一种新琼二糖的生产方法
阅读说明：本技术 一种新琼二糖的生产方法 (Production method of neoagarobiose ) 是由 何雄飞 侯艳平 易志伟 产竹华 张春毅 王斐 于 2021-11-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于新琼二糖生产领域,具体涉及一种新琼二糖的生产方法,该方法包括将琼胶水溶液在β-琼胶酶的存在下酶解为低聚新琼寡糖液,所述β-琼胶酶的基因序列为SEQ ID NO:1；往低聚新琼寡糖液中加入硫酸进行酸解反应,再往所得酸解产物中加入碳酸钡充分搅拌沉淀,之后将体系中的沉淀通过固液分离去除,所得上清液干燥后得到新琼二糖干粉。本发明提供的方法所得产物中新琼二糖的占比较高。(The invention belongs to the field of production of new agarobiose, and particularly relates to a production method of new agarobiose, which comprises the steps of carrying out enzymolysis on an agar aqueous solution in the presence of beta-agarase to obtain oligomeric new agaro-oligosaccharide solution, wherein the gene sequence of the beta-agarase is SEQ ID NO: 1; and adding sulfuric acid into the oligomeric new agaro-oligosaccharide solution to carry out acidolysis reaction, adding barium carbonate into the obtained acidolysis product, fully stirring and precipitating, removing the precipitate in the system through solid-liquid separation, and drying the obtained supernatant to obtain the new agarobiose dry powder. The neoagarobiose in the product obtained by the method provided by the invention has a high proportion.)
技术领域
本发明属于新琼二糖生产领域，具体涉及一种新琼二糖的生产方法。
背景技术
琼脂多糖是从海洋红藻中分离得到的一种植物多糖，常见可从石花菜属、江蓠藻属等红藻中制备得到。琼脂多糖本质上是一种大分子物质，因而人体难以直接利用这一成分，只有将琼胶多糖转化为超低聚琼脂糖(DP＜100)或琼胶寡糖(2≤DP＜20)之后才能让人体有进一步利用的可能，并且也只有将其降解为小分子结构，才能更广泛地具备后续分子改造潜力。而现有的琼胶改性手段，通常只能获得超低聚琼脂糖，远远达不到目标水平。
在这些低聚结构中，新琼二糖(neoagarobiose，C12H20O10)是琼脂多糖的组成单体，其分子量仅为324.28，具备良好的生物活性以及生物安全性。据现有的文献报道，新琼二糖在肝损伤护理、癌症治疗、皮肤修护等领域具有广阔的应用前景。同时，新琼二糖还具备良好的药物改造前景，其与蛋白、脂质等生物活性物质的结合也具有潜在的成药可能。
常见琼脂多糖的降解方法主要有化学法、物理法以及酶解法。其中，化学法常见的有芬顿法以及酸解法，物理法常见的有辐射法。然而，由于化学法和物理法在琼胶多糖的降解位点上极为随机，因此产物降解度通常无法实现精准把控，并且此类方法通常对工艺的要求极为严苛，对环境也有一定损害，因此产业化实现价值不高。而酶解法由于环境友好度高、反应条件易控制，被学者们广泛研究。
由于琼脂多糖本身理化性质较为稳定，且陆地环境中少有高效降解的微生物，因此目前大部分获得的琼脂酶活性都不够理想，其主要降解产物也多集中在聚合度为4～20的琼胶寡糖上，难以获得新琼二糖占比较高的产物。少量研究报道发现了可降解得到新琼二糖的微生物或琼胶酶，但活性均较差且成品中大部分为降解不完全的多糖，新琼二糖的占比较低。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有的方法所得新琼二糖占比较低的缺陷，而提供一种新的新琼二糖的生产方法，该方法所得产物中新琼二糖的占比较高。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，采用现有的酶解法无法精确降解获得新琼二糖的主要原因在于现有琼胶酶是通过随机内切或外切的方式对琼胶多糖进行酶解，而在降解得到小分子产物之后，琼胶酶的活性位点难以再与小分子实现进一步有效结合以继续降解，进而表现为无法获得新琼二糖或者新琼二糖的占比低。本发明的发明人经过深入研究之后还发现，采用基因序列为SEQ ID NO:1的β-琼胶酶对琼胶进行酶解，并在酶解反应终点引入酸解工艺，如此获得的产物中新琼二糖的占比较高。基于此，完成了本发明。
