达对细胞或颗粒设门。例如，对于给定靶标(例如，CD45)的高表达的指示可以表示为处于或大于特定阈值的任何表达。在一些情况下，可以将不同阈值在不同设门方案水平上用于相同靶标，或者当来源于不同先前的门时，在相同设门方案水平上用于相同靶标。

在一个实例中，可以使用定位数据将元素数据转化为靶标表达。对于细胞样品，可以在其中CD45的靶标表达在y轴上而CD66b的靶标表达在x轴上的2维空间中分析数据。空间左上角中的区域指示了CD45的高表达和CD66b的低或无表达。可以基于CD56和CD14的靶标表达，在新的空间中进一步分析落在左上角中的细胞。落在空间左下角的细胞可以指示CD56或CD14中的任一种的很少至无表达。可以基于y轴上CD19和x轴上CD3的靶标表达，在新空间中进一步分析落在该区域内的细胞。落在左上轴中的细胞可以指示高CD19表达和低或无CD3表达。可以将落在该区域的细胞鉴别为B细胞。该实例设门策略可以表示为CD45+CD66b-；CD56-CD14-；CD19+CD3-。在一些情况下，可以沿其他维度进一步分析该区域中的细胞以确定有关那些细胞的其他特征。

使用来自以上实例的设门策略表示法，适合用于冷冻干燥的抗体组的其他设门策略包括用于标识以下细胞类型的以下策略。对于CD8 T细胞(总；CD161lo/-)：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4-CD8+；CD8+CD161lo/-。对于CD4 T细胞(总)：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-。对于Treg：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CCR4+；CD45RA-CD45RO+；CD25hiCD127lo/-。对于γ-δT细胞，CD4-CD8-：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD4-CD8-；CD3+TCRgd+。对于总B细胞：CD45+CD66b-；CD56-CD14-；CD19+CD3-。对于总NK细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD14-；CD45RA+CD123-；CD45+CD56+。对于嗜中性白细胞：CD45loCD66b+；CD294-CD16+。对于总单核细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD56-；CD11c+HLA-DR+；CD14+/-CD11c+。对于浆细胞样树突状细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD14-；HLA-DR+CD56+/-；CD123+CD11c-。对于初始CD8 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4-CD8+；CD8+CD161lo/-；CD8+CCR7hi；CD45RA+CD45RO-。对于初始CD4 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CCR7hi；CD45RA+CD45RO-。对于Th1-样：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CXCR5-；CD4+CCR4-；CD45RA-CD45RO+；CXCR3+CCR6-。对于MAIT/NKT CD4-细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+CD4-；CD28+CD161hi。对于初始B细胞：CD45+CD66b-；CD56-CD14-；CD19+CD3-；CD19+CD27+。对于早期NK细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD14-；CD45RA+CD123-；CD45+CD56+；CD56+CD57-。对于嗜曙红细胞：CD45loCD66b+；CD294+CD16-。对于经典单核细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD56-；CD11c+HLA-DR+；CD14+/-CD11c+；CD38+CD14hi。对于脊髓树突状细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD14-；HLA-DR+CD56+/-；CD123-CD11c+；CD11c+CD38+。对于中央记忆CD8 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4-CD8+；CD8+CD161lo/-；CD8+CCR7hi；CD45RA-CD45RO+。对于中央记忆CD4 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CCR7hi；CD45RA-CD45RO+。对于Th2-样：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CXCR5-；CD45RA-CCR4+；CXCR3-CCR6-。对于记忆B细胞：CD45+CD66b-；CD56-CD14-；CD19+CD3-；CD19+CD27+。对于晚期NK细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD14-；CD45RA+CD123-；CD45+CD56+；CD56+CD57+。对于嗜碱细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD56-；HLA-DR-CD11c-；CD123+CD294+。对于中间单核细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD56-；CD11c+HLA-DR+；CD14+/-CD11c+；CD38lo/-CD14int。对于效应记忆CD8 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4-CD8+；CD8+CD161lo/-；CD8+CCR7lo/-；CD8+CD27+。对于效应记忆CD4 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CCR7lo/-；CD45RA-CD45RO+；CD45RO+CD27+。对于Th17-样：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CXCR5-；CD45RA-CCR4+；CXCR3-CCR6+。对于浆母细胞：CD45+CD66b-；CD56-CD14-；CD19+CD3-；CD19+CD27+；CD38+CD20-。对于非经典单核细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD3-CD56-；CD11c+HLA-DR+；CD14+/-CD11c+；CD38-CD14-。对于终末效应CD8 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4-CD8+；CD8+CD161lo/-；CD8+CCR7lo/-；CD8+CD27-。对于终末效应CD4 T细胞：CD45+CD66b-；CD19-CD20-；CD14-CD11c-；CD45+CD3+；CD3+TCRgd-；CD4+CD8-；CD4+CCR7lo/-；CD45RA-CD45RO+；CD45RO+CD27-。

图15是根据本发明公开的某些方面，显示用于样品标记条型码化试剂和分析一组样品的技术1500的示意图。提供了一组条型码化试剂1592。一组条型码化试剂1592可以包括可选地用测定条型码元素标签化的，用于任何数目的测定的任何数目的条型码化试剂(例如，如图2中的条型码化试剂208)。一组条型码化试剂1592可以包括具有多种不同捕获抗体和/或测定特异性生物分子的条型码化试剂。可以提供3组样品条型码1586、1588、1590。尽管图15描述了3组样品条型码1586、1588、1590的使用，但是可以使用任何数目的样品条型码组，其可以通过可用的样品条型码组的数目和/或正在测定的不同的样品的数目提前确定。样品条型码1586、1588、1590组中的每一个可以含有一些相同的样品条型码，从而第一组样品条型码1586的样品条型码是全部相同的并且全部独特于第二组样品条型码1588，第二组样品条型码本身是全部相同的并且全部独特于第三组样品条型码1590，第三组样品条型码本身是全部相同的。可以作为试剂盒或者作为包含冷冻干燥的组的试剂盒的一部分提供3组样品条型码1586、1588、1590和/或1组条型码化试剂1592。

