阅读说明：本技术 一种卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法 (Separation and purification method of yolk globulin IgY ) 是由 李勇 段生宝 于海利 王红梅 陈晔洲 丁少华 田晶晶 王玉珏 刘杰 王泽龙 王晴 于 2021-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法,属于生物技术领域。具体而言,该方法包括：S1：将鸡蛋黄用无菌水稀释后搅拌均匀,调节pH值为4.6-5.4,静置2-10h后过滤去除沉淀,得到上清液；S2：向S1中的上清液中加入95％冰乙醇使得终浓度为40％-60％(v/v),0-10℃条件下搅拌20-40min后离心,收集沉淀；S3：向得到的沉淀中加入氯化钠水溶液,过滤除去脂蛋白沉淀；收集滤液；S4：滤液用离子交换色谱法纯化,得到IgY。本发明提供的制备方法安全性高,有着更高的蛋白回收率和纯度,活性损失较小,弥补了离子交换色谱不能同时达到高纯度和高回收率的缺点；仪器设备操作简单,成本低,可实现大规模生产制备高纯度高回收率的卵黄球蛋白IgY。(The invention discloses a separation and purification method of ovovitellin IgY, belonging to the technical field of biology. Specifically, the method comprises the following steps: s1: diluting ovum gallus Domesticus flavus with sterile water, stirring, adjusting pH to 4.6-5.4, standing for 2-10 hr, filtering to remove precipitate to obtain supernatant; s2: adding 95% glacial ethanol into the supernatant of S1 to make the final concentration 40% -60% (v/v), stirring at 0-10 deg.C for 20-40min, centrifuging, and collecting precipitate; s3: adding sodium chloride aqueous solution into the obtained precipitate, and filtering to remove lipoprotein precipitate; collecting the filtrate; s4: the filtrate was purified by ion exchange chromatography to obtain IgY. The preparation method provided by the invention has high safety, higher protein recovery rate and purity and smaller activity loss, and overcomes the defect that the ion exchange chromatography cannot achieve high purity and high recovery rate simultaneously; the instrument and equipment are simple to operate, the cost is low, and the large-scale production and preparation of the high-purity high-recovery-rate ovovitellin IgY can be realized.)

一种卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法。

背景技术

卵黄球蛋白是蛋黄中一种重要的蛋白质组成成分，约占蛋黄干物质的9.3％。它在蛋黄中以α-、β-和γ-卵黄球蛋白三种形式存在。γ-卵黄球蛋白即IgY，是鸡蛋蛋黄来源的免疫球蛋白。然而与哺乳动物IgG相比，有着更大的分子量、酸性等电点。IgY结构类似于哺乳动物的IgG抗体，由四条链组成，即两条轻链和两条重链。IgY的热稳定性与IgG相差不大，具有一定的耐酸耐碱能力，在pH 4.0-11.0范围内稳定，可耐受胃酸，抵抗肠道中胰蛋白酶的消化，而且采用包被微孔板作为捕获抗体就不会激活标本中的补体系统，可以避免由补体激活而导致的干扰。

由于IgY具有上述的优点，其在食品、畜禽产业以及临床上有着广泛的应用。在食品领域，其可以做为一种抗体食品添加剂，制备抗体食品，从而提高机体免疫力。研究表明，添加IgY的抗体食品对病原体感染能够起到预防作用，同时对风湿病症也具有良好的预防和改善作用。在畜禽产业中，IgY对腹泻的发生程度和仔猪的死亡率起到降低的作用，并且有利于仔猪增加体重。在临床上IgY也用于抗哺乳动物多克隆抗体的制备、制备实验诊断试剂和免疫防治。

基于IgY的广泛应用，对于IgY的提纯和制备方法也受到了广泛的研究。目前常采用的提纯制备方法有无机物沉淀法、高分子有机聚合物沉淀法、有机溶剂沉淀法、超滤法、离子交换色谱法和亲和色谱法。但是，目前采用上述方法普遍存在步骤多、批量小、试剂耗量大和回收率低等问题。因此，需要开发一种高回收率、高纯度的IgY的分离纯化方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种高纯度、高回收率的卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法。