具体地，本发明提供了一种新琼二糖的生产方法，该方法包括以下步骤：
S1、将琼胶水溶液在β-琼胶酶的存在下酶解为低聚新琼寡糖液，所述β-琼胶酶的基因序列为SEQ ID NO:1；
S2、往低聚新琼寡糖液中加入硫酸进行酸解反应，再往所得酸解产物中加入碳酸钡充分搅拌沉淀，之后将体系中的沉淀通过固液分离去除，所得上清液干燥后得到新琼二糖干粉。
根据本发明的一种
具体实施方式
，所述β-琼胶酶通过克隆或化学合成法从所述菌属或菌种中获得酶基因，将该酶基因引入原核表达载体中得到重组载体，之后将所述重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株，所述重组菌株经发酵、分离纯化后得到所述β-琼胶酶。所述β-琼胶酶的基因序列为SEQ ID NO:1，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。其中，通过克隆或化学合成法获得酶基因、将酶基因引入原核表达载体中得到重组载体、将重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株的方式均为本领域技术人员公知，在此不作赘述。所述原核表达载体例如可以为PET系列的表达载体(如PET-14、PET-21、PET-22、PET-25、PET-28)、PGEX系列的表达载体(如PGEX-4T-2、PGEX-6T-1)等。所述大肠杆菌例如可以为大肠杆菌BL21(DE3)。
SEQ ID NO:1：
ATGCATCATCATCATCATCATCGACCTAAGTTCATAAACTTTCACGCAAAGTCCCACGATAAAGACGTGACCGCTTTCTACGAAGAATATGACGTATACCTTGGCCGAGGCTTCTGGGGAATGATTAAAACAGTGCTGCGCAAGGGATTTACAAAACGCTCCACGGTGGGTATACACGTTGACACAGCAGACGTCGGCTCGACTTATCCGAATTCTACTATAATTGATAAATCAACGGACGTCAAGGAGGTCTCTAATCTCATAGGAACAGAACACGAGAAACCGTTTTGGCCGGATGCTGGAGAAATGTCGCTGATGGACGCATCTACCTCGGGGGACTTTATGGGTCAGTTTTTTAACGAGTTTGTCGATGCAGGTGCTACTAACTCGGATGATCGGCCAAAATACGTCGAAATCATCAATGAACCCTTTTGGCATGCTCATGACTTTTATGAGATTACTGCAAAGGAGATGGCGGAACTCTTTGGTACTATCGCAGCGCAAGTTCACGATACTCCGTCGCTCGGAAAGATGAAGGTTGGTGGCTATTGTACCGGTTTCCCAGATTTTGAAATCAATAACTTTGCACATTGGGAAGATAATATGAAAATGTTCATGGATGTGGCGGGAGATGATATGGACTTTTGGTCTATACACCTATACGATTTTCCTTCGGGAATAACCCAGAACAATAATCGCTCGGGATCCAACATGGAAGCGGTTCTAGATCTTATAGAGACGTATTCGATGTGGAAGGGAGGCAAGGTCAAACCTCATGCGATCACACAATACGGGGTTATCACCCATGGTTTCGACAATTACACACCGTATCGGGATTGGCTTCACATCAAATCAACAAATTCTATGCTGATGCAGTTTATGGAGCGCACGGACAATATATGCTATGCAATGCCGTTTGCCATGGATAAATCCACGTGGCACCTAACGGAGAATAATGGGCAGCCTGGTGCACTCTTCATACCTACCAATATCGGTGAAAAGGAAGTAGAGCAGTGGGTGTTCACGGAAATGATCAAATTCTATCAACTTTGGAAGACCGGAGTTTCTGTCAATCCGGCGTCAACGTCCGTAGCAGTTGCGGCTACGCAGAAATTCACAGCAGGCATAACGATGGCTGATGCTGGCGTGGTATGGTCCGTTGCTAATGAATCGGTGGCACTAGTCTCCGCGACTGGGAAGGTAACAGCTGTTAAGAAGGGCAAGCTGACCATCACAGCAACCACTACGGACGAATTTGCGGCAGTACTTATCCAAAAGATAGAAGCGGAAGATTTCGGGGCTTATCTAGATCGCATCAACGAGGGCGTTAATATCGATTCTACAACAGCTGGGCAGGAGACGGGCGAATGGACCTCATACGCAGGTACGGATGTTAATATACCCGAATCAGCAATCTATACGATCTCGGTCAACACATCAACTTCGACAGAGTCGTCCCTTGATCTTATAGAGGATAACAAAATCTGTGAAACTATCGAAGTAAATAACAATGCCCTTACGGAGGTAAAAGTGGAGCTAGCCGGTTCACATGTGCTCGGACACGGGGATGTTAAGATAAATTGGCTTTTCAGTTAA。
SEQ ID NO:2：
MHHHHHHRPKFINFHAKSHDKDVTAFYEEYDVYLGRGFWGMIKTVLRKGFTKRSTVGIHVDTADVGSTYPNSTIIDKSTDVKEVSNLIGTEHEKPFWPDAGEMSLMDASTSGDFMGQFFNEFVDAGATNSDDRPKYVEIINEPFWHAHDFYEITAKEMAELFGTIAAQVHDTPSLGKMKVGGYCTGFPDFEINNFAHWEDNMKMFMDVAGDDMDFWSIHLYDFPSGITQNNNRSGSNMEAVLDLIETYSMWKGGKVKPHAITQYGVITHGFDNYTPYRDWLHIKSTNSMLMQFMERTDNICYAMPFAMDKSTWHLTENNGQPGALFIPTNIGEKEVEQWVFTEMIKFYQLWKTGVSVNPASTSVAVAATQKFTAGITMADAGVVWSVANESVALVSATGKVTAVKKGKLTITATTTDEFAAVLIQKIEAEDFGAYLDRINEGVNIDSTTAGQETGEWTSYAGTDVNIPESAIYTISVNTSTSTESSLDLIEDNKICETIEVNNNALTEVKVELAGSHVLGHGDVKINWLFS
进一步地，步骤S1中，所述酶解的条件使所得低聚新琼寡糖液的聚合度为20以下，优选为4～20。
进一步地，步骤S1中，所述酶解的条件使所得低聚新琼寡糖液为新琼四糖、新琼六糖和新琼八糖中的至少一种，优选为新琼四糖和/或新琼六糖。
进一步地，步骤S1中，所述酶解的条件包括温度为40～50℃，时间为3～8h。
进一步地，步骤S1中，以琼胶水溶液的总重量为100g计，所述β-琼胶酶的用量为0.1～1mL，具体可以为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL。
进一步地，步骤S2中，所述酸解反应的条件包括温度为20～70℃，具体可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃等；时间为2～5h，具体为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h等。
进一步地，步骤S2中，所述硫酸的用量使得酸解反应体系中硫酸的浓度为0.05～0.2mol/L。
进一步地，步骤S2中，所述碳酸钡与硫酸的摩尔比为(2～3):1。
进一步地，步骤S2中，所述固液分离的方法为离心分离。
进一步地，步骤S2中，所述干燥的方法选自真空冷冻干燥、蒸发干燥和结晶过滤干燥中的至少一种。
进一步地，本发明提供的新琼二糖的生产方法还包括步骤S1中，将酶解所得低聚新琼寡糖液进行纯化和浓缩。其中，所述纯化的方法具体可以选自滤纸过滤、板框过滤、膜过滤、离心和树脂纯化中的至少一种。所述浓缩的方法具体可以选自减压浓缩、真空浓缩和蒸发浓缩中的至少一种。
进一步地，本发明提供的新琼二糖的生产方法还包括步骤S2中，在干燥之前，将所述上清液进行凝胶柱纯化以分离出新琼二糖，此时能够对粗产物进行进一步分离纯化，得到高纯品，应用范围更加广泛。此外，所述凝胶柱纯化分离的具体操作过程以及条件为本领域技术人员所知悉，对此不作赘述。
本发明创造性地采用具有特定基因序列的β-琼胶酶并在酶解法反应终点引入了酸解工艺，所得产物中新琼二糖的占比能够达到34％以上，其余组分为琼胶一糖、琼胶三糖以及新琼四糖，对细胞无刺激性和致突变性。此外，本发明以硫酸作为酸解媒介，由于琼胶底物本身就存在一定量的硫酸根，因此选用硫酸不会引入新的杂质离子，而酸解之后通过碳酸钡与硫酸根的联用，可以将杂质硫酸根离子沉淀，后续再通过简单的离心工艺即可将所有盐杂质去除，降低了产业化应用的难度。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下制备例中，β-琼胶酶通过以下方法获得：按照通过化学合成法从相应菌属或菌种中获得基因序列为SEQ ID NO:1的酶基因，将该酶基因引入PET-14表达载体中得到重组载体，之后将所述重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株，所述重组菌株经发酵、分离纯化后得到所述β-琼胶酶。
