具有tirfm能力的显微镜及其操作方法
阅读说明：本技术 具有tirfm能力的显微镜及其操作方法 (TIRFM-capable microscope and method of operating same ) 是由 M·舒费尔 K·C·舒曼 J-R·克鲁格 F·怀恩豪森 宫薗侑也 D·克鲁格 于 2021-03-22 设计创作，主要内容包括：具有TIRFM能力的显微镜及其操作方法。具有TIRFM能力的显微镜包括用于产生和发射非相干激发光的第一光源。第一投影透镜系统将激发光投射到空间滤波器装置上,该空间滤波器装置位于与物镜的后焦平面(BFP)共轭的平面(cBFP)中,并利用二维图案对激发光进行空间滤波。物镜包括物镜透镜,该物镜透镜被设计和布置成将激发光引导到样本上并接收来自样本的荧光,其中,对于物镜的数值孔径NA-(Obj)和样本的折射率n-(spec),NA-(Obj)>n-(spec)适用。第一控制单元激活空间滤波器装置以选择或产生各种二维图案,并且选择或调整二维(特别是环形)图案的位置、形状和/或尺寸,从而产生对样本的TIRF照明。(A microscope with TIRFM capability and method of operation thereof. A TIRFM-capable microscope includes a first light source for generating and emitting incoherent excitation light. The first projection lens system projects the excitation light onto a spatial filter arrangement located in a plane (cBFP) conjugate to a Back Focal Plane (BFP) of the objective lens and spatially filters the excitation light with a two-dimensional pattern. The objective lens comprises an objective lens designed and arranged to direct excitation light onto the sample and to receive fluorescence light from the sample, wherein the numerical aperture NA for the objective lens Obj And refractive index n of the sample spec ，NA Obj >n spec The method is applicable. The first control unit activates the spatial filter device to select or generate various two-dimensional patterns and to select or adjust the position, shape and/or size of the two-dimensional, in particular annular, patterns, thereby generating TIRF illumination of the sample.)
技术领域
本发明涉及具有TIRFM能力的显微镜及其操作方法。
背景技术
全内反射荧光显微术(TIRFM)，即具有TIRF照明的显微术，涉及使用隐失场来激发标本或样本的荧光。为了产生隐失场，光在与样本的界面处在反射元件(例如盖玻片)的内部被完全反射。这利用了以下事实：当从法线到界面计算的入射角θ1超过临界角θc＝arcsin(n2/n1)时，以较小的角度入射到与具有较低折射系数n2的介质的界面上的、具有较高折射系数n1的介质中的光被完全反射。