本发明的发明人在研究中发现，将鸡蛋黄按照无菌水稀释、冰乙醇沉淀、盐析和离子交换色谱纯化后能够得到纯度较高的卵黄球蛋白IgY。从而，本发明提供了如下的技术方案：

一方面，本发明提供了一种卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法，其包括：

S1：将鸡蛋黄用无菌水稀释后搅拌均匀，调节pH值为4.6-5.4，静置2-10h后过滤去除沉淀，得到上清液；

S2：向S1中的上清液中加入95％冰乙醇使得终浓度为40％-60％(v/v)，0-10℃条件下搅拌20-40min后离心，收集沉淀；

S3：向得到的沉淀中加入氯化钠水溶液，过滤除去脂蛋白沉淀，收集滤液；

S4：滤液用离子交换色谱法纯化，得到IgY。

本发明中，冰乙醇是指将乙醇冷却到-20℃时再使用。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤S1中无菌水稀释时的用量为鸡蛋黄体积的6-10倍；进一步优选地，步骤S1中无菌水稀释时的用量为鸡蛋黄体积的8倍。本发明发现，当稀释倍数为8倍，调节pH值为5.2时，脂蛋白的回收率最小，说明稀释液的pH值为5.2时，可以获得较好的分离效果。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，调节pH值得方式包括采用酸性试剂进行调节，例如采用HCl、H₂SO₄等无机酸进行调节；优选地，调节pH值为5.2。在一些具体的实施方案中，步骤S1中的静置时间为4h。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤S2中加入冰乙醇后的终浓度为60％(v/v)。乙醇的添加量会影响终产物中蛋白质的含量和免疫球蛋白的活性，经过对比，确定乙醇的添加量为60％最为合适。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤S3中加入的氯化钠水溶液的浓度为0.028mol/L-0.056mol/L。在一些具体的实施方案中，步骤S3中加入的氯化钠水溶液的浓度为0.028mol/L。氯化钠水溶液的作用是用来溶解得到的沉淀，其浓度不同，得到的产物的产率也不一样。当氯化钠溶液的浓度为0.028mol/L时，蛋白质获取率最高，并且杂蛋白的去除情况也较为理想。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，步骤S4中用离子交换色谱法纯化的步骤包括：

采用DEAE-Toyopearl 650M作为离子交换色谱用的填料，填料预先用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡，缓冲液的pH值为6.0-8.0、缓冲液的离子强度为0.03mol/L-0.1mol/L，流速为3-8mL/min，将收集到的IgY装入透析袋中，置于蒸馏水中，4-10℃下透析除盐，得到IgY。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，缓冲液的pH值为7.0，缓冲液的离子强度为0.075mol/L，流速为3mL/min，透析袋的截留分子量为8000-14000KD。

本发明提供的分离纯化方法中，离子交换纯化过程中采用较低的缓冲液离子强度，减少了后续脱盐时间，缩短了提取周期，对蛋白质活性影响小。

此外，本发明还提供了一种卵黄球蛋白IgY，其是按照本发明所述的制备方法制备得到的，所述IgY的纯度为96％-99.9％；优选为98％-99.9％。

综上所述，本发明提供了一种新的卵黄球蛋白IgY的分离纯化方法。该方法综合采用水稀释法、冰乙醇沉淀和离子交换色谱法，能够制备出高回收率和高纯度的卵黄蛋白IgY。其中，使用的乙醇是本身具有可食性，因此该方法的安全性较高。在制备IgY组分过程中，对水稀释分离条件进行了改进，所使用的乙醇与其他有机试剂相比无毒无害，更安全；氯化钠水溶液沉淀去除脂蛋白，再结合一步洗脱离子交换纯化，有着更高的蛋白回收率和纯度，活性损失也较小，弥补了离子交换色谱不能同时达到高纯度和高回收率的缺点；仪器设备操作简单，成本低，可实现大规模生产制备高纯度高回收率的卵黄球蛋白IgY。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