在没有特别说明的情况下，所述β-琼胶酶中涉及的操作可按照本领域常规技术手段进行，例如，如“《分子克隆实验指南(第四版)》J.萨姆布鲁克、M.R.格林”所公开的。
以下实施例和对比例中，酶活单位的定义为：在最适条件下每分钟释放1μmol还原糖(mmol，U)所需要的酶量(mL)。
实施例1
S1、往100g的琼胶水溶液(琼胶浓度为1wt％)中加入0.1mLβ-琼胶酶(基因序列为SEQ ID NO:1且氨基酸序列为SEQ ID NO:2，酶活为200U/mL)，之后于40℃下酶解8h，再将所得酶解产物经高速冷冻离心机离心以去除未被降解的胶体，之后再将上清液减压浓缩得到低聚新琼寡糖液，其主要为新琼四糖和新琼六糖的混合物；
S2、往低聚新琼寡糖液中加入硫酸以使得体系中硫酸浓度为0.05mol/L，之后于70℃下酸解2h，接着往酸解产物中加入碳酸钡充分搅拌沉淀，碳酸钡与硫酸的摩尔比为3:1，再将体系中的沉淀通过离心去除，所得上清液经真空冷冻干燥，得到新琼二糖干粉。经检测，该新琼二糖干粉中新琼二糖的占比为41.3％。
实施例2
S1、往100g的琼胶水溶液(琼胶浓度为1.5wt％)中加入0.5mLβ-琼胶酶(基因序列为SEQ ID NO:1且氨基酸序列为SEQ ID NO:2，酶活为200U/mL)，之后于45℃下酶解5h，再将所得酶解产物经高速冷冻离心机离心以去除未被降解的胶体，之后再将上清液减压浓缩得到低聚新琼寡糖液，其主要为新琼四糖和新琼六糖的混合物；
S2、往低聚新琼寡糖液中加入硫酸以使得体系中硫酸浓度为0.1mol/L，之后于50℃下酸解3h，接着往酸解产物中加入碳酸钡充分搅拌沉淀，碳酸钡与硫酸的摩尔比为3:1，再将体系中的沉淀通过离心去除，所得上清液经真空冷冻干燥，得到新琼二糖干粉。经检测，该新琼二糖干粉中新琼二糖的占比为38.7％。
实施例3
S1、往100g的琼胶水溶液(琼胶浓度为2wt％)中加入1mLβ-琼胶酶(基因序列为SEQID NO:1且氨基酸序列为SEQ ID NO:2，酶活为200U/mL)，之后于50℃下酶解3h，再将所得酶解产物经高速冷冻离心机离心以去除未被降解的胶体，之后再将上清液减压浓缩得到低聚新琼寡糖液，其主要为新琼四糖和新琼六糖的混合物；
S2、往低聚新琼寡糖液中加入硫酸以使得体系中硫酸浓度为0.2mol/L，之后于20℃下酸解5h，接着往酸解产物中加入碳酸钡充分搅拌沉淀，碳酸钡与硫酸的摩尔比为3:1，再将体系中的沉淀通过离心去除，所得上清液经凝胶柱分离纯化后进行真空冷冻干燥，得到新琼二糖干粉。经检测，该新琼二糖干粉中新琼二糖的占比为34.2％。
对比例1
按照实施例1的方法制备新琼二糖干粉，不同的是，将基因序列为SEQ ID NO:1的β-琼胶酶采用CN110438182A中公开的β-琼胶酶(酶活为200U/mL)替代，β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3：
MTFTKSKIATVLSLSLLGIYGCASTTPQNEQAAAGEQVVEDMGGALPDFESDKFFSKLKAEHAKASAVTDTGVTAGSQALKIDFDSVNEANKFKFWPNVKLHPDTGNWNWNAKGSLTLDVTNPTDSTANIILKIADNVGVMGAGDNQLNYALSVPAGETVPVEMIFNGSKRKLDGYWGGEKINLRKLVEFQIFVQGPIDQQSVIVDNFALVDATGDFVEASGAEEVVTGPVPTVLAITDFEKGQDSFISAERSVATTISPVKTDDGAAIDVLFSASNSYPNITFRPDVPWDWSGQGDFNVAFDMVNKSDEPLQLFVRVDDDEHEAFGGTANGVQNSWSGYVTIAPNDEGTYYLSLMPAGDQMVSGMRGEPPKKSYKAQAISYGWGDNNLDLSNIYSMQLYLQNPTADQKLQISSVRLIPNLESDTSRYEGLLDEFGQYTGQDWAQKVKSLEDLQAAGAAELDSLEHPTQLPDRSKFGGWADGPKLEATGFFRAEKVDGKWALVDPEGYLFFVTGLDNIRMDDTVTITGVDFSNKETREGREVASELRNSMFTWLPEYDDVLAESYDYADWIHTGALKKGEVFSFYSANLQRKYQTSREEALKIWKDVTLNRMQDWGFTTLGNWADPKFYDNQQIAYAANGWIFGDHARISTGNDYWGPIHDPFDPEFAVSTRKMAEKVASEVSKDDPWLMGIFVDNEISWGNTKNEANHYGLVVNALSYDIKESPAKAAFTKHLQDKYSSIDALNQSWGTKVTSWADFEVSFDHRSRLSSSMKKDYSEMLQMLSEKYFSTVQAELKKVLPNHMYLGARFADWGVTPEIARGAAPYVDVMSYNLYAEDLNSKGDWSLLPELDKPSIIGEFHFGATDTGLFHGGIVSASNQADRAKKYTHYMQSIVDNPYFVGAHWFQYLDSPTTGRAWDGENYNVGFVSITDTPYQELIDAAKQFNRDLYNLRYKK，其余条件与实施例1相同，得到参比新琼二糖干粉。经检测，该参比新琼二糖干粉中新琼二糖的占比为17.5％。