样品条型码1586、1588、1590组可以单独与条型码化试剂1592组的等份合并。条型码化试剂1592组的每个等份可以含有来自条型码化试剂1592组的所有不同类型的条型码化试剂的混合物。由于样品条型码1586、1588、1590组与各个等份中的条型码化试剂1592组的合并，可以产生3组样品编码的条型码化试剂1593、1594、1595。样品条型码1586、1588、1590可以偶联至条型码化试剂1592或者可以仅与条型码化试剂1592混合。因此，第一组样品编码的条型码化试剂1593可以含有全部用来自第一组样品条型码1586的样品条型码标签化或与之混合的条型码化试剂；第二组样品编码的条型码化试剂1594可以含有全部用来自第二组样品条型码1588的样品条型码标签化或与之混合的条型码化试剂；并且第三组样品编码的条型码化试剂1595可以含有全部用来自第三组样品条型码1590的样品条型码标签化或与之混合的条型码化试剂。当将样品条型码1586、1588、1590用于标签化条型码化试剂1592时，可以从每种混合物清洗过量的样品条型码。

样品编码的条型码化试剂1593、1594、1595组中的每一个可以与各自样品1596、1597、1598混合以标签化样品1596、1597、1598。在清洗未结合的条型码化试剂(和可选地，未结合的样品条型码)后，可以将样品1596、1597、1598合并成混合的样品1599。

可以使用元素分析研究混合的样品1599，如使用元素分析仪(例如，图4所示的元素分析仪424)。可以分析所产生的元素数据1582以检测与来自3组样品条型码1586、1588、1590的样品条型码有关的元素标签的存在，并因此识别样品条型码与之相关的单个样品(例如，分别地，样品1596、1597、1598)。自动分析仪或处理器(例如，图4的元素数据处理器430)可以将通过元素分析仪采集的元素数据1582自动分成样品A数据1585(例如，与样品A1596有关的元素数据，将其用来自样品条型码1586组的样品条型码标签化)、样品B数据1587(例如，与样品B 1597有关的元素数据，将其用来自样品条型码1588组的样品条型码标签化)和样品C数据1589(例如，与样品C 1598有关的元素数据，将其用来自样品条型码1590组的样品条型码标签化)。

因此，可以合并多种样品并同时分析，这可以改善整体研究效率并且可以帮助改善样品间数据的可靠性，因为它们全是在相同运行期间研究的。

图16是根据本发明公开的某些方面，显示用于样品标记和分析一组样品的技术1600的示意图。提供了一组条型码化试剂1692。一组条型码化试剂1692可以包括可选地用测定条型码元素标签化的，用于任何数目的测定的任何数目的条型码化试剂(例如，如图2中的条型码化试剂208)。一组条型码化试剂1692可以包括具有多种不同捕获抗体和/或测定特异性生物分子的条型码化试剂。可以提供3组样品条型码1686、1688、1690。尽管图16描述了3组样品条型码1686、1688、1690的使用，但是可以使用任何数目的样品条型码组，其可以通过可用的样品条型码组的数目和/或正在测定的不同的样品的数目提前确定。样品条型码1686、1688、1690组中的每一个可以含有一些相同的样品条型码，从而第一组样品条型码1686的样品条型码是全部相同的并且全部独特于第二组样品条型码1688，第二组样品条型码本身是全部相同的并且全部独特于第三组样品条型码1690，第三组样品条型码本身是全部相同的。可以作为试剂盒或者作为包含冷冻干燥的组的试剂盒的一部分提供3组样品条型码1686、1688、1690和/或1组条型码化试剂1692。

样品条型码1686、1688、1690组可以单独与各自样品1696、1697、1698合并。在一些情况下，如如果样品条型码设计以结合样品本身的细胞或颗粒，则可以清洗样品1696、1697、1698以除去任何未结合的样品条型码。然后，可以将样品1696、1697、1698混合在一起成混合的样品1699，所述混合的样品可以与条型码化试剂1692组合并。然后，可以清洗未结合的条型码化试剂并且可以使用元素分析，如使用元素分析仪(例如，图4所示的元素分析仪424)研究混合的样品169。可以分析所产生的元素数据1682以检测与来自3组样品条型码1686、1688、1690的样品条型码有关的元素标签的存在，并因此识别样品条型码与之相关的单个样品(例如，分别地，样品1696、1697、1698)。自动分析仪或处理器(例如，图4的元素数据处理器430)可以将通过元素分析仪采集的元素数据1682自动分成样品A数据1685(例如，与样品A 1696有关的元素数据，将其用来自样品条型码1686组的样品条型码标签化)、样品B数据1687(例如，与样品B 1697有关的元素数据，将其用来自样品条型码1688组的样品条型码标签化)和样品C数据1689(例如，与样品C 1698有关的元素数据，将其用来自样品条型码1690组的样品条型码标签化)。

因此，可以将多种样品合并在一起进行测定(例如，使用来自条型码化试剂1692组的条型码化试剂测定)并同时分析，其可以改善测定效率、整体研究效率并且可以帮助改善样品间数据的可靠性，因为它们全是在相同运行期间测定和研究的。