这样，在玻璃上的样本中形成了超出界面的光场，该光场垂直于界面呈指数消散，并且对于可见光的典型穿透深度为100-200nm。如果可以吸收辐射波长的光的荧光分子位于该区域中，则它们被激发而发出荧光。这种荧光被称为全内反射荧光(TIRF)。TIRF导致将产生的荧光很好地限制在玻璃附近的区域；观察到的层只有100-200nm薄。与普通荧光显微术或共聚焦显微术的情况相比，这实现了沿着光轴的明显更好的分辨率。
大多数具有TIRFM能力(＝具有TIRF显微术能力)的显微镜都使用一个物镜进行照明和收集荧光。为此，物镜必须适合于以超过临界角的角度对样本进行照明。因此，物镜的数值孔径NA必须大于较薄介质的折射率n2，这意味着
NA＝n1sinθ>n2。
光穿过物镜的后焦平面的位置决定了光穿过物镜的焦平面的角度，根据下式
r＝f*NA＝f*n1 sinθ，
其中，r描述了光线的通过位置距物镜的后焦平面中的光学系统的中心光线路径的径向距离，f描述了物镜的焦距或焦长。为了产生隐失光场，焦平面中的光的角度必须超过临界角，并且光束距后焦平面中心的距离必须对应地超过临界半径rc。因此，具有TIRFM能力的显微镜通常被设计为反光显微镜，其具有浸入油中的物镜以及达1.45或更高的非常高的数值孔径(NA)。这种高数值孔径允许平坦的照射角，其中，激发光在物镜的边缘处耦合，使得激发光以平坦的全反射角接触与样本的界面。
有多种可能性来防止光也以小于临界角的角度撞击界面，这意味着在这样的角度下光不会被完全反射。通过使用非相干光源，例如LED或灯泡，可以在光线路径中在与物镜的后焦平面(BFP)共轭的点处使用隐藏光的中心部分的环形孔径。例如从US 6,597,499 B2已知这种布置。然而，使用这样的孔径会导致光源发射的大部分光都没有被使用，而由于显微镜光学器件所跨越的相空间(光学扩展量)与光源所跨越的光学扩展量吻合度较差的事实，这会进一步被放大，因此在某些情况下仅约1％的发射光可用于开始激发。
避免此问题的另一种解决方案是在所谓的激光TIRFM中使用激光光源，该激光光源耦合到显微镜的光线路径中，使得激光光源产生的光几乎完全到达与样本的界面。然而，该解决方案更昂贵并且在光学上具有如下缺点：光仅具有非常窄的光谱，并且由于激光的相干性会出现可能破坏图像的衍射效应和干涉效应。
发明内容
基于该现有技术，本发明的目的是提供一种具有TIRFM能力的显微镜及其操作方法，其允许高度的测量灵活性。
该目的通过一种具有TIRFM能力的显微镜来实现，其包括：第一光源，其被设计成产生非相干激发光并将该非相干激发光发射到第一光路上，该第一光路依次包括第一投影透镜系统、第一空间滤波器装置、第二投影透镜系统以及物镜，其中，所述第一投影透镜系统被设计成将所述激发光投射到所述第一空间滤波器装置上，并且所述第一空间滤波器装置被设计成利用二维图案对所述激发光进行空间滤波，其中，所述第一空间滤波器装置在第一配置中处于与所述物镜的后焦平面(BFP)共轭的平面(cBFP)中，其中，所述物镜包括物镜透镜，该物镜透镜被设计和布置成将所述激发光引导到样本上并接收来自所述样本的荧光，其中，对于所述物镜的数值孔径NAObj和所述样本的折射率nspec，NAObj>nspec适用，并且其中，第一控制单元被包含并且被设计成激活所述第一空间滤波器装置，以选择或产生各种二维图案，并且选择或调整二维(特别是环形)图案的位置、形状和/或尺寸，使得产生对所述样本的TIRF照明。
利用根据本发明的具有TIRFM能力的显微镜，进一步开发了其中物镜既用于收集又用于照明的变体。代替固定的环形孔径，使用可变的空间滤波器装置。利用根据本发明使用的非相干光，通过选择或创建环形二维图案来实现根据本发明的对样本的TIRF照明，其中光线路径中的光仅保留在由此产生或选择的环形孔径内，而图案中心部分和环外部的光被遮挡。通过调节环形图案的尺寸，可以控制隐失场到样本中的穿透深度，等等。