需要说明的是，本发明实施例中所采用的试剂都是通过商业购买可以获得的。

本发明中采用的测试方法，也皆为本领域技术人员熟知的常规技术手段。

实施例1

本实施例提供了一种卵黄球蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

选择市售新鲜鸡蛋，用卵黄分离器去除蛋白，之后将蛋黄于滤纸上滚动，吸干，刺破卵黄膜，收集卵黄。取100mL卵黄，加入8倍体积的无菌水进行稀释，搅拌均匀后用HCl调节pH值为5.2，静置4h左右后过滤去除沉淀，得到上清液。

向上清液中加入95％冰乙醇(预先冷却至-20℃备用)，使终浓度为60％(v/v)，4℃搅拌20min后离心，收集沉淀。

向上述沉淀加入0.028mol/L的氯化钠水溶液(量能够充分溶解沉淀即可)，搅拌20分钟左右后过滤去除脂蛋白沉淀，收集滤液得到澄清的水溶性蛋白组分(WSF)。

采用DEAE-Toyopearl 650M作为离子交换色谱用的填料，填料预先用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡，缓冲液的pH值为7.0、缓冲液的离子强度为0.075mol/L，流速为3mL/min，将收集到的IgY装入透析袋中(透析袋的截留分子量为8000KD)，置于蒸馏水中，4℃下透析除盐，得到IgY。

回收率、纯度、生物活性的测定：

蛋白质的回收率、纯度、生物活性是分离纯化过程的重要指标，在分离纯化过程中，IgY有不同程度的损失，抗原抗体结合活性也会受到一定程度的影响。

蛋白的回收率可以采用福利-酚法进行确定。

IgY的纯度采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行测定：Laemmli体系，4％浓缩胶，10％分离胶，恒压150V，加样量1～10mg，电泳后的凝胶分别采用考马斯亮蓝R-250和糖蛋白染色，分析测定本发明提供的制备方法所得IgY的纯度可达99％。

IgY的回收率测定：IgY的回收率可以通过以下公式进行计算：

IgY的活性检测方法为：

IgY活性检测采用ELISA方法检测(Sousa et al.,2011)，具体操作如下：

(1)标准品的稀释：原倍标准品一支，按照下列表1在小试管中进行稀释。

表1

800ng/L	5号标准品	150μL的原倍标准品加入150μL标准品稀释液
			400ng/L	4号标准品	150μL的5号标准品加入150μL标准品稀释液
200ng/L	3号标准品	150μL的4号标准品加入150μL标准品稀释液
			100ng/L	2号标准品	150μL的3号标准品加入150μL标准品稀释液
50ng/L	1号标准品	150μL的2号标准品加入150μL标准品稀释液

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL最终稀释度为5倍。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水倍稀释后备用。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置后弃去，如此重复次，拍干。

(6)加酶：每孔加入酶标试剂，空白孔除外。

(7)温育：操作同3。

(8)洗涤：操作同5。

(9)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL。轻轻振荡混匀，37℃避光显色15min。

(10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

IgY活性保持率(％)＝处理后样品活性含量/处理前样品活性含量×100％。

结果分析：

IgY在分离纯化过程中的回收率、纯度、活性保持率如下表2所示：

表2

分离过程	回收率(％)	纯度(％)	活性保持率(％)
				水稀释	93.56	20	95.21
冰乙醇沉淀	70.37	76	82.31
				离子交换色谱	94.66	99	79.61

由上表2可以看出，采用本发明提供的制备方法所得到的蛋白回收率高、且最终纯度可达到99％、活性保持率在79.61％。相比于单纯采用水稀释法、或者是水稀释法加冰乙醇沉淀的方法，本发明提供的方法在纯度、回收率方面均有所提升。在活性保持率方面稍有下降，但也在可接受的范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在不偏离本发明要求保护的精神和实质的前提下，可以对本发明的各个技术特征进行替代、修改和组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。