具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：以半乳糖醇作为原料，液体酶(agMDH,ScNoxE)制备L-半乳糖

在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入27.3克半乳糖醇(150mM)，1.42克氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺,2mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入粗酶液(1500U agMDH、3000U ScNoxE)，随后将反应液转入耐压反应器中维持1.5个大气压的氧气压力下30℃缓慢搅拌反应6小时。反应结束后加HCl水溶液调节pH到1.0变性、沉淀蛋白并高速离心除去，然后再将溶液pH调节到pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂(天津允开树脂科技有限公司)除杂，最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得22克L-半乳糖(无色颗粒状固体,收率82％)。

对所得产物做HPLC分析。Phenomenex(菲罗门)Rezex RHM系列单糖分析色谱柱(7.8mm x 300mm,8μm)，用纯水做流动相，流速0.2ml/min，在35℃用折射率检测器(Agilent,1100Series,G1362A)检测。HPLC图谱如图1所示。

所得产物的1H-NMR谱图如图2所示，Varian 600兆核磁，D2O为溶剂。

综合图1、图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例2：以半乳糖醇作为原料，固定化酶(agMDH,ScNoxE)制备L-半乳糖

与实施例1类似，但混合固定的agMDH、ScNoxE酶而非液体酶被用来催化，反应结束后固定化酶可以回收使用。

在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18.2克半乳糖醇(100mM)，1.42克氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺，2mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入固定化混合酶(5000U，agMDH、ScNoxE活性单位比1:5)，随后将反应液转入耐压反应器中维持2个大气压的氧气压力下30℃缓慢震荡反应12小时。待反应完成后过滤回收固定化酶(固定化酶用50mM pH 8.0Tris缓冲液洗涤三次后4℃保存备用)，滤液pH值调节到7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得14.9克L-半乳糖(收率83％)，过滤回收的固定化混合酶具有74％的初始酶活力。

所得产物的HPLC图谱同图1，1H-NMR谱图同图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例3：以半乳糖醇作为原料，液体酶(agMDH,TtNoxE,Catalase)制备L-半乳糖

在1L 100mM pH 7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18.2克半乳糖醇(100mM)，1.42克氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NAD⁺,2mM)，然后调节溶液pH值到7.5后，加入粗酶液(1000U agMDH、3000U TtNoxE、1000U catalase)，随后将反应液转入耐压反应器中维持2个大气压的氧气压力下30℃缓慢搅拌反应8小时。反应结束后加HCl水溶液调节pH到1.0变性、沉淀蛋白并高速离心除去，然后再将溶液pH调节到pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂(天津允开树脂科技有限公司)除杂，最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得12.8克L-半乳糖(无色颗粒状固体,收率71％)。

所得产物的HPLC图谱同图1，1H-NMR谱图同图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例4：以D-半乳糖作为原料，液体酶(aldR,agMDH)制备L-半乳糖

在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18克D-半乳糖(100mM),0.71克还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH,1mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入粗酶液(800U aldR、2000U agMDH)启动反应，维持反应液在25℃缓慢搅拌5个小时，在反应过程中通过添加酸碱来维持反应体系pH 7.0～8.5。反应结束后加入HCl水溶液调节pH到1.0终止反应、沉淀蛋白，然后调节反应液至pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得15.1克L-半乳糖(无色颗粒状固体，收率84％)。

所得产物的HPLC图谱同图1，1H-NMR谱图同图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例5：以D-半乳糖作为原料，固定化酶(aldR,agMDH)制备L-半乳糖

与实施例4类似，但混合固定的aldR、agMDH酶而非液体酶被用来催化，反应结束后固定化酶可以回收使用。

同样在1L 50mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中加入18克D-半乳糖(100mM),0.71克还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐(NADH,1mM)，然后调节溶液pH值到8.0后，加入3000U固定化酶(aldR与agMDH活性比为1:3)启动反应，维持反应液在25℃缓慢搅拌12个小时，反应过程中维持体系pH 7.0～9.0。待反应完成后过滤回收固定化酶(固定化酶用50mM pH 8.0Tris缓冲液洗涤三次后4℃保存备用)，滤液pH值调节到7.0后利用D201阴离子交换树脂纯化，收集的产品溶液最后利用反渗透膜除盐后浓缩、结晶(乙醇:水,3:1,v:v)得14.2克L-半乳糖(收率79％)，过滤回收的固定化混合酶具有83％的初始酶活力。