使得TIRF照明成为可能的二维图案不必一定是环形的。将直到临界半径的中心部分排除就足够了。在超出临界半径的该中心部分之外，任何图案都将导致TIRF照明。然而，环形图案确保了相对高的光度和照明的均匀性。
在实施方式中，所述控制单元被设计成激活所述第一空间滤波器装置，以提供环形图案和圆形图案作为二维图案，以便在TIRF照明与非TIRF照明之间切换。利用圆形图案(其中激发光也在临界半径内传输)，具有TIRFM能力的显微镜也可以用作带有所谓的落射照明的落射荧光显微镜，该落射照明像TIRF照明一样穿过物镜。然而，落射激发光不会经历全反射；相反，它完全穿过界面渗透到样本中。因此后者在其整个厚度上被照明并被激发发出荧光。因此，通过选择界面附近的层，以空间分辨率为代价获得了更高的光输出量。
优选地，所述环形图案的外半径小于或等于所述物镜的后焦平面的延伸的最大值，并且所述环形图案的内半径大于或等于所述后焦平面的临界半径，该临界半径对应于所述物镜的焦平面中的全内反射的临界角。环形图案的外半径的限制确保了光的被允许通过的部分保留在显微镜的光线路径内，因此不会由于光散射而产生干扰，而环形图案的内半径的限制确保了临界半径不落在下面。通过调节内半径，还可以控制进入样本的穿透深度。
在具有TIRFM能力的显微镜的实施方式中，在所述第一光路中、在与所述物镜的焦平面(FP)共轭的平面(cFP)中布置有第二空间滤波器装置，并且该第二空间滤波器装置被设计成利用多个不同二维图案对所述激发光进行空间滤波，并且所述第一控制单元或第二控制单元被设计成激活所述第二空间滤波器装置以选择或产生一系列二维图案。第二空间滤波器装置布置在与物镜的焦平面共轭的平面(cFP)中，使得第二空间滤波器装置的二维图案导致照明光在焦点位置处的对应空间分布，即，在样本或标本中。将第一和第二滤波器装置组合在一起使得具有结构化照明的TIRF显微术(全内反射荧光结构化照明显微术，TIRF-SIM)成为可能。在这种情况下，第一空间滤波器装置在与物镜的后焦平面共轭的平面中将环形图案印在激发光上，以产生TIRF照明，与此同时，第二空间滤波器装置在与物镜的焦平面共轭的平面中将结构化图案序列印在激发光上，并以此方式确定样本中被激发光照明的位置。具有结构化照明的TIRF显微镜(TIRF-SIM)也是具有TIRFM能力的显微镜。
在合适的可变空间滤波器装置的实施方式中，所述第一空间滤波器装置被设计为具有多个圆形和环形孔径的孔径改变装置，特别是可旋转的孔径环，或者被设计为可编程的空间光调制器，特别是空间透射光调制器或空间反射光调制器，其中，特别地，所述第二空间滤波器装置被设计为可编程的空间透射或反射光调制器。在一个实施方式中，可编程的空间光调制器(SLM)是按透射操作的LCD矩阵，其各个像素可以在透光状态与不透光状态(透射SLM)之间来回切换，并且在另选实施方式中，可编程的空间光调制器(SLM)是具有可枢转的微镜元件的阵列或矩阵的数字微镜装置(DMD或反射SLM)。透射SLM和反射SLM都可以以有针对性的方式被激活，使得它们产生特定的二维图案，尤其是例如具有可调节的内半径和可调节的外半径的环。空间光调制器是可自由编程的事实使得具有TIRFM能力的显微镜得以灵活地构建并且利用多种设置进行操作。
具有TIRFM能力的显微镜的实施方式提供了在TIRF照明与位置选择性落射照明之间进行切换的可能性，因为所述第一投影透镜系统完全或部分地沿着所述第一光路可移动地布置成使得所述第一空间滤波器装置可以可逆地从所述第一配置进入第二配置、所述第二投影透镜系统完全或部分地沿着所述第一光路可移动地布置成使得所述第一空间滤波器装置可以可逆地从所述第一配置进入第二配置、和/或所述第一空间滤波器装置沿着所述第一光路可移动地布置成使得所述第一空间滤波器装置可以可逆地从所述第一配置进入第二配置，在该第二配置中，所述第一空间滤波器装置被布置在与所述物镜的焦平面共轭的平面中。这样，就消除了与物镜的后焦平面共轭的平面中的TIRF滤波，从而自动设置落射照明，该落射照明由处于第二配置中的第一空间滤波器装置进行了空间滤波。