对比例2
按照实施例1的方法制备新琼二糖干粉，不同的是，将酶解和酸解的顺序替换，具体步骤如下：
S1、往100g的琼胶水溶液(琼胶浓度为1wt％)中加入硫酸以使得体系中硫酸浓度为0.05mol/L，之后于70℃下酸解2h，接着往体系中加入碳酸钡充分搅拌沉淀，碳酸钡与硫酸用量的摩尔比为3:1，再通过高速冷冻离心去除沉淀，所得上清液即为酸解产物；
S2、往酸解产物中加入0.1mLβ-琼胶酶(基因序列为SEQ ID NO:1且氨基酸序列为SEQ ID NO:2，酶活为200U/mL)，之后于40℃下酶解8h，再将所得酶解产物经高速冷冻离心以去除未被降解的胶体，之后再将上清液减压浓缩得到参比新琼二糖干粉。经检测，该参比新琼二糖干粉中新琼二糖的占比为3.7％。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 蓝脑科技（厦门）有限公司
<120> 一种琼胶酶冻干保护剂及琼胶酶的保存方法
<130> NNKE-21002-NUI
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1596
<212> DNA
<213> β-琼胶酶编码基因
<400> 1
atgcatcatc atcatcatca tcgacctaag ttcataaact ttcacgcaaa gtcccacgat 60
aaagacgtga ccgctttcta cgaagaatat gacgtatacc ttggccgagg cttctgggga 120
atgattaaaa cagtgctgcg caagggattt acaaaacgct ccacggtggg tatacacgtt 180
gacacagcag acgtcggctc gacttatccg aattctacta taattgataa atcaacggac 240
gtcaaggagg tctctaatct cataggaaca gaacacgaga aaccgttttg gccggatgct 300
ggagaaatgt cgctgatgga cgcatctacc tcgggggact ttatgggtca gttttttaac 360
gagtttgtcg atgcaggtgc tactaactcg gatgatcggc caaaatacgt cgaaatcatc 420
aatgaaccct tttggcatgc tcatgacttt tatgagatta ctgcaaagga gatggcggaa 480
ctctttggta ctatcgcagc gcaagttcac gatactccgt cgctcggaaa gatgaaggtt 540
ggtggctatt gtaccggttt cccagatttt gaaatcaata actttgcaca ttgggaagat 600
aatatgaaaa tgttcatgga tgtggcggga gatgatatgg acttttggtc tatacaccta 660
tacgattttc cttcgggaat aacccagaac aataatcgct cgggatccaa catggaagcg 720
gttctagatc ttatagagac gtattcgatg tggaagggag gcaaggtcaa acctcatgcg 780
atcacacaat acggggttat cacccatggt ttcgacaatt acacaccgta tcgggattgg 840
cttcacatca aatcaacaaa ttctatgctg atgcagttta tggagcgcac ggacaatata 900
tgctatgcaa tgccgtttgc catggataaa tccacgtggc acctaacgga gaataatggg 960
cagcctggtg cactcttcat acctaccaat atcggtgaaa aggaagtaga gcagtgggtg 1020
ttcacggaaa tgatcaaatt ctatcaactt tggaagaccg gagtttctgt caatccggcg 1080