在一些情况下，类似于参考图15所述的技术1500，在清洗然后混合成混合的样品1699之前，来自3组样品条型码1686、1688、1690的样品条型码和它们各自样品1696、1697、1698的每种组合可以单独与条型码化试剂1692组的等份合并。

图17是根据本发明公开的某些方面，显示制备一组预配置的样品条型码标记的条型码化试剂的技术1700的示意图。提供了一组条型码化试剂1792。一组条型码化试剂1792可以包括可选地用测定条型码元素标签化的，用于任何数目的测定的任何数目的条型码化试剂(例如，如图2中的条型码化试剂208)。一组条型码化试剂1792可以包括具有多种不同捕获抗体和/或测定特异性生物分子的条型码化试剂。可以提供3组样品条型码1786、1788、1790。尽管图17描述了3组样品条型码1786、1788、1790的使用，但是可以使用任何数目的样品条型码组，其可以通过可用的样品条型码组的数目和/或正在测定的不同的样品的数目提前确定。样品条型码1786、1788、1790组中的每一个可以含有一些相同的样品条型码，从而第一组样品条型码1786的样品条型码是全部相同的并且全部独特于第二组样品条型码1788，第二组样品条型码本身是全部相同的并且全部独特于第三组样品条型码1790，第三组样品条型码本身是全部相同的。可以作为试剂盒或者作为包含冷冻干燥的组的试剂盒的一部分提供3组样品条型码1786、1788、1790和/或1组条型码化试剂1792。

如图17所示，条型码化试剂1792组含有7种不同类型的条型码化试剂(例如，试剂t至z)。每种不同类型的条型码化试剂代表具有独特测定条型码和独特捕获抗体或测定特异性生物分子的条型码化试剂。条型码化试剂1792组的每个不同类型的条型码化试剂可以沿孔板1785的各个列分配在一些孔中。因此，沿所述列的每个孔中共有相同类型的条型码化试剂，然而行间的每个孔含有不同的条型码化试剂。

样品条型码1786、1788、1790的每个组可以沿孔板1785的各个行分配。因此，每个孔沿行共有相同的样品条型码，然而每个孔沿列含有不同的样品条型码。

由于样品条型码和条型码化试剂在孔板1785的孔中的组合，每个孔将含有样品条型码和条型码化试剂的独特组合(例如，t:A；u:B至z:C)。样品条型码可以可选地结合至相同孔内的条型码化试剂，或者可以简单地维持在混合物中以用于未来结合至样品细胞或颗粒。

因此，可以产生样品条型码和条型码化试剂的一组独特组合。基于用户需要，可以将样品条型码和条型码化试剂的独特组合的组中的一些或全部提供给一种或多种样品以标记样品并根据需要实施测定。

仅出于说明和描述的目的提供了实施方式的以上描述，包括所说明的实施方式，并且实施方式的以上描述不旨在是穷举的或者受限于所公开的准确形式。其多种修改、改进和使用将对本领域技术人员是显而易见的。

如以下所使用的，任何对一系列实施例的提及将被理解为单独对那些实施例中的每一个的提及(例如，“实施例1至4”将被理解为“实施例1、2、3或4”)。

实施例1是用于元素分析的组，其包含：多种缀合抗体，其中用不同的元素标签使多种缀合抗体中的每一种标签化，其中基于其同位素组成，每种不同的元素标签是可区分的，并且其中多种缀合抗体处于冷冻干燥的混合物中。

实施例2是根据实施例1所述的组，其中多种缀合抗体包括来自以下列表的两种或更多种抗体，列表包含：Cd45、CD45RA、CD45RO、Cd123、CD4、CD8a、CD11C、CD57、CXCR3、CD185、CD38、CD56、CD3、CD20、CD66b、HLA-DR、IgD、CD27、CD28、CD127、CD19、CD16、CD161、CD194、CD25、CD294、CD197、CD14、CCR6和TCRδγ。

实施例3是根据实施例1或2所述的组，其中大部分缀合抗体对人外周血中的细胞类型特异。

实施例4是根据实施例1至3所述的组，其中大部分缀合抗体对细胞表面标志物特异。

实施例5是根据实施例1至4所述的组，其中多种缀合抗体在冷冻干燥的混合物中包含十种或以上的缀合抗体。

实施例6是根据实施例1至5所述的组，其中每种不同的元素标签包含一种同位素的多个元素原子。

实施例7是根据实施例1至6所述的组，其中用具有单个元素的不同同位素的不同的元素标签将多种缀合抗体的至少两种缀合抗体标签化。

实施例8是根据实施例1至7所述的组，还包含与其他元素标签偶联的生物分子，其中所述生物分子不是抗体，并且其中基于其同位素组成，所述其他元素标签与每种不同的元素标签是可区分的。

实施例9是根据实施例1至8所述的组，还包含非抗体含金属部分，其包含基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的金属同位素。

实施例10是根据实施例1至9所述的组，其中每种不同的元素标签包含原子量大于80amu的金属元素。

实施例11是根据实施例1至10所述的组，其中每种不同的元素标签包含螯合金属。

实施例12是根据实施例1至11所述的组，其中每种不同的元素标签包含对于人外周血非内源的元素。

实施例13是根据实施例1至12所述的组，其中组具有处于或小于按重量计5％的含水量。

实施例14是根据实施例1至12所述的组，其中组具有处于或小于按重量计3％的含水量。

实施例15是根据实施例1至12所述的组，其中组具有处于或小于按重量计1％的含水量。

实施例16是根据实施例1至12所述的组，其中组具有处于或在按重量计0.05至1％之间的含水量。

实施例17是根据实施例1至16所述的组，还包含冷冻干燥的嵌入剂，其中冷冻干燥的嵌入剂包含在冷冻干燥的混合物中。

实施例18是根据实施例1至17所述的组，还包含冷冻干燥的校准材料，其中冷冻干燥的校准材料包含已知量的一种或多种已知的同位素，并且其中冷冻干燥的校准材料包含在冷冻干燥的混合物中。