在实施方式中，如果包括第三投影透镜系统，该第三投影透镜系统被设计和布置成使所述第一空间滤波器装置与所述物镜的焦平面共轭，其中，在所述第一空间滤波器装置与所述物镜之间布置有切换光学单元，该切换光学单元被设计成在所述第二投影透镜系统与所述第三投影透镜系统之间切换所述光路，则给出了在TIRF照明与位置选择性落射照明之间进行切换的另选或附加的可能性。
在以下实施方式中给出了利用两个不同光源(例如具有不同色谱图)照明的可能性：当包括被设计成产生和发射非相干激发光的第二非相干光源时，第一空间滤波器装置被设计为数字微镜装置(DMD)，其中，所述第一光源和所述第二光源各自朝向被设计为数字微镜装置的所述第一空间滤波器装置定向，其中，所述数字微镜装置的可枢转的微镜元件在第一枢转位置中将来自所述第一光源的激发光引导到所述第一光路中，并且在第二枢转位置中，将来自所述第二光源的激发光引导到所述第一光路中。以这种方式，通过激活DMD，可以选择光源并且可以在光源之间进行切换。在进一步的发展中，为两个光源中的各个光源提供光线吸收器，该光线吸收器接收并吸收来自光源的光的未被传送到显微镜的光线路径中的部分。
在实施方式中，所述第一光源和/或所述第二光源包括一个LED或多个LED、灯泡和光导体的组合、或者激光光源和动态漫射器的组合。动态漫射器是一种以高频移动(例如在超声波范围内)移动的漫射器，因此会破坏激光的相干性。因此，不再发生干涉效应和衍射效应，特别地，这些干涉效应和衍射效应否则可能在DMD的微镜元件上相当大程度地发生。
本发明的目的还通过根据本发明的操作先前描述的具有TIRFM能力的显微镜的方法来实现，其中，使用所述第一空间滤波器装置上的二维图案的搜索图案序列来寻找所述物镜的后焦平面的中心，所述搜索图案序列中的各个搜索图案具有用于将激发光传送到第一光路的单个小像素簇，该像素簇在所述搜索图案序列内在(特别是笔直的)搜索路径上移动，其中，记录了从所述物镜返回的所述荧光的发光度具有最大值的位置，并且将已经找到的多个发光度最大值所在的圆的圆心确定为所述物镜的后焦平面的中心
利用这种方法，可以进行对中，因为光度最大值全部位于与全反射的临界角相对应的圆上。环形孔径图案在该中心上的对中已经确保了激发光关于显微镜的光学系统的空间布置的有效对中。
多个搜索路径优选地从所述第一空间滤波器装置的边缘到中心以不同角度延伸。如果光学系统的对中接近最佳对中，则这些径向搜索路径基本上垂直地与临界半径的圆相交，从而在光度曲线中特别清晰地示出了搜索到的光度最大值。斜击搜索路径轨迹会导致最大值变宽，从而导致不太准确的对中。
为了在所有情况下都优化对中，在该方法的实施方式中，在所述物镜的后焦平面的中心的初始粗略确定之后，运行具有增加的精细度的搜索图案序列和/或运行控制搜索图案，其中，从不同方向径向扫描找到的圆，以确定具有最大锐度的光度最大值，从而精确确定所述中心。
在不同的实施方式中，根据本发明的具有TIRFM能力的显微镜可以在TIRF照明与非TIRF照明之间切换、以TIRF-SIM模式操作、或者以可切换的方式在多个不同光源之间操作。还可以布置成组合这些特征，并且通过在光源之间切换，伴随着第一空间滤波器装置从cBFP平面中的第一配置到cFP平面中的第二配置的转换，以TIRF操作多个光源之一并且以落射照明操作另一光源。以此方式，例如，具有宽带落射照明的概览模式可以与具有窄带TIRF照明的细节模式可切换地组合。
通过根据本发明的实施方式的描述以及权利要求和附图，本发明的其他特征将变得明显。根据本发明的实施方式可以实现单独的特征或多个特征的组合。