tcaacgtccg tagcagttgc ggctacgcag aaattcacag caggcataac gatggctgat 1140
gctggcgtgg tatggtccgt tgctaatgaa tcggtggcac tagtctccgc gactgggaag 1200
gtaacagctg ttaagaaggg caagctgacc atcacagcaa ccactacgga cgaatttgcg 1260
gcagtactta tccaaaagat agaagcggaa gatttcgggg cttatctaga tcgcatcaac 1320
gagggcgtta atatcgattc tacaacagct gggcaggaga cgggcgaatg gacctcatac 1380
gcaggtacgg atgttaatat acccgaatca gcaatctata cgatctcggt caacacatca 1440
acttcgacag agtcgtccct tgatcttata gaggataaca aaatctgtga aactatcgaa 1500
gtaaataaca atgcccttac ggaggtaaaa gtggagctag ccggttcaca tgtgctcgga 1560
cacggggatg ttaagataaa ttggcttttc agttaa 1596
<210> 2
<211> 531
<212> PRT
<213> β-琼胶酶氨基酸序列
<400> 2
Met His His His His His His Arg Pro Lys Phe Ile Asn Phe His Ala
1 5 10 15
Lys Ser His Asp Lys Asp Val Thr Ala Phe Tyr Glu Glu Tyr Asp Val
20 25 30
Tyr Leu Gly Arg Gly Phe Trp Gly Met Ile Lys Thr Val Leu Arg Lys
35 40 45
Gly Phe Thr Lys Arg Ser Thr Val Gly Ile His Val Asp Thr Ala Asp
50 55 60
Val Gly Ser Thr Tyr Pro Asn Ser Thr Ile Ile Asp Lys Ser Thr Asp
65 70 75 80
Val Lys Glu Val Ser Asn Leu Ile Gly Thr Glu His Glu Lys Pro Phe
85 90 95
Trp Pro Asp Ala Gly Glu Met Ser Leu Met Asp Ala Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Asp Phe Met Gly Gln Phe Phe Asn Glu Phe Val Asp Ala Gly Ala Thr
115 120 125
Asn Ser Asp Asp Arg Pro Lys Tyr Val Glu Ile Ile Asn Glu Pro Phe
130 135 140
Trp His Ala His Asp Phe Tyr Glu Ile Thr Ala Lys Glu Met Ala Glu
145 150 155 160
Leu Phe Gly Thr Ile Ala Ala Gln Val His Asp Thr Pro Ser Leu Gly
165 170 175
Lys Met Lys Val Gly Gly Tyr Cys Thr Gly Phe Pro Asp Phe Glu Ile
180 185 190
Asn Asn Phe Ala His Trp Glu Asp Asn Met Lys Met Phe Met Asp Val
195 200 205
Ala Gly Asp Asp Met Asp Phe Trp Ser Ile His Leu Tyr Asp Phe Pro
210 215 220
Ser Gly Ile Thr Gln Asn Asn Asn Arg Ser Gly Ser Asn Met Glu Ala
225 230 235 240
Val Leu Asp Leu Ile Glu Thr Tyr Ser Met Trp Lys Gly Gly Lys Val
245 250 255
Lys Pro His Ala Ile Thr Gln Tyr Gly Val Ile Thr His Gly Phe Asp
260 265 270
Asn Tyr Thr Pro Tyr Arg Asp Trp Leu His Ile Lys Ser Thr Asn Ser
275 280 285