实施例19是根据实施例1至18所述的组，还包含补充试剂，其中所述补充试剂可用于实施使用多种缀合抗体的测定，其中所述补充试剂是冷冻干燥的，并且其中所述补充试剂包含在冷冻干燥的混合物中。

实施例20是用于与元素分析一起使用的测定试剂盒，其包含：密闭容器；和根据实施例1至19所述的组，其中组的冷冻干燥的混合物储存在所述密闭容器内。

实施例21是根据实施例20所述的测定试剂盒，其中所述密闭容器包含惰性气体或干燥空气的内部气氛。

实施例22是根据实施例20或21所述的测定试剂盒，其中多种缀合抗体包含对细胞表面标志物特异的第一抗体和对胞内靶标特异的第二抗体。

实施例23是根据实施例20至22所述的测定试剂盒，还包含：其他密闭容器；和其他抗体组，所述其他抗体组包含用基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的其他不同的元素标签进行标签化的至少一种其他缀合抗体，其中所述其他缀合抗体是冷冻干燥的并且储存在其他密闭容器内。

实施例24是根据实施例23所述的测定试剂盒，其中多种缀合抗体包含对一种或多种细胞表面标志物特异的抗体，并且其中所述其他缀合抗体对胞内靶标特异。

实施例25是根据实施例20至24所述的测定试剂盒，还包含嵌入剂，嵌入剂包含基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的其他不同的元素标签。

实施例26是根据实施例20至25所述的测定试剂盒，还包含用于标记多种样品的多种样品条型码化试剂，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含同位素的不同组合。

实施例27是根据实施例26所述的测定试剂盒，还包含多个容器，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含在多个容器的不同容器内。

实施例28是根据实施例26或27所述的测定试剂盒，其中多种样品条型码化试剂中的每一种结合至样品中的大部分细胞。

实施例29是根据实施例26至28所述的测定试剂盒，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含官能化以共价结合在样品的细胞上或细胞内的元素标签。

实施例30是根据实施例26至29所述的测定试剂盒，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含特异性结合样品中大部分细胞上存在的靶标或者一起结合样品中大部分细胞的多种靶标的样品条型码化抗体。

实施例31是根据实施例30所述的测定试剂盒，其中样品条型码化抗体中的每一种特异性结合CD45、CD298和b2m中的一种或多种。

实施例32是根据实施例30或31所述的测定试剂盒，其中当使用元素分析仪分析时，样品条型码化抗体的元素标签提供了比组中大部分其他抗体的元素标签更弱的信号。

实施例33是根据实施例26至32所述的测定试剂盒，其中所述同位素的不同组合包含镉。

实施例34是根据实施例26至33所述的测定试剂盒，其中所述同位素的不同组合包含顺铂中的铂。

实施例35是根据实施例26至34所述的测定试剂盒，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含一组样品条型码化抗体，其中每种样品条型码化抗体包含所述同位素的不同组合的所有同位素。

实施例36是根据实施例26至35所述的测定试剂盒，其中多种样品条型码化试剂中的每一种能够使活细胞条型码化，并且其中多种样品条型码化试剂中的每一种对所述活细胞无毒。

实施例37是根据实施例20至36所述的测定试剂盒，还包含测定条型码化试剂，测定条型码化试剂包含用于检测不同分析物的其他抗体，其中每种测定条型码化试剂包含同位素的不同组合。

实施例38是根据实施例37所述的测定试剂盒，其中每种测定条型码化试剂是包含所述同位素的不同组合的测定条型码化珠。

实施例39是根据实施例38所述的测定试剂盒，其中测定条型码化试剂包含在组的冷冻干燥的混合物中。

实施例40是根据实施例38或39所述的测定试剂盒，其中每种测定条型码化珠包含在测定条型码化珠内部存在的独特的同位素组合。

实施例41是根据实施例37至40所述的测定试剂盒，其中测定条型码化试剂包含用于将至少十种不同的分析物条型码化的至少十种测定条型码化试剂，并且其中以混合物提供测定条型码化试剂。

实施例42是根据实施例37至41所述的测定试剂盒，其中所述不同的分析物是人外周血中的游离分析物。

实施例43是根据实施例37至42所述的测定试剂盒，还包含特异性结合所述不同的分析物的报告抗体的组合，其中每种报告抗体包含通过元素分析可检测的元素标签。

实施例44是根据实施例43所述的测定试剂盒，其中所述报告抗体的组合的元素标签中的每一种包含通过元素分析可检测的在同位素方面相同的元素。

实施例45是根据实施例37至44所述的测定试剂盒，其中使每种测定条型码化试剂官能化以附接至包含同位素的样品条型码化组合物的样品条型码。

实施例46是根据实施例45所述的测定试剂盒，还包含样品条型码，样品条型码包含同位素的样品条型码化组合物。

实施例47是根据实施例45或46所述的测定试剂盒，其中样品条型码可以结合至被冷冻干燥的组染色的样品的细胞。

实施例48是根据实施例20至47所述的测定试剂盒，还包含条型码化试剂，其中每种条型码化试剂包含同位素的测定条型码化组合物和同位素的样品条型码化组合物，其中每种不同的同位素的测定条型码化组合物与不同的分析物相关，并且其中每种不同的同位素的样品条型码化组合物与不同的样品相关。