在本发明的范围内，由“特别地”或“优选地”指定的特征被理解为可选特征。
附图说明
以下，基于示例性实施方式并参照附图，在不限制本发明的总体思想的情况下对本发明进行了描述，由此，对于根据本发明的在文本中未进行更详细的说明的所有细节，我们明确地参照了附图。附图中：
图1示出了在TIRF照明的情况下的光学装置的示意性原理图，
图2示出了第一实施方式中的具有TIRFM能力的显微镜的光学组件的示意图，
图3示出了拥有具有TIRF-SIM能力的显微镜的光学组件的第二实施方式的示意图，
图4示出了具有TIRFM能力的显微镜的对中原理的示意图，
图5示出了第三实施方式中的具有TIRFM能力的显微镜的光学组件的示意图，
图6示出了第四实施方式中的具有TIRFM能力的显微镜的光学组件的示意图，
图7示出了使用搜索路径的发光度测量的示例，以及
图8示出了与图7的搜索路径相对应的发光度曲线。
在附图中，相同或相似的元件和/或部件在每种情况下都具有相同的附图标记，从而在每种情况下都省去了重新呈现。
附图标记列表
101 物镜
102 光束
103 准直光束
104 光束
105 准直光束
201 光源
202 第一投影透镜系统
203 第一空间滤波器装置
204 第二投影透镜系统
205 偏转单元
206 物镜
207 管状透镜
208 检测器
301 光源
302 第一投影透镜系统
303 第一空间滤波器装置
304 第二投影透镜系统的前部
305 第二空间滤波器装置
306 第二投影透镜系统的后部
307 偏转单元
308 物镜
309 管状透镜
310 检测器
401 第一空间滤波器装置
402 搜索路径上的像素簇
501a 第一光源
501b 第二光源
502a 第一投影透镜系统
502b 第三投影透镜系统
503a 第一光线吸收器
503b 第二光线吸收器
504 第一空间滤波器装置
505 第二投影透镜系统
506 偏转单元
507 物镜
508 管状透镜
509 检测器
601 光源
602 第一投影透镜系统
603 孔径改变装置
604 第二投影透镜系统的前部
605 第二空间滤波器装置
606 第二投影透镜系统的后部
607 偏转单元
608 物镜
609 管状透镜
610 检测器
BFP 后焦平面
FP 焦平面
cBFP 与后焦平面共轭的平面
cFP 与焦平面共轭的平面
r 半径
I 光度
具体实施方式
图1示出了在TIRF照明的情况下光学装置的示意性原理图。可以具有一个或更多个光学透镜并具有较大数值孔径以使得TIRF显微术成为可能的显微镜的物镜101被示为黑框。来自光源(未示出)的激发光的传播方向从底部到顶部。物镜101具有焦平面FP和后焦平面BFP，焦平面FP和后焦平面BFP被限定成使得从后方(图1的底部)撞击物镜101的平行光束聚焦在焦平面FP中，而在另一方向上，从外部(图1的顶部)撞击物镜101的平行光束聚焦在后焦平面BFP中。
在图1中示出了两个光束102、104，来自光源(未示出)的这两个光束在两个不同点处穿过后焦平面BFP。光束102穿过BFP的中心，而光束104在外围点处穿过。两个光束102、104都包括以不同角度穿过这两个点的光线，即，它们没有被准直。物镜101的光学性质使得中心光束102的光线被准直以形成垂直地从物镜101出射的光束103。外围光束103也被准直，但是以角度θ(r)作为光束105射出，这取决于光束距BFP中心的距离或半径。这种依赖性说明了为什么在应发生全反射的TIRF照明的情况下，仅允许BFP中距BFP中心的距离超过临界半径的那些光线通过。
在实际的TIRFM光学单元中，此原理随后进行了修改，以使TIRF照明的孔径不直接放置在物镜101的后焦平面BFP中，而是放置在与BFP共轭的平面cBFP中。在cBFP中放置适当尺寸的环形孔径与直接在BFP中进行滤波具有相同的效果，因为cBFP被光线路径中的后续光学元件映射到物镜101的BFP中。