Met Leu Met Gln Phe Met Glu Arg Thr Asp Asn Ile Cys Tyr Ala Met
290 295 300
Pro Phe Ala Met Asp Lys Ser Thr Trp His Leu Thr Glu Asn Asn Gly
305 310 315 320
Gln Pro Gly Ala Leu Phe Ile Pro Thr Asn Ile Gly Glu Lys Glu Val
325 330 335
Glu Gln Trp Val Phe Thr Glu Met Ile Lys Phe Tyr Gln Leu Trp Lys
340 345 350
Thr Gly Val Ser Val Asn Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Val Ala Ala
355 360 365
Thr Gln Lys Phe Thr Ala Gly Ile Thr Met Ala Asp Ala Gly Val Val
370 375 380
Trp Ser Val Ala Asn Glu Ser Val Ala Leu Val Ser Ala Thr Gly Lys
385 390 395 400
Val Thr Ala Val Lys Lys Gly Lys Leu Thr Ile Thr Ala Thr Thr Thr
405 410 415
Asp Glu Phe Ala Ala Val Leu Ile Gln Lys Ile Glu Ala Glu Asp Phe
420 425 430
Gly Ala Tyr Leu Asp Arg Ile Asn Glu Gly Val Asn Ile Asp Ser Thr
435 440 445
Thr Ala Gly Gln Glu Thr Gly Glu Trp Thr Ser Tyr Ala Gly Thr Asp
450 455 460
Val Asn Ile Pro Glu Ser Ala Ile Tyr Thr Ile Ser Val Asn Thr Ser
465 470 475 480
Thr Ser Thr Glu Ser Ser Leu Asp Leu Ile Glu Asp Asn Lys Ile Cys
485 490 495
Glu Thr Ile Glu Val Asn Asn Asn Ala Leu Thr Glu Val Lys Val Glu
500 505 510
Leu Ala Gly Ser His Val Leu Gly His Gly Asp Val Lys Ile Asn Trp
515 520 525
Leu Phe Ser
530
<210> 3
<211> 955
<212> PRT
<213> β-琼胶酶
<400> 3
Met Thr Phe Thr Lys Ser Lys Ile Ala Thr Val Leu Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ile Tyr Gly Cys Ala Ser Thr Thr Pro Gln Asn Glu Gln Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Glu Gln Val Val Glu Asp Met Gly Gly Ala Leu Pro Asp
35 40 45
Phe Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ser Lys Leu Lys Ala Glu His Ala Lys
50 55 60
Ala Ser Ala Val Thr Asp Thr Gly Val Thr Ala Gly Ser Gln Ala Leu
65 70 75 80
Lys Ile Asp Phe Asp Ser Val Asn Glu Ala Asn Lys Phe Lys Phe Trp
85 90 95
Pro Asn Val Lys Leu His Pro Asp Thr Gly Asn Trp Asn Trp Asn Ala
100 105 110
Lys Gly Ser Leu Thr Leu Asp Val Thr Asn Pro Thr Asp Ser Thr Ala
115 120 125
Asn Ile Ile Leu Lys Ile Ala Asp Asn Val Gly Val Met Gly Ala Gly
130 135 140
Asp Asn Gln Leu Asn Tyr Ala Leu Ser Val Pro Ala Gly Glu Thr Val
145 150 155 160
Pro Val Glu Met Ile Phe Asn Gly Ser Lys Arg Lys Leu Asp Gly Tyr