所得产物的HPLC图谱同图1，1H-NMR谱图同图2，可以确认所得产物为L-半乳糖。

实施例6：酶的发酵生产

本发明所用酶均为实验室发酵生产(除了过氧化氢酶Catalase购于诺维信)，以下是制备酶的基本操作流程。

首先通过基因公司(安徽通用生物)合成该酶所对应的基因序列(SEQ.ID.NO.5～SEQ.ID.NO.8)，然后通过NdeI/XhoI酶切位点亚克隆到pET28a质粒上，并将该质粒转入E.coli(BL21)(擎科生物)细胞进行平板培养，最后挑单克隆进行液体逐级放大培养。

以下是细胞逐级放大培养的基本流程，首先将平板上的单菌落转入5ml含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250ml含同样抗菌素的LB培养液中，最后再转入5L培养发酵罐里进行培养；当细胞OD600约为20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)26℃诱导蛋白表达6小时，然后离心(4000rpm,15min)收集湿细胞30-55g。

为验证酶的表达，首先取少量细胞与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM,pH 8.0)混合均匀，随后利用冻融法破碎细胞，高速离心后取上清液跑SDS-PAGE蛋白凝胶(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)确定蛋白可溶表达(图3)；确认正确的剩余细胞先与缓冲液混匀(10克湿细胞与约200ml上市缓冲液混合)，然后进行高压破碎细胞、高速离心(16000rpm,45min)除细胞壁，最后所获得含酶清液(即为粗酶液)直接进行后续使用(该液体粗酶活力在180～400U/ml,U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)或进一步纯化后固定化使用(固体酶反应时)。

LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。

实施例7：酶的混合固定

向实施例6收集的甘露醇脱氢酶(agMDH)、NADH氧化酶(ScNoxE)、半乳糖还原酶(aldR)粗酶液中逐量加入硫酸铵固体直至酶析出(30％-60％,w/v硫酸铵/缓冲液)。该酶固体随后通过离心收集(10000rpm,12min)，并缓慢溶入25mM pH 8.0的Tris缓冲液中,最后经G25尺寸排阻色谱柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化液体酶agMDH、ScNoxE、aldR，该酶液可以直接被用来进行后续的酶固定。

在agMDH/ScNoxE酶的混合固定中，初纯化酶aldR、ScNoxE利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)进行混合固定。

固定的基本方法是:按活力单位比例将酶溶解在2L 50mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入40mM苯氧乙酸以及600克LX-1000EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌5小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用；agMDH/ScNoxE固定化混合酶具有对应液体酶的70-91％的活性。

同样的方法可以对aldR/agMDH酶进行混合固定，固定化酶具有液体酶的78-89％的活力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> L-半乳糖的合成方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> agMDH

<400> 1

Met Ala Lys Ser Ser Glu Ile Glu His Pro Val Lys Ala Ile Gly Trp

1 5 10 15

Ala Ala Arg Asp Thr Thr Gly Leu Leu Ser Pro Phe Lys Phe Ser Arg

20 25 30

Arg Ala Thr Gly Glu Lys Asp Val Arg Leu Lys Val Leu Phe Cys Gly

35 40 45

Val Cys His Ser Asp His His Met Ile His Asn Asn Trp Gly Phe Thr

50 55 60

Thr Tyr Pro Ile Val Pro Gly His Glu Ile Val Gly Val Val Thr Glu

65 70 75 80

Val Gly Ser Lys Val Glu Lys Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Gly Ile

85 90 95

Gly Cys Leu Val Gly Ser Cys Arg Ser Cys Glu Ser Cys Cys Asp Asn

100 105 110

Arg Glu Ser His Cys Glu Asn Thr Ile Asp Thr Tyr Gly Ser Ile Tyr

115 120 125

Phe Asp Gly Thr Met Thr His Gly Gly Tyr Ser Asp Thr Met Val Ala

130 135 140

Asp Glu His Phe Ile Leu Arg Trp Pro Lys Asn Leu Pro Leu Asp Ser

145 150 155 160

Gly Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Lys

165 170 175

Tyr Tyr Gly Leu Asp Lys Pro Gly Thr Lys Ile Gly Val Val Gly Leu

180 185 190

Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Lys Met Ala Lys Ala Phe Gly Ala

195 200 205

Gln Val Thr Val Ile Asp Ile Ser Glu Ser Lys Arg Lys Glu Ala Leu

210 215 220

Glu Lys Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Leu Asn Ser Asp Gln Glu Gln