图2示出了第一实施方式中的具有TIRFM能力的显微镜的光学系统的示意图。非相干光源201产生激发光，该激发光经由光线路径传输到物镜206，该物镜如图1所示具有前焦平面FP和后焦平面BFP。光线路径包括第一投影透镜系统202和第二投影透镜系统204以及偏转单元205，该偏转单元例如被配置为二向色镜，借助于该偏转单元205将激发光从光源201至少部分地引导进入物镜206。在第一投影透镜系统202与第二投影透镜系统204之间的、与物镜206的后焦平面BFP共轭的平面cBFP中，布置了第一滤波器装置203，该第一滤波器装置203对激发光进行空间滤波，并被设计成能够提供各种二维图案以供空间滤波。激活通过控制单元(未示出)进行。在这种情况下，第一滤波器装置203可以被设计成透射SLM，即，借助于可编程LCD矩阵，其矩阵点可以在透明状态与非透明状态之间切换。透射SLM可以被激活以例如产生环形孔径，该环形孔径的内径等于或大于从物镜206开始的全反射的临界半径。这种设置产生TIRF照明。
在布置在物镜206的焦平面FP中的样本中激发的荧光通过物镜206返回到具有TIRFM能力的显微镜。在穿过偏转单元205和镜筒透镜207之后，其入射到检测器208上，该检测器208检测荧光并将其转换为可分析的电信号。偏转单元可以是分束器，也可以是二向色镜，其透射特性在激发光的波长与荧光的波长之间具有边沿，使得激发光几乎完全偏转，而荧光几乎完全传输到检测器208。
图3示出了具有TIRFM能力的显微镜的第二示例性实施方式，其表示第一示例性实施方式的变型。非相干激发光由光源301产生，并经由第一投影透镜系统302、第二投影透镜系统304、306和偏转单元307引导到物镜308的焦平面FP上，而另一方面，荧光则穿过物镜308、偏转单元307和管状透镜309以入射到检测器310上。然而，与第一示例性实施方式相比，第二投影透镜系统304、306被分成两部分，其中在第二投影透镜系统304、306的第一部分304与第二部分306之间存在与物镜308的焦平面FP共轭的平面cFP。在该cFP中，布置了第二空间滤波器装置305，其也是可编程的。
由于第一空间滤波器装置303布置在cBFP中，因此可以在那里产生环形孔径，由此产生TIRF照明。cFP中的第二空间滤波器装置选择焦平面FP的哪个区域被照明。以这种方式，建立了具有结构化照明的TIRF显微术(TIRF-SIM)。
在图4中示意性地示出了具有TIRFM能力的显微镜的操作的示例性应用。在图4的左侧，示出了数字微镜装置(DMD)的表面作为空间滤波器装置401的示例，该空间滤波器装置401布置在与物镜的后焦平面BFP共轭的平面cBFP中。代替DMD，也可以使用透射SLM。覆盖在该平面上方的是与物镜前面的样本位置处的全反射的临界角相对应并以cBFP的中心为中心的圆。还示出了像素簇402，其布置在三个搜索路径上，这三个搜索路径从数字微镜装置的边缘到中心彼此成120°角延伸，并且部分地布置在临界半径之外，部分地布置在临界半径之内。像素簇402被标记有不同的纹理，这也可以在图4的右侧示出的强度曲线中找到。在此可以认识到，在临界半径r之内的激发荧光的强度或光度I具有仅略微变化的量。在接近临界半径(或相应地，临界角)时，光度急剧上升，然后在临界半径之外急剧下降并最终消失。
因此，可以通过相对于各种搜索路径测量荧光的光度的最大值并计算穿过具有最大光度的像素簇的圆的圆心来确定临界角中心的位置。
对于该对中，不需要根据图3的第二示例性实施方式的结构化照明；相反，结构化是在与物镜的后焦平面BFP共轭的平面中进行的。各个像素簇允许非准直光束通过，该非准直光束在穿过物镜的焦平面FP时对应于以特定角度并且在特定方向上(参见图1)穿过样本架与样本之间的界面的准直光束，并且取决于通过角度而被完全反射或不被完全反射。