165 170 175
Trp Gly Gly Glu Lys Ile Asn Leu Arg Lys Leu Val Glu Phe Gln Ile
180 185 190
Phe Val Gln Gly Pro Ile Asp Gln Gln Ser Val Ile Val Asp Asn Phe
195 200 205
Ala Leu Val Asp Ala Thr Gly Asp Phe Val Glu Ala Ser Gly Ala Glu
210 215 220
Glu Val Val Thr Gly Pro Val Pro Thr Val Leu Ala Ile Thr Asp Phe
225 230 235 240
Glu Lys Gly Gln Asp Ser Phe Ile Ser Ala Glu Arg Ser Val Ala Thr
245 250 255
Thr Ile Ser Pro Val Lys Thr Asp Asp Gly Ala Ala Ile Asp Val Leu
260 265 270
Phe Ser Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Asn Ile Thr Phe Arg Pro Asp Val
275 280 285
Pro Trp Asp Trp Ser Gly Gln Gly Asp Phe Asn Val Ala Phe Asp Met
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Val Asn Lys Ser Asp Glu Pro Leu Gln Leu Phe Val Arg Val Asp Asp
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Asp Glu His Glu Ala Phe Gly Gly Thr Ala Asn Gly Val Gln Asn Ser
325 330 335
Trp Ser Gly Tyr Val Thr Ile Ala Pro Asn Asp Glu Gly Thr Tyr Tyr
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Leu Ser Leu Met Pro Ala Gly Asp Gln Met Val Ser Gly Met Arg Gly
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Glu Pro Pro Lys Lys Ser Tyr Lys Ala Gln Ala Ile Ser Tyr Gly Trp
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Gly Asp Asn Asn Leu Asp Leu Ser Asn Ile Tyr Ser Met Gln Leu Tyr
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Leu Gln Asn Pro Thr Ala Asp Gln Lys Leu Gln Ile Ser Ser Val Arg
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Leu Ile Pro Asn Leu Glu Ser Asp Thr Ser Arg Tyr Glu Gly Leu Leu
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Glu His Pro Thr Gln Leu Pro Asp Arg Ser Lys Phe Gly Gly Trp Ala
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Asp Gly Pro Lys Leu Glu Ala Thr Gly Phe Phe Arg Ala Glu Lys Val
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Asp Gly Lys Trp Ala Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Val
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Thr Gly Leu Asp Asn Ile Arg Met Asp Asp Thr Val Thr Ile Thr Gly
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