实施例49是根据实施例48所述的测定试剂盒，其中每种条型码化试剂是珠，并且其中所述同位素的样品条型码化组合物位于珠的内部。

实施例50是根据实施例48所述的测定试剂盒，其中每种条型码化试剂是珠，并且其中所述同位素的样品条型码化组合物位于珠的表面上。

实施例51是根据实施例20至50所述的测定试剂盒，还包含抗凝血剂。

实施例52是根据实施例20至51所述的测定试剂盒，还包含校准材料，其中所述校准材料包含已知量的已知的同位素。

实施例53是用于与元素分析一起使用的测定试剂盒，其包含：多个密闭容器；和根据实施例1至19所述的组，其中组的冷冻干燥的混合物分配在多个密闭容器中。

实施例54是根据实施例53所述的测定试剂盒，还包含用于标记多种样品的多种样品条型码化试剂，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含同位素的不同组合，并且其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含在多个密闭容器的不同容器内。

实施例55是条型码化系统，其包含：包含测定条型码的条型码化试剂，其中测定条型码包含与靶标分析物相关的同位素组成，其中所述同位素组成是通过元素分析可区分的，其中所述条型码化试剂包含多种样品条型码中的一种或者被官能化以结合至多种样品条型码中的至少一种，其中多种样品条型码的每种样品条型码包含通过元素分析与同位素的测定条型码组合物可区分的同位素的独特的其他组合物，其中多种样品条型码的每种样品条型码可以与不同的样品相关。所述条型码化系统可以可选地还包含来自实施例1或相关实施例的组。

实施例56是根据实施例55所述的系统，其中所述条型码化试剂是珠，并且可选地其中样品条型码存在于珠的内部。

实施例57是根据实施例55所述的系统，其中所述条型码化试剂是珠，并且其中将珠的表面官能化以结合至多种样品条型码。

实施例58是根据实施例55至57所述的系统，其中所述条型码化试剂是珠，并且其中珠的表面包含多种样品条型码中的一种。

实施例59是根据实施例55至58所述的系统，其中将所述条型码化试剂官能化以结合至多种样品条型码，并且可选地其中所述系统还在单独的容器中包含多种样品条型码的每种样品条型码。

实施例60是根据实施例55至59所述的系统，还包含样品条型码化试剂，样品条型码化试剂包含多种样品条型码中的至少一种，并且可选地其中样品条型码化试剂可以结合所述条型码化试剂和样品的细胞两者。

实施例61是根据实施例55至60所述的系统，其中所述条型码化试剂是珠，并且其中测定条型码存在于珠的内部，并且可选地其中珠的内部包含固体金属核心、金属螯合聚合物内部、纳米复合材料内部或杂化材料(hybrid)内部。

实施例62是根据实施例56-58或61所述的系统，其中珠具有固体金属核心和聚合物表面。

实施例63是根据实施例62所述的系统，其中聚合物表面结合至抗体，而抗体结合至靶标分析物。

实施例64是根据实施例63所述的系统，其中靶标分析物是存在于血液中的游离分析物。

实施例65是根据实施例55至64所述的系统，还包含特异性结合靶标分析物的报告抗体并且包含元素标签或高强度元素标签和低强度元素标签的组合。

实施例66是根据实施例65所述的系统，其中测定条型码化试剂包含用于将至少十种不同的分析物条型码化的至少十种测定条型码化试剂，并且可选地其中多种测定条型码化试剂的单独的混合物分别包含同位素可区分的样品条型码。

实施例67是根据实施例65或66所述的系统，还包含特异性结合测定条型码化试剂的靶标分析物的报告生物分子，其中所述报告生物分子分别包含亲合试剂或寡核苷酸，并且其中每种报告生物分子包含元素标签或者高信号元素标签和低信号元素标签的组合。

实施例68是根据实施例65至67所述的系统，其中特异性结合不同靶标分析物的所述报告生物分子中的至少一些包含相同的元素标签。

实施例69是方法，其包括：提供多种抗体；将多种抗体中的每一种与不同的元素标签缀合，其中每种不同的元素标签是基于其同位素组成可区分的，并且其中多种抗体中的每一种是通过其不同的元素标签可区分的；将多种缀合抗体一起混合成混合物；并冷冻干燥的混合物。

实施例70是根据实施例69所述的方法，还包括将多种缀合抗体旋转过滤。

实施例71是根据实施例69或70所述的方法，还包括：选择用于研究样品的研究方案；并基于所选的研究方案选择多种抗体。

实施例72是根据实施例69至71所述的方法，其中提供多种抗体包括提供来自以下列表的两种或更多种抗体，列表包括Cd45、CD45RA、CD45RO、Cd123、CD4、CD8a、CD11C、CD57、CXCR3、CD185、CD38、CD56、CD3、CD20、CD66b、HLA-DR、IgD、CD27、CD28、CD127、CD19、CD16、CD161、CD194、CD25、CD294、CD197、CD14、CCR6和TCRδγ。

实施例73是根据实施例69至72所述的方法，其中多种抗体中的每一种对人外周血中的细胞类型特异。

实施例74是根据实施例69至73所述的方法，其中多种抗体中的每一种对细胞表面标志物特异。

实施例75是根据实施例69至74所述的方法，其中将多种缀合抗体混合在一起包括将十种或以上的抗体混合在一起。

实施例76是根据实施例69至75所述的方法，其中每种不同的元素标签包含一种同位素的多个元素原子。

实施例77是根据实施例69至76所述的方法，其中所述不同的元素标签中的至少两种具有单一元素的不同的同位素。

实施例78是根据实施例69至77所述的方法，还包括提供包含其他元素标签的生物分子，其中基于其同位素组成，所述其他元素标签与每种不同的元素标签是可区分的，其中所述生物分子不是抗体，并且其中将多种缀合的抗体混合在一起还包括将所述生物分子与多种缀合抗体混合。