在图5中，示意性地示出了第三实施方式中的具有TIRFM能力的显微镜的光学组件。在该示例性实施方式中，显微镜包括两个不同的非相干光源501a、501b，它们可以产生不同的光谱，并且各自经由它们自己的第一投影透镜系统502a、502b朝向被设计为数字微镜装置的第一空间滤波器装置504定向，该数字微镜装置布置在与物镜507的后焦平面BFP共轭的平面cBFP中。其他组件505、506、507、508、509对应于第一示例性实施方式的组件204、205、206、207和208。关于它们功能，请参照第一和第二示例性实施方式的描述。
下面描述第一光源501a与第二光源501b之间的切换过程。第一空间滤波器装置504的微镜元件可以在第一位置与第二位置之间枢转。当使用来自第一光源501a的激发光时，产生TIRF照明所需的微镜元件被枢转到第一位置中，在该第一位置中，来自第一光源的激发光被反射到第二投影透镜系统。其余的微镜元件枢转到第二位置中，并且来自第一光源501a的激发光被传输到辐射吸收器503a(光束收集器)。这有助于非常高的对比度。第二光源501b也被分配有辐射吸收器503b。光源501a、501b和辐射吸收器503a、503b关于进一步的光线路径对称地布置，使得要从一个光源切换到另一光源，所有微镜元件的枢转位置必须简单地反转并且必须关闭第一光源501a，并且必须打开第二光源501b。
对于落射照明，两个光源501a、501b也可以都保持打开，并且为了切换，将第一空间滤波器装置504的所有微镜元件都置于第一或第二枢转位置中。
图6示意性地示出了第四实施方式中的具有TIRFM能力的显微镜的光学组件。光源601、第一投影透镜系统602、两部分式第二投影透镜系统604、606、偏转单元607、物镜608、管状透镜609和检测器610以及位于第二投影透镜系统的两个部分604、606之间的与物镜608的焦平面FP共轭的平面cFP中的第二空间滤波器装置605均对应于图3中的第二实施方式的布置和组件。代替可编程透射SLM，在第四实施方式中，提供例如以孔径环的形式的孔径改变装置603，其提供多种不同的孔径形状和尺寸。它们可以包含各种尺寸的环形孔径和圆形孔径，使得可以针对不同的临界角值设置落射照明和TIRF照明两者。
图7和图8示出了根据根据本发明的方法的对中的示例。这需要根据第一、第二或第三实施方式的布置，即，在cBFP平面的位置处的可编程空间滤波器装置。在图7中，示出了空间滤波器装置(在这种情况下为反射SLM或DMD)的表面上的x-y位置。示出了六个搜索路径，各个搜索路径彼此之间的距离为60°，其中各个搜索路径从边缘沿直线朝x＝0mm且y＝0mm处的DMD中心延伸。沿着这些搜索路径中的各个路径，小的圆形区域被清除以中继激发光，并且激发光在表面的其余部分中被阻挡。沿着六个搜索路径扫描小的清除区域，并且测量返回的荧光的光度。将测得的光度标绘为亮度，其中黑色表示正在消失的信号，白色表示强信号。在图8中，相对于距中心的距离标绘了从DMD中心在径向方向上沿着各个搜索路径的对应轨迹。
事实证明，在每个搜索路径上都找到了光度最大值，但是具有光度最大值的相应位置距中心的距离取决于搜索路径的角度。最大值位于描绘临界半径和后焦平面中心的圆上。这些值可用于对中和确定用于TIRF照明的合适环形图案的内半径。可以执行第二次搜索，使得搜索路径朝向以此方式找到的圆的圆心延伸。这样做的优点是，比图8中更好地定义了最大值，并且各个最大值与图8中用105°表示的曲线的最大值一样尖锐。这实现了最佳的分辨率和对中。
所有指定的特征(包括单独从附图获得的特征以及结合其它特征公开的单个特征)被单独和组合地视为是本发明必要的。可以通过单个特征或通过多个特征的组合来实现根据本发明的实施方式。
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