225 230 235 240

Met Lys Gly Ala Arg Ser Ser Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Pro

245 250 255

Val Asn His Pro Leu Ala Pro Leu Phe Asp Leu Leu Lys Pro Asn Gly

260 265 270

Lys Leu Val Met Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Phe Glu Leu Pro Val

275 280 285

Phe Ser Leu Leu Lys Gly Arg Lys Leu Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gly

290 295 300

Gly Ile Lys Glu Thr Gln Glu Met Leu Asp Phe Ala Ala Lys His Asn

305 310 315 320

Ile Thr Ala Asp Val Glu Val Ile Pro Met Asp Tyr Val Asn Thr Ala

325 330 335

Met Glu Arg Leu Val Lys Gly Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Ile Asp

340 345 350

Ile Ala Asn Thr Met Arg Thr Glu Glu Ser Leu Gly Ala

355 360 365

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> 闪烁梭菌(Clostridium scindens)

<220>

<223> ScNoxE

<400> 2

Met Gly Ala Ala Tyr Cys Val His Gly Gly Arg Tyr Arg Lys Val Ser

1 5 10 15

Asp Arg Ile Ile Val Ile Gly Ala Asn His Ala Gly Thr Ala Ala Leu

20 25 30

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Pro Ile Gln Pro Lys Val Lys Gly Met Glu Leu Lys Asn Val Gln

130 135 140

Phe Val Lys Leu Tyr Gln Asn Ala Ala Asp Val Ile Glu Lys Leu Glu

145 150 155 160

Asp Pro Ser Ile Gln Lys Val Thr Ile Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly

165 170 175

Val Glu Leu Ala Glu Ala Phe Ala Arg Asn Gly Arg Lys Thr Thr Leu

180 185 190

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195 200 205

Cys Lys Ile Met Glu Glu Asn Leu Arg Glu Asn Gly Val Arg Thr Ala

210 215 220

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225 230 235 240

Val Val Thr Asp Lys Asp Ser Tyr Asp Thr Asp Met Ala Val Phe Cys

245 250 255

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260 265 270

Phe Arg Asn Gly Ala Phe Leu Val Asp Leu His Gln Gln Ala Ser Arg

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Gly Ile Ile Ala Ala His Asn Ala Cys Gly Thr Pro Leu Glu Ser Ala

325 330 335

Gly Val Gln Gly Ser Asn Ala Ile Cys Ile Trp Gly Leu Asn Met Val

340 345 350

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355 360 365

Ala Ala Ala Asp Tyr Glu Asp Trp Gln Lys Ala Gly Phe Ile Glu Ser

370 375 380

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Ile Val Leu Gly Ala Gln Met Cys Ser Lys Tyr Asp Ile Ser Met Gly

405 410 415

Ile His Met Phe Ser Leu Ala Ile Gln Glu Gln Val Thr Ile Asp Lys

420 425 430

Leu Lys Leu Leu Asp Leu Phe Phe Leu Pro His Phe Asn Gln Pro Tyr

435 440 445

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<210> 3

<211> 205

<212> PRT

<213> 噬热栖热菌(Thermus thermophilus)

<220>

<223> TtNoxE

<400> 3

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Leu Arg Glu Ile Leu Glu Ala Ala Leu Arg Ala Pro Ser Ala Trp Asn

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Ala Leu Arg Glu Ala Ala Phe Gly Gln Ala His Val Glu Glu Ala Pro

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Val Val Leu Val Leu Tyr Ala Asp Leu Glu Asp Ala Leu Ala His Leu

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Asp Glu Val Ile His Pro Gly Val Gln Gly Glu Arg Arg Glu Ala Gln

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Lys Gln Ala Ile Gln Arg Ala Phe Ala Ala Met Gly Gln Glu Ala Arg

115 120 125

Lys Ala Trp Ala Ser Gly Gln Ser Tyr Ile Leu Leu Gly Tyr Leu Leu

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Leu Leu Leu Glu Ala Tyr Gly Leu Gly Ser Val Pro Met Leu Gly Phe

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Asp Pro Glu Arg Val Arg Ala Ile Leu Gly Leu Pro Ser His Ala Ala

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Ser His Arg Leu Pro Leu Glu Arg Val Val Leu Trp Arg

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<210> 4

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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115 120 125

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130 135 140

Arg Asp Gln Gly Leu Ile Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Gly Val

145 150 155 160

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290

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> agMDH

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<223> ScNoxE

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<211> 873

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<220>

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