实施例79是根据实施例69至78所述的方法，其中每种不同的元素标签包含原子量大于80amu的金属元素。

实施例80是根据实施例69至79所述的方法，其中每种不同的元素标签包含螯合金属。

实施例81是根据实施例69至80所述的方法，其中每种不同的元素标签包含对于人外周血非内源的元素。

实施例82是根据实施例69至81所述的方法，其中将混合物冷冻干燥包括将含水量降低至按重量计5％或以下。

实施例83是根据实施例69至82所述的方法，还包括在冷冻干燥的混合物之前将嵌入剂混合到混合物中，其中嵌入剂包含基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的其他元素标签。

实施例84是根据实施例69至83所述的方法，还包括在冷冻干燥的混合物之前将校准材料混合到混合物中，其中所述校准材料包含已知量的已知的同位素。

实施例85是根据实施例69至84所述的方法，还包括在冷冻干燥的混合物之前将补充试剂混合到混合物中，其中所述补充试剂对于帮助实施使用多种缀合抗体的测定是可用的。

实施例86是根据实施例69至85所述的方法，其中冷冻干燥的混合物还包括将冷冻干燥的混合物储存在内部气氛为惰性气体或干燥空气的密闭容器中。

实施例87是根据实施例69至86所述的方法，其中多种抗体包含对细胞表面标志物特异的第一抗体和对胞内靶标特异的第二抗体。

实施例88是根据实施例69至87所述的方法，还包括：提供至少一种其他抗体；将所述至少一种其他抗体与基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的至少一种其他不同的元素标签缀合；冷冻干燥所述至少一种其他抗体；和独立于冷冻干燥的混合物储存冷冻干燥至少一种其他抗体。

实施例89是根据实施例88所述的方法，其中多种抗体包含对一种或多种细胞表面标志物特异的抗体，并且其中所述其他抗体对胞内靶标特异。

实施例90是根据实施例69至89所述的方法，还包括提供用于标记多种样品的多种样品条型码化试剂，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含同位素的不同组合。

实施例91是根据实施例90所述的方法，还包括：提供多个容器；和将多种样品条型码化试剂中的每一种储存在多个容器的不同容器内。

实施例92是根据实施例90或91所述的方法，其中多种样品条型码化试剂中的每一种结合至样品中的大部分细胞。

实施例93是根据实施例90至92所述的方法，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含官能化以共价或另外永久结合在样品的细胞上或细胞内的元素标签。

实施例94是根据实施例90至93所述的方法，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含特异性结合样品中大部分细胞中存在的靶标的样品条型码化抗体。

实施例95是根据实施例94所述的方法，其中样品条型码化抗体中的每一种特异性结合CD45、CD298和b2m中的一种或多种。

实施例96是根据实施例94或95所述的方法，其中样品条型码化抗体中的每一种特异性结合存在于样品中的靶标，其选择以导致单个样品条型码化抗体的质量信号弱于多种缀合抗体中大部分的质量信号。

实施例97是根据实施例90至96所述的方法，其中所述同位素的不同组合包含镉。

实施例98是根据实施例90至97所述的方法，其中所述同位素的不同组合包含顺铂中的铂。

实施例99是根据实施例90至98所述的方法，其中多种样品条型码化试剂中的每一种包含一组样品条型码化抗体，其中每种样品条型码化抗体包含所述同位素的不同组合的所有同位素。

实施例100是根据实施例90至99所述的方法，其中多种样品条型码化试剂中的每一种能够使活细胞条型码化，并且其中多种样品条型码化试剂中的每一种对所述活细胞无毒。

实施例101是根据实施例69至100所述的方法，还包括：提供测定条型码化试剂，测定条型码化试剂包含用于检测不同分析物的其他抗体，其中每种测定条型码化试剂包含同位素的不同组合。

实施例102是根据实施例101所述的方法，其中每种测定条型码化试剂是包含同位素的不同组合的测定条型码化珠。

实施例103是根据实施例102所述的方法，其中每种测定条型码化珠包含在测定条型码化珠内部存在的独特的同位素组合。

实施例104是根据实施例101至103所述的方法，其中测定条型码化试剂包含用于将至少十种不同的分析物条型码化的至少十种测定条型码化试剂，并且其中以混合物提供测定条型码化试剂。

实施例105是根据实施例101至104所述的方法，其中所述不同的分析物是人外周血中的游离分析物。

实施例106是根据实施例101至105所述的方法，还包括提供特异性结合所述不同的分析物的报告抗体的组合，其中每种报告抗体包含通过元素分析可检测的元素标签。

实施例107是根据实施例106所述的方法，其中所述报告抗体的组合的元素标签中的每一种包含通过元素分析可检测的在同位素方面相同的元素。

实施例108是根据实施例101至107所述的方法，还包括使每种测定条型码化试剂官能化以附接至包含同位素的样品条型码化组合物的样品条型码。

实施例109是根据实施例108所述的方法，其中样品条型码结合通过冷冻干燥的混合物测定的样品的细胞。

实施例110是根据实施例108或109所述的方法，还包括提供样品条型码，样品条型码包含同位素的样品条型码化组合物。

实施例111是根据实施例69至110所述的方法，还包括提供条型码化试剂，其中每种条型码化试剂包含同位素的测定条型码化组合物和同位素的样品条型码化组合物，其中每种不同的同位素的测定条型码化组合物与不同的分析物相关，并且其中每种不同的同位素的样品条型码化组合物与不同的样品相关。

实施例112是根据实施例111所述的方法，其中每种条型码化试剂是珠，并且其中所述同位素的样品条型码化组合物位于珠的内部。

实施例113是根据实施例111或112所述的方法，其中每种条型码化试剂是珠，并且其中所述同位素的样品条型码化组合物位于珠的表面上。

实施例114是根据实施例69至113所述的方法，还包括提供抗凝血剂。

实施例115是根据实施例69至114所述的方法，还包括在混合多种缀合抗体之前，将多种缀合抗体中的每一种滴定并稀释至预定浓度。

实施例116是根据实施例69至115所述的方法，还包括在冷冻干燥的混合物之前，将多种缀合抗体与赋形剂混合。

实施例117是根据实施例116所述的方法，其中所述赋形剂包括糖和牛血清白蛋白。

实施例118是根据实施例116或117所述的方法，还包括在冷冻干燥的混合物之前，将多种缀合抗体与存活力染色剂混合。

实施例119是根据实施例118所述的方法，其中所述存活力染色剂是铑嵌入剂。

实施例120是方法，其包括：制备样品；提供包含多种缀合抗体的冷冻干燥的抗体组，其中用不同的元素标签将多种缀合抗体中的每一种标签化，并且其中每种不同的元素标签是基于其同位素组成可区分的；使用冷冻干燥的抗体组对所述样品的细胞实施表面染色；并且使用元素分析研究所述样品以检测所述不同的元素标签的存在。

实施例121是根据实施例120所述的方法，其中使用元素分析研究所述样品包括在电感耦合等离子体质谱仪上处理所述样品以检测冷冻干燥的抗体组的不同的元素标签的存在。

实施例122是根据实施例120或121所述的方法，还包括用存活力染色剂对所述细胞的样品染色。

实施例123是根据实施例120至122所述的方法，其中作为冷冻干燥的抗体组的一部分提供所述存活力染色剂。

实施例124是根据实施例123所述的方法，其中所述存活力染色剂是铑。

实施例125是根据实施例120至124所述的方法，还包括对所述细胞的样品实施FcR封闭。

实施例126是根据实施例120至125所述的方法，还包括在实施表面染色之后固定所述样品。

实施例127是根据实施例120至126所述的方法，还包括用嵌入剂对所述样品染色，其中嵌入剂包括基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的其他不同的元素标签。

实施例128是根据实施例127所述的方法，其中在使所述样品透性化之后，通过嵌入剂发生所述样品的染色。

实施例129是根据实施例120至128所述的方法，还包括使所述样品透性化并使用至少一种其他抗体对所述细胞的样品实施胞内染色，其中用基于其同位素组成与每种不同的元素标签可区分的其他不同的元素标签将所述至少一种其他抗体标签化。

实施例130是根据实施例120至129所述的方法，其中制备所述样品包括采集全血。

实施例131是根据实施例130所述的方法，其中制备所述样品包括从全血分离外周血单核细胞。

实施例132是根据实施例120至131所述的方法，还包括使用样品条型码化试剂标记所述样品，其中样品条型码化试剂包括对于将样品条型码化试剂与其他样品条型码化试剂的区分可用的同位素的不同组合。

实施例133是根据实施例132所述的方法，其中研究所述样品包括通过元素分析获取数据，在所采集的数据中通过所述同位素的不同组合识别样品条型码化试剂并且将所采集的数据与所述样品相关。

实施例134是根据实施例133所述的方法，其中研究所述样品还包括在通过元素分析获取数据之前，将所述样品与其他样品混合。

实施例135是根据实施例120至134所述的方法，其中实施表面染色包括：将所述样品的细胞的混悬液添加至冷冻干燥的抗体组或者冷冻干燥的抗体组的再混悬液；并且除去未结合的抗体。

实施例136是根据实施例120至135所述的方法，还包括：提供包含用于检测不同分析物的其他抗体的测定条型码化试剂，其中每种测定条型码化试剂包含同位素的不同组合；并且在研究所述样品之前，将测定条型码化试剂与所述样品混合并除去未结合的抗体。

实施例137是根据实施例136所述的方法，其中所述样品包括血浆，并且其中所述不同的分析物是所述血浆内的游离分析物。

实施例138是根据实施例136或137所述的方法，其中通过提供冷冻干燥的抗体组和测定条型码化试剂的混合物，发生了提供测定条型码化试剂和提供冷冻干燥的抗体组。

实施例139是根据实施例136至138所述的方法，其中制备所述样品包括采集全血。

实施例140是根据实施例139所述的方法，其中制备所述样品还包括分离外周血单核细胞和血浆，其中实施表面染色包括将冷冻干燥的抗体组与所述外周血单核细胞混合并除去未结合的抗体；并且其中测定条型码化试剂与所述样品的混合包括测定条型码化试剂与所述血浆的混合和除去未结合的抗体。

实施例141是根据实施例120至140所述的方法，其中研究所述样品还包括自动识别细胞存活力。

实施例142是根据实施例120至141所述的方法，其中研究所述样品还包括自动识别细胞群体。

实施例143是根据实施例142所述的方法，其中研究所述样品还包括识别自动识别的细胞群体的特征。

实施例144是根据实施例143所述的方法，其中研究所述样品还包括比较对整个所识别的细胞群体所识别的特征或者将与所识别的细胞群体之一有关的所识别的特征和与从其他样品所识别的细胞群体中的相同的一种群体有关的所识别的其他特性相比较。

实施例145是根据实施例143或144所述的方法，其中识别自动识别的细胞群体的特征包括确定所识别的细胞群体的细胞上或细胞中的一种或多种靶标的丰度。

实施例146是根据实施例143至145所述的方法，其中所识别的特征包括所述细胞群体中的细胞的百分比。

实施例147是根据实施例120至146所述的方法，其中研究所述样品还包括基于冷冻干燥的抗体组的已知靶标，产生柱状图、2D点图和tSNE图中的至少一种。

实施例148是根据实施例147所述的方法，还包括自动访问冷冻干燥的抗体组的已知靶标的存储的定位图，其中所述储存的定位图将移至靶标与相关质量通道相关联。

实施例149是根据实施例136至148所述的方法，还包括：使用样品条型码化试剂标记所述样品，其中样品条型码化试剂包含区分样品条型码化试剂和其他样品条型码化试剂可用的同位素的不同组合；提供其他样品；使用其他样品条型码化试剂标记所述其他样品；使用冷冻干燥的抗体组对所述其他样品的其他细胞实施其他表面染色；将测定条型码化试剂与所述其他样品混合并除去未结合的抗体；和在研究所述样品之前将所述样品与所述其他样品混合，其中研究所述样品包括研究所述样品和所述其他样品的混合物。

实施例150是根据实施例149所述的方法，其中在实施表面染色前发生了所述样品与所述其他样品的混合。

实施例151是根据实施例149或150所述的方法，其中将测定条型码化试剂官能化以结合至样品条型码化试剂，其中使用样品条型码化试剂标记所述样品包括将样品条型码化试剂结合至测定条型码化试剂的第一部分，从而测定条型码化试剂的第二部分不含样品条型码化试剂，其中将测定条型码化试剂与所述其他样品混合包括将测定条型码化试剂的第二部分与所述其他样品混合，并且其中将所述样品与所述其他样品混合发生在将测定条型码化试剂与所述其他样品混合之后。

实施例152是根据实施例120至151所述的方法，其中研究所述样品包括使用元素分析装置获得与所述样品有关的数据，其中所述方法还包括自动分析所述数据。

实施例153是根据实施例152所述的方法，其中自动分析所述数据包括将净化模型(cleanup model)应用于所述数据，其中应用所述净化模型包括访问通过与所述样品的电离有关的元素分析装置所产生的高斯型测量。

实施例154是根据实施例152或153所述的方法，其中自动分析所述数据包括：访问元素标签指定模型，其中元素标签指定模型包括将冷冻干燥的抗体组的不同的元素标签中的每一种与细胞类型相关联的信息；识别冷冻干燥的抗体组的不同的元素标签的存在信息；并且对于所述样品的每个细胞，使用对于所述不同的元素标签所识别的存在信息和元素标签指定模型确定所述细胞类型。

实施例155是用于元素分析的条型码化试剂盒，其包含：用于标记多种样品的多种样品条型码，其中样品条型码中的每一种包含通过元素分析可区分的同位素的不同组合，并且其中将样品条型码中的每一种储存在不同的容器中；和可结合至多种样品的一组生物分子，其中组的生物分子包含多种样品条型码或者官能化以结合至多种样品条型码。

实施例156是根据实施例155所述的条型码化试剂盒，其中组的生物分子中的每一种包含多种样品条型码中的独特的样品条型码。

实施例157是根据实施例155或156所述的条型码化试剂盒，其中将组的生物分子中的每一种官能化以结合多种样品条型码，并且其中将组的生物分子独立于多种样品条型码储存。

实施例158是根据实施例155-157所述的条型码化试剂盒，其中组的生物分子包含多种珠。

实施例159是根据实施例158所述的条型码化试剂盒，其中每种珠包含官能化以结合至多种样品条型码的外表面。

实施例160是根据实施例159所述的条型码化试剂盒，其中每种珠包含位于珠的内部的测定条型码，其中每种测定条型码包含通过元素分析与样品条型码的同位素的不同组合可区分的其他同位素组合。

实施例161是方法，其包括：提供包含第一样品和第二样品的多种样品；提供包含第一样品条型码和第二样品条型码的多种样品条型码，其中样品条型码中的每一种包含通过元素分析可区分的同位素的不同组合；提供可结合至多种样品的多种生物分子，其中每种生物分子包含多种样品条型码中的一种或者官能化以结合至多种样品条型码，并且其中多种生物分子包含第一生物分子和第二生物分子；将所述第一生物分子与所述第一样品混合；将第二生物分子与第二样品混合；除去任何未结合的生物分子；使用元素分析研究多种样品以获得元素数据；检测元素数据中同位素的每种不同组合的存在；和使用所检测的同位素的每种不同组合的存在，将元素数据与多种样品之一相关联。

实施例162是根据实施例161所述的方法，还包括：将所述第一样品条型码与包含所述第一生物分子和所述第一样品的混合物进行混合；并且将第二样品条型码与包含第二生物分子和第二样品的混合物进行混合。

实施例163是根据实施例161所述的方法，还包括：在将所述第一生物分子与所述第一样品混合之前，将所述第一样品条型码与所述第一生物分子混合；和在将第二生物分子与第二样品混合之前，将第二样品条型码与第二生物分子混合。

实施例164是根据实施例161至163所述的方法，还包括在研究多种样品之前，将所述第一样品和第二样品混合。

实施例165是根据实施例161至164所述的方法，其中多种生物分子包含多种珠。

实施例166是根据实施例165所述的方法，其中每种珠包含官能化以结合至多种样品条型码的外表面。

实施例167是根据实施例166所述的方法，其中每种珠包含位于珠的内部的测定条型码，其中每种测定条型码包含通过元素分析与样品条型码的同位素的不同组合可区分的其他同位素